Name: Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 배우세요 Micro-C-XL 기법을 사용한 포유류 3D 게놈 상호작용 매핑 방법을. 뉴클레오솜 해상도에서 염색질 고리와 단거리 상호작용을 정밀 분석하여 유전자 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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원고를 비판적으로 읽어준 Christl Gaubitz와 Kathleen Stewart-Morgan에게 감사드립니다. 우리 연구실 설립에 도움을 주신 Anja Groth와 Groth 연구실에 감사드립니다. CPR/reNEW Genomics Platform의 지원해 주신 H. Wollmann, M. Michaut, A. Kalvisa에게 감사드립니다. 노보 노디스크 재단 줄기세포 의학 센터(reNEW)는 노보 노디스크 재단 보조금 번호 NNF21CC0073729의 지원을 받습니다. 노보 노디스크 재단 단백질 연구 센터(CPR)는 노보 노디스크 재단 보조금 번호 NNF14CC0001의 지원을 받습니다. 코펜하겐에 위치한 노보 노디스크 줄기세포 의학 센터(Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine)의 브릭맨(Brickman) 연구실에 마우스 ES 세포에 대해 감사의 뜻을 전합니다.

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Micro-C 실험의 성공 여부는 신중하게 실행해야 하는 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 추가적인 가교결합제인 DSG 또는 EGS와의 가교결합은 세포 유형에 따라 세포의 응집을 유도할 수 있다. 가교 반응에 0.1%-0.5% BSA를 첨가하면 가교 효율에 영향을 주지 않고 응집이 크게 감소합니다. 비효율적인 교차결합은 무작위 결찰을 나타내는 trans-chromosomal 상호 작용의 비율을 증가시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서 두 번째이지만 가장 중요한 단계는 MNase를 사용한 염색질 분해입니다. 최적이 아닌 염색질 분해는 비효율적인 근접 결찰(과소화) 또는 비근접 결찰 디뉴클레오솜의 속도 증가(소화 부족)로 이어집니다. 결찰 반응의 효율은 아가로스 겔 전기영동(그림 1B)으로 평가할 수 있으며, 저투입 시퀀싱으로 가장 잘 추정할 수 있습니다. 낮은 입력 염기서열분석에서 높은 복제율(비효율적인 결찰) 또는 증가된 디뉴클레오솜 비율이 나타나는 경우 MNase 분해 정도를 재평가해야 합니다. 특히, 프로토콜을 실행할 때 샘플이 손실되면 라이브러리 복잡성이 줄어들 수 있습니다. 샘플의 농도는 DNA 정제 후(5.3단계) 또는 최소 PCR(8단계)로 평가하는 것이 가장 좋습니다. DNA 정제 후 5 x 106 포유류 세포의 총 DNA 수율은 일반적으로 >2μg입니다. DNA 농도는 MNase 분해, ExoIII 분해 및 DNA 정제 후에 제어되어야 합니다. 세포 유형 특이적 및 종 특이적 인 내인성 뉴클레아제는 DNA 분해의 원인이 될 수 있습니다. 또한 컬럼 기반 DNA 정제는 탈단백질화 반응에서 SDS와의 비호환성으로 인해 샘플 손실이 발생할 수 있습니다. 이 단계에서 DNA 농도가 낮으면 에탄올 침전을 고려할 수 있습니다.
Micro-C는 시료 특이적 MNase 적정이 필요하기 때문에 다양한 모델 유기체의 작은 장기, 배아 및 단일 세포, 오가노이드 또는 환자 생검과 같은 소세포 집단에 Micro-C를 적용하는 것은 어렵습니다. 여기에서 Hi-C 3.0은 염기서열 특이적 제한 엔도뉴클레아제 8,9에 의한 종말점 반응을 사용하여 잘 정립된 대안을 제공합니다.
Micro-C는 높은 동적 범위와 낮은 신호 대 잡음비를 가진 널리 적용 가능한 고분해능 염색체 구조 기술로, 염색체 루프와 같은 단거리 염색체 특징 4,5,8을 조사하는 데 특히 적합합니다. Micro-C의 분해능은 Hi-C의 검출 한계를 넘어서는 promoter-enhancer loop를 캡처할 수 있어 게놈 조직과 조절13,14,15 사이의 관계에 대한 보다 자세한 분석을 효율적으로 가능하게 합니다. 또한, DNA 포획 전략은 최근 Micro-C와 결합되어 표적 게놈 유전자좌의 유전자좌 특이적 분해능을 전례 없는 수준으로 증가시켜 3D 게놈16,17,18의 미세구조에 대한 새로운 통찰력을 드러냈습니다. 요약하면, Micro-C와 그 유도체는 전사 조절에서 3D 게놈의 역할을 해부하고 결과적으로 세포 유형 분화 및 유지를 위한 핵심 기술이 될 것으로 예상합니다.

Micro-C-XL은 뉴클레오솜 분해능으로 3D 게놈 형태를 측정하는 게놈 전체 기술입니다. Micro-C-XL은 널리 사용되는 근접 결찰 기반 Hi-C 기술을 기반으로 하며, 이는 3D 게놈이 구성되는 방식에 대한 우리의 이해를 변화시켰습니다1. Micro-C-XL과 그 첫 번째 반복인 Micro-C는 처음에 맥주효모균 2,3에서 개발되었으며 이후 포유류 세포 시스템에 적용되었으며, 이 프로토콜은 염색체 루프 및 절연 부위와 같은 3D 게놈의 단거리 특징을 검출하는 데 있어 완전한 잠재력을 입증했습니다. 이 버전은 최근 포유류 Micro-C-XL 간행물 4,5를 기반으로 합니다. Micro-C-XL이 Micro-C를 대체하기 때문에 Micro-C-XL은 이후 원고에서 Micro-C로 지칭됩니다.
Micro-C와 Hi-C6 의 주요 차이점은 다음과 같습니다: 1) 제한 효소와 비교하여 미세구균 뉴클레아제(MNase)를 사용한 게놈 단편화 및 2) 포름알데히드에 비해 반응성 그룹 사이에 더 큰 원자 간격을 갖는 추가 교차결합제. 두 단계 모두 기존 Hi-C에 비해 Micro-C의 향상된 신호 대 잡음비에 크게 기여합니다. 단편화 크기는 근접 결찰 프로토콜 중에 3D 게놈 조직을 분해할 수 있는 분해능을 제한합니다. MNase는 접근 가능한 DNA를 우선적으로 소화하고 뉴클레오솜 보호 DNA를 그대로 유지하는 뉴클레아제입니다. MNase 염기서열분석을 이용한 뉴클레오솜 발자국 측정은 뉴클레오솜이 대부분의 진핵생물 게놈을 완전히 덮고 있음을 보여주었다7. 뉴클레오솜은 종과 세포 유형에 따라 평균 160-220bp의 간격으로 게놈 전체에 분포되어 있기 때문에 MNase는 게놈 아키텍처의 고해상도 매핑에 이상적인 효소입니다.
Micro-C 방법에서 포름알데히드(FA)와 함께 추가 가교제를 사용하면 신호 대 잡음비 2,8이 추가로 향상됩니다. 반응성 그룹 사이에 더 긴 원자 스페이서가 있는 아민 특이적 교차결합제는 단백질-단백질 교차결합을 촉진합니다. 이들은 전형적으로 각각 7.7 Å 및 16.1 Å 스페이서를 갖는 디숙시니미딜 글루타레이트(DSG) 또는 에틸렌 글리콜 비스-숙시니미딜 숙시네이트(EGS)이다. EGS 또는 DSG를 통한 노이즈 감소는 Micro-C와 같이 단편화 비율이 높은 실험에서 특히 두드러지며, 무작위 연결 사건8의 속도 감소로 인해 발생하는 것으로 추정된다.
ESG/DSG 가교 및 제한 효소의 다중 조합을 활용하는 최근 개발된 Hi-C 3.0 프로토콜은 Hi-C 실험에서 노이즈를 줄이고 염색체 루프 및 절연 부위의 검출을 크게 향상시킵니다 8,9. 그럼에도 불구하고 다양한 상호 작용 데이터 기능을 사이트별로 비교한 결과, Micro-C는 Hi-C 3.0 및 기존 Hi-C8에 비해 염색체 루프 및 절연 부위와 같은 단거리 기능을 더 잘 감지하는 것으로 나타났습니다. 그러나 Hi-C 3.0은 기존 Hi-C에 비해 단거리 특징의 검출을 개선하고 게놈 구획화의 강력한 검출을 유지합니다. 요약하면, 염색체 형태 포획 방법의 선택은 객관적이고 생물학적인 질문에 의해 결정되어야 합니다.
여기에서는 3D 게놈 조직을 밝힐 수 있는 성공적인 Micro-C 실험을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1 mM 비오틴 dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM 비오틴 dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L 엑소뉴클레아제 III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 리가제 버퍼&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS w/o Mg2+ 및 Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0.1 mM b-메르캅토에탄올&nbsp;</td></tr><tr><td>37% 포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>252549-500ML</td><td>주의. MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligase 제조업체 보기&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Klenow Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>주의. 제조사 MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>주의. See 제조사: MSDS</td></tr>, <tr><td>Dynabeads, MyOne, Streptavidin C1</td>, <td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr>, <tr><td>DynaMag-2 Magnet</td>, <td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>: 1.5 ml 튜브용 자석</td></tr>, <tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td>, <td>Invitrogen</td><td>492025</td>: <td>PCR 튜브용 자석 자석</td></tr>, <tr><td>EDTA 초순수 0.5M pH 8.0</td>, <td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 초순수 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td><td>품질 관리 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜 숙시네이트) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin 세럼</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F7524</td><td>15% FBS</td></tr><tr><td>젤 로딩 염료 보라색 (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>글리신&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteinase inhibitor (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>주의. 제조사 MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>mouse embryonic stem cells&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>증폭 프라이머 for sequencing libraries</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>sequencing library preparation kit&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 마스터 믹스&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>주의. MSDS</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 용액</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% 펜-스트렙</td></tr><tr><td>단백질분해효소 K(40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td> 주의 사항을 참조하십시오<td>. 제조사 MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>을 DNA gel elution kit&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAgen</td><td>28106</td>은 <td>다음과 같이 참조됩니다: 상업용 DNA 정제 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>고감도 DNA 정량 기기&nbsp;</td></tr><tr><td>빠른 로드 보라색 1kb 플러스 DNA 사다리</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect 크기 선택 비즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>파라마그네틱 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td>써모믹서 C</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td>5382000015</td><td>다음과 같이 지칭됩니다: thermomixer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초순수 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>초순수 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>단편 분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micro-c-xl을 사용한 포유류 3d 게놈 상호 작용 매핑

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

3차원(3D) 염색체 조직은 게놈 조절 및 세포 유형 사양의 주요 요소입니다. 예를 들어, 인핸서(enhancer)로 알려진 시스 조절 요소는 3D 공간에서의 상호작용을 통해 원위 프로모터의 활성을 조절하는 것으로 생각됩니다. Hi-C와 같은 게놈 전체 염색체 형태 캡처(3C) 기술은 세포에서 게놈이 어떻게 구성되는지에 대한 우리의 이해를 변화시켰습니다. 3D 게놈 조직에 대한 현재의 이해는 3D 공간에서 염색체의 위상 조직을 분해할 수 있는 해상도에 의해 제한됩니다. Micro-C-XL은 염색체 형태 캡처 프로토콜 중에 미세구균 뉴클레아제(MNase)를 활용하여 게놈을 단편화함으로써 염색질의 기본 단위인 뉴클레오솜 수준에서 분해능으로 염색체 접힘을 측정합니다. 그 결과 측정에서 신호 대 잡음비가 향상되어 다른 게놈 전체 3D 기술에 비해 절연 부위 및 염색체 루프를 더 잘 감지할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포에서 고품질 Micro-C-XL 샘플을 준비하기 위한 시각적으로 지원되는 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

Micro-C 라이브러리의 성공적인 준비는 프로토콜의 여러 단계에서 평가할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 적절한 MNase 분해 정도를 선택하는 것입니다. 따라서 MNase 농도는 모든 샘플에 대해 디뉴클레오솜에 비해 70%-90% 모노뉴클레오솜을 일관되게 산출하도록 적정해야 합니다. 크로마틴 분해는 eu 크로마틴과 헤테로 크로마틴에 따라 다르며, MNase는 헤테로크로마틴을 덜 효율적으로 소화한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서, 최적의 소화도는 관심 염색질 영역과 연구된 세포 유형에 따라 달라지는데, 이는 eu- 염색질 및 헤테로-염색질의 상대적 비율이 세포 유형에 따라 다르기 때문입니다. 따라서 필요한 MNase 농도를 신중하게 적정하고 먼저 저입력 시퀀싱을 통해 Micro-C 실험의 성공을 평가하는 것이 좋습니다.
감소하는 양의 MNase로 처리된 크로마틴의 일반적인 MNase 적정 패턴은 그림 1A에 나와 있습니다. 여기에서 반응당 250,000개 세포의 크로마틴을 MNase의 4배 희석으로 분해합니다. 가장 높은 농도(MNase 10U, 레인 2)는 거의 독점적으로 모노 뉴클레오솜 DNA(~150bp)로 구성된 과소화된 염색질을 보여줍니다. 특히, 모노 뉴클레오솜 밴드의 중심은 MNase 농도가 감소된 샘플의 해당 밴드에 비해 아가로스 겔에서 더 낮게 실행되며, 이는 뉴클레오솜 DNA의 과분해를 나타냅니다. 과잉 소화된 뉴클레오솜은 근접 결찰 반응에서 비효율적으로 결찰됩니다. 따라서 레인 2의 샘플은 Micro-C 실험에 최적이 아닙니다. 레인 3(MNase 2.5U)은 Micro-C 실험에 거의 적합한 분해도를 나타냅니다. 여기서, 단핵소체 띠가 우세한 종이며, 과잉 소화된 뉴클레오솜을 나타내는 아핵소체 도말이 감소한다. 그러나 여전히 존재합니다. 레인 4의 분해도(MNase 0.635U)는 이 적정 예에서 Micro-C 실험에 이상적인 조건입니다. 하위 뉴클레오솜 DNA가 없는 투명한 단핵솜 밴드가 존재합니다. 단핵체 및 이핵체 DNA의 띠 강도는 거의 동일하며, 이는 단핵체 수율이 66% 이상임을 나타냅니다. 이핵체 DNA는 단핵체 DNA의 약 두 배 크기(~320bp 대 ~150bp)이므로 DNA 몰당 밴드 강도가 단핵소체 DNA에 비해 두 배 높다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 레인 5(MNase 0.156U)의 분해도는 뉴클레오솜 DNA가 거의 없는 소화 부족 염색질을 보여주며, 따라서 이는 차선의 샘플을 나타냅니다.
결론적으로, 이 예에서 0.625U의 MNase를 사용한 2.5 x 105 마우스 ES 세포의 분해(200μL의 1 x 106 세포에 대한 2.5U의 MNase에 해당)는 Micro-C 실험에서 분취 분해를 위한 가장 유망한 출발점을 제공합니다. 그러나 레인 3과 레인 4의 샘플에 사용된 조건(200μL의 1 x 106 셀에 대한 MNase 5U에 해당) 사이의 중간 MNase 농도도 고려해야 합니다. 중요한 것은 MNase를 사용한 크로마틴 분해는 선형적으로 스케일링할 수 없으며 분취 분해를 4배 이상 상향 스케일링하지 않는 것이 좋습니다. 1 x 10 6 세포 이상에서 Micro-C 라이브러리를 준비하려면 1 x 106 세포의 분취액에서 크로마틴을 분해하고 MNase 비활성화 후 통합하는 것이 좋습니다.
근접 결찰 프로토콜의 성공을 평가하려면 근접 결찰이 아닌 MNase 분해된 입력 대조군(단계 3.8)을 근접 결찰 샘플(단계 5.3)과 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 비교해야 합니다(그림 1B). 근접 결찰 단핵소체 밴드는 대략 300bp의 크기를 가지며 디뉴클레오솜과 유사합니다. 따라서 모노 대 디뉴클레오솜 대역 신호 비율은 주로 모노뉴클레오솜(1번 레인)에서 디뉴클레오솜(3번 레인 및 4번 레인)으로 이동해야 합니다. 이 단계에서 아가로스 겔은 절제 및 정제되는 디뉴클레오솜 DNA이므로 과부하를 피하기 위해 샘플을 여러 레인으로 분할하는 것이 좋습니다.
준비된 염기서열분석 라이브러리의 품질과 수량을 최소 PCR로 평가하는 것이 좋습니다. 여기서 1μL의 비드(전체 샘플의 1/20)의 DNA는 10μL의 PCR 반응에서 16주기 동안 증폭됩니다. 최소 PCR 라이브러리의 총 농도는 일반적으로 16회 PCR 주기 후 50-500ng 범위입니다. 이론적으로, 이는 16 사이클 동안 증폭된 경우 나머지 19 μL 샘플의 1-10 μg 라이브러리에 해당합니다. 총 DNA에서 약 100ng의 라이브러리를 생성하는 데 필요한 최소 PCR 주기 수를 사용하는 것이 좋습니다. PCR에서 로그 증폭을 가정하면 16 사이클에서 19 μL 입력에서 얻은 DNA의 이론적 농도를 연속적으로 2로 나누어 100 ng 라이브러리를 생성하는 데 필요한 PCR 사이클 수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 16 사이클 후 1 μL에서 100 ng 수율은 19 μL에서 증폭된 1,900 ng 수율에 해당합니다. 이 시나리오에서 12 사이클은 총 DNA(1,900ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118ng)에서 118ng 염기서열분석 라이브러리를 이상적으로 생성해야 합니다. 그런 다음 최소 PCR에서 나머지 9μL 샘플을 사용하여 아가로스 겔 전기영동으로 라이브러리의 품질을 평가할 수 있습니다(그림 1C). 시각화는 420bp에서 하나의 고유한 밴드를 표시하고 어댑터 이량체(120bp)에 대한 밴드는 표시하지 않아야 합니다. 더 작은 파편은 또한 나타날지도 모르고, 이들은 사용되지 않는 PCR 뇌관에 대응한다.
다음으로, 리소스 집약적인 심층 염기서열분석을 시작하기 전에 저입력 염기서열분석을 통한 성공적인 Micro-C 시료 전처리를 분석하고 확인하는 것이 좋습니다. 일반적으로 라이브러리는 5 x 106 내지 1 x 107의 판독 깊이로 염기서열 분석되고 염기서열분석 판독 중복률, 시스염색체 대 트랜스염색체 상호작용 비율, 염기서열분석 판독 방향 빈도 기준에 따라 평가됩니다. Micro-C 라이브러리는 cooler, pairtools 및 cooltools10,11,12를 사용하여 읽기 파일(Fastq 형식)에서 읽기 쌍 파일(Bedpe 형식) 및 확장 가능한 상호 작용 매트릭스(Cool 및 Mcool 형식)에 이르는 시퀀싱에서 데이터를 처리하는 풀 서비스 파이프라인인 Distiller로 처리됩니다. 파이프라인은 또한 Micro-C 라이브러리(10)(https://github.com/open2c/distiller-nf)의 품질을 평가하는데 이상적인 요약 파일을 생성한다. PCR 복제율은 염기서열분석 라이브러리 복잡도에 대한 정보를 제공하며 생성된 *.stats 파일에서 추출할 수 있습니다. 고품질 Micro-C 라이브러리는 500만 개 이상의 세포에서 생성될 때 PCR 복제율이 5%-10% 미만입니다. 특히, 일부 염기서열분석 플랫폼은 염기서열분석 라이브러리 복잡성과 무관하게 클러스터 형성 중에 PCR 중복을 생성합니다. 그림 2A는 두 실험의 상대적 중복률을 보여줍니다: 하나는 좋은 샘플로 간주되고 다른 하나는 나쁜 샘플로 간주됩니다. 이 예에서는 두 샘플 모두 허용 가능한 맵 속도를 표시했습니다. Micro-C 라이브러리의 품질을 평가하는 다음 기준은 시스 대 트랜스 비율 및 읽기 방향 주파수입니다. 핵 내에서 염색체는 개별 염색체 영역에 서식하므로 다른 염색체와 거의 상호 작용하지 않습니다. 검출된 경염색체 상호작용의 높은 비율은 무작위 결찰의 높은 비율을 나타냅니다. 이 수준의 분석에서 불량 샘플은 양호한 샘플에 비해 높은 비율의 trans-chromosomal 상호 작용을 보였다는 점에 유의해야 합니다(그림 2B). Micro-C의 경우 70% 이상의 시스-염색체 상호작용 비율이 바람직합니다.
Micro-C 라이브러리는 디뉴클레오솜 DNA 밴드와 유사한 단편 크기를 가지고 있으며, 근접 결찰 샘플과 함께 정제되어 실험을 오염시킬 수 있습니다. 이러한 오염 물질은 항상 시스-염색체 상호 작용입니다. 따라서 읽기 방향 비율도 평가하는 것이 중요합니다. 디뉴클레오솜 오염 속도는 저입력 염기서열분석(low-input sequencing)으로 추정할 수 있습니다. 디뉴클레오솜 DNA는 MNase에 의해 절단되지 않은 두 개의 인접한 뉴클레오솜에서 비롯됩니다. 따라서 결과 시퀀싱 판독은 항상 정방향-역방향 판독 방향(F 및 R)을 표시하며 판독 쌍 사이의 거리는 약 320bp입니다. 이에 비해 근접 연결 단편은 4가지 방향으로 결찰할 수 있으며, F-R, R-R, R-F 및 F-F와 함께 판독 쌍을 생성할 수 있으며, 이상적으로는 동일한 함량을 제공합니다(그림 2C). 또한 두 판독 쌍 사이의 다양한 거리를 표시합니다. 디뉴클레오솜 오염물의 양을 추정하기 위해 증류기에서 생성된 *stats 파일에서 판독 방향의 빈도를 계산할 수 있습니다(그림 2D). 특히, 이 연구에서 F-R 판독의 비율(빨간색)은 양호한 샘플에 비해 불량 샘플에서 더 높았으며, 이는 판독 방향이 거리에 따라 계층화되었을 때 더욱 분명해졌습니다(그림 2E). F-R 분획은 판독 쌍이 &lt;562 bp 또는 ≥562 bp 거리의 판독으로 계층화될 때 Micro-C 라이브러리와 비교하여 di-nucleosomal 단편에 의해 지배됩니다. 여기서, 거리가 &lt;562 bp인 판독의 분율은 F-R 판독에 의해 지배되는 반면, 거리가 ≥562 bp인 분율은 4개의 가능한 방향 사이에 균일한 분포를 나타내며, 이는 F-R 판독의 전체 과잉 표현이 이뉴클레오솜 오염 물질에서 비롯됨을 나타냅니다. 하위 집합에 대한 임계값으로 562bp를 선택하는 것은 생성된 *stats 파일의 범주화에 의해 정의됩니다. 이 품질 관리에 반드시 필요한 것은 아니지만, 증류기에 의해 생성되는 *pairs 파일에서 거리를 추출하여 보다 정의된 하위 집합을 달성할 수 있습니다. 디뉴클레오솜 판독은 데이터 처리 중에 식별되고 무시될 수 있으므로 Micro-C 샘플의 품질을 저하시키지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 3D 상호 작용에 대한 중요한 정보가 포함되어 있지 않으며 정보 읽기를 희석시킵니다.
따라서 신중한 MNase 적정과 저입력 염기서열분석을 통한 철저한 품질 관리는 Micro-C 실험의 품질을 최적화하는 최고의 도구입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> 그림 1: Micro-C 프로토콜의 중간 단계 . (A) 다양한 MNase 농도로 분해된 2.5 x 105 개의 마우스 ES 세포에서 크로마틴의 아가로스 겔 전기영동. mono-, di- 및 tri-nucleosomal 밴드는 화살표로 표시됩니다. M: DNA 사다리(레인 1/6); 250,000개 셀당 10U의 MNase(레인 2); 250,000개 셀당 2.5U의 MNase(레인 3); 250,000개 셀당 0.625U의 MNase(레인 4); 250,000개 셀당 0.156U의 MNase(레인 2). (B) Micro-C 준비된 샘플(레인 3 및 레인 4) 및 MNase 분해 입력 컨트롤(레인 1)의 1.0% 아가로스 겔 전기영동. 레인 1 및 레인 2(M: DNA ladder)는 모노뉴클레오솜 및 디뉴클레오솜 단편 강도의 상대적 변화를 강조하기 위해 강화되었습니다. 단핵체 및 이핵체 띠는 화살표로 표시됩니다. 근접 결찰 샘플의 디뉴클레오솜 밴드는 디뉴클레오솜과 Micro-C 라이브러리 DNA를 결합합니다. (C) Micro-C 염기서열분석 라이브러리의 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 1μL 샘플에서 증폭하여 품질을 평가했습니다. 레인 1 (M): DNA 사다리; 레인 2 (S): Mirco-C 라이브러리. (D) 최종 Micro-C 라이브러리의 단편 분석기 추적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> 그림 2: 양호한 시료와 불량 시료의 저입력 시퀀싱에 대한 시료 통계량 . (A) 매핑된 비율(녹색)과 매핑되지 않은 읽기(빨간색)의 막대 그래프입니다. (B) cis 및 trans-chromosomal 상호 작용을 매핑하는 읽기의 정규화된 분율. 데이터 세트는 cis-mapping 읽기로 정규화되었습니다. 시스 매핑 판독은 쌍을 이루는 말단 서열 샘플의 첫 번째 판독과 두 번째 판독 사이의 거리(≤1kbp(노란색), &gt;1kbp 및 ≤10kbp(주황색) 및 &gt;10kbp(빨간색)로 계층화되었습니다. (C) 디뉴클레오솜 크기를 갖는 잠재적 분자 종의 개략도. (D) 양호한 샘플과 불량 샘플의 모든 판독에 대한 판독 쌍 방향의 백분율. (E) 패널 (D)와 동일하지만 거리로 계층화됩니다(왼쪽, &lt;562bp 및 오른쪽, ≥562bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>1배</td>
			<td>4.4배</td>
		</tr><tr><td>NEBuffer 2.1 10개,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8.8 μL</td>
		</tr><tr><td>100 mM DTT</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 마이크로리터</td>
			<td>299.2 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>합계</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 마이크로리터</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Micro-C 마스터 믹스 1. 최종 씹는 반응을 위한 마스터 믹스의 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>1배</td>
			<td>4.4배</td>
		</tr><tr><td>1mM 비오틴-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1mM 비오틴-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>dTTP와 dGTP의 10mM 혼합</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4.4 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>10x T4 DNA 리가아제 완충액</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>BSA 200배</td>
			<td>0.25 마이크로리터</td>
			<td>1.1 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23.75 마이크로리터</td>
			<td>104.5 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: Micro-C 마스터 믹스 2. 최종 라벨링 반응을 위한 마스터 믹스의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>1배</td>
			<td>4.4배</td>
		</tr><tr><td>10x NEB T4 리가아제 반응 완충액</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 마이크로리터</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL의</td>
		</tr></tbody></table>표 3: Micro-C 마스터 믹스 3. 근접 결찰 반응을 위한 마스터 믹스의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>1배</td>
			<td>4.4배</td>
		</tr><tr><td>NEBuffer 1.1 10개</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>ExoIII 뉴클레아제</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 4: Micro-C 마스터 믹스 4. 비오틴 제거 반응을 위한 마스터 믹스의 조성물.

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

이 프로토콜은 고분해능 염색체 루프 및 기타 단거리 상호 작용 기능을 보여주기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 신호 대 잡음비로 뉴클레오솜 분해능을 사용하여 3D 게놈 조직을 매핑하는 것입니다. MNase 적정을 수행하려면, 1 x 10의 펠릿 1을 얼음 위에서 10분 동안 6번째 세포로 해동하고, 세포를 500 마이크로리터의 DPBS에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 얼음 위에서 20분 동안 배양한다.10, 실온에 5 분 동안 000 G에 원심분리기에 의하여 세포를 모으고 상층액을 제거하십시오. 펠릿화된 세포를 500마이크로리터의 MB 넘버 원 완충액에 재현탁시킵니다. 마이크로리터 MNase당 20단위의 바이알 1개를 해동하고 본문에 설명된 대로 소화 조건을 위해 10밀리몰 트리스로 희석합니다.10-20초의 적절한 시간 간격으로 첫 번째 MNase 분해 용액 1마이크로리터를 4개의 샘플의 튜브 중 하나에 넣고 와류한 다음 섭씨 37도의 ThermoMixer에서 800RPM으로 10분 동안 배양합니다. 나머지 MNase 희석액에서 1마이크로리터를 다른 세포 부분 표본에 계속 추가합니다. 200 마이크로리터의 갓 준비된 정지 완충액을 MNase가 첨가된 동일한 순서와 동일한 시간 간격으로 각 튜브에 첨가하여 MNase 분해를 중지합니다.섭씨 65도에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 500마이크로리터의 PCI를 추가하고 볼텍싱으로 완전히 혼합합니다. 19, 800 G에서 상(異)을 분리하기 위해 실온에서 5분 동안 원심분리기.그리고 수성 상을 새 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하고 12마이크로리터의 용출 버퍼에서 샘플을 용리합니다. 정제된 DNA 샘플에 2-5 마이크로리터의 로딩 염료를 첨가합니다.1.5% 아가로스 겔에서 샘플을 실행하고 실험에 가장 적합한 분해 정도를 선택합니다. 최적의 소화도는 핵하 분절이 거의 또는 전혀 나타나지 않으며, 70 내지 90%모노 대 디뉴클레오솜 비율을 나타낸다. 이 대표 샘플에서는 후속 실험을 위해 3번 레인과 4번 레인 사이의 중간 소화도가 선택되었습니다.MNase 적정에 따라 각 샘플 부분 표본에 적절한 양의 MNase를 첨가하여 크로마틴을 분해합니다. 잘 섞고 섭씨 37도, 800RPM의 ThermoMixer에서 10분 동안 배양합니다. 각 부분 표본에 1.6 마이크로 리터의 0.5 몰 EGTA를 첨가하여 MNase 분해를 중지하고 섭씨 65도의 ThermoMixer에서 800 RPM으로 10 분 동안 배양합니다.10, 실온에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 표본을 모으고, 상층액을 폐기하십시오. 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 1X NEB 완충액 2.1에 재현탁시킵니다. 추가 처리를 위해 5 곱하기 10의 입력에 해당하는 샘플을 6번째 셀에 풀링합니다.근접 결찰을 진행하기 전에 샘플의 10%를 입력 대조군으로 전송하여 MNase 분해 수준을 모니터링합니다. 150 마이크로 리터의 10 밀리 몰 트리스, 25 마이크로 리터의 10 % SDS, 25 마이크로 리터의 20 밀리리터 단백질 분해 효소 K를 소화 조절에 첨가하고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 10, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 잔여 표본을 모으고 상층액을 폐기하십시오.펠릿을 90 마이크로 리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 1에 재현탁시키고 섭씨 37도, 800 RPM의 ThermoMixer에서 15 분 동안 배양합니다. 마이크로리터 Klenow 단편당 5단위의 10마이크로리터를 추가하고 ThermoMixer에서 배양합니다. 그런 다음 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 2개 100마이크로리터를 추가합니다.섭씨 25도, 800RPM에서 45분 동안 배양하고 본문에 설명된 대로 EDTA로 효소 반응을 소멸시킵니다. 섭씨 65도, 800RPM에서 20분 동안 열 믹서에서 배양합니다. 10, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G에 원심분리에 의하여 표본을 모으고, 상층액을 폐기하십시오.샘플을 500 마이크로리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 3에 재현탁시키고 15-20 RPM의 실온에서 2.5시간 동안 배양합니다. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 200 마이크로리터의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 4에 샘플을 재현탁시키고 섭씨 37도로 설정된 ThermoMixer에서 800RPM에서 15분 동안 배양합니다.역 가교 및 탈단백질화를 위해 25 마이크로리터의 마이크로리터당 20 밀리그램의 proteinase K와 25 마이크로리터의 10%SDS를 샘플에 첨가하고 간헐적 혼합으로 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 500 마이크로리터의 PCI를 샘플과 입력 컨트롤에 추가한 다음 소용돌이로 혼합합니다. 19, 800G에서 5분 동안 원심분리하여 상을 분리하고, 상부 수성상을 새 튜브로 옮긴다.DNA를 농축하고 샘플을 30마이크로리터로 용리하고 입력 대조군은 15마이크로리터로 용리합니다. 1.5% 아가로스 겔을 실행하여 단핵구체와 디뉴클레오솜을 분리합니다. 디뉴클레오솜 크기의 DNA 단편을 절제하고 본문에 설명된 대로 DNA를 추출합니다.150 마이크로리터의 사전 준비된 비드를 150 마이크로리터의 샘플에 첨가하고 실온에서 배양합니다. 튜브를 적절한 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다. 상층액을 제거하고 비드를 300마이크로리터의 1X TBW에 재현탁하고 이 단계를 반복합니다.자기 분리를 반복하고 용액이 제거된 후 상층액을 제거하고 비드를 100마이크로리터의 0.1X TE에 재현탁시킵니다. 50 마이크로리터의 0.1X TE에서 반복하고 재현탁합니다. 용액을 PCR 튜브로 옮기고 텍스트에 설명된 대로 DNA 조작을 수행합니다. 어댑터 결찰이 완료된 후 샘플을 1X TBW로 세척하고 상층액을 버리고 비드를 20마이크로리터의 0.1X TE에 재현탁시킵니다. PCR 주기의 수를 낙관하고 원본에서 기술된 대로 순서 도서관을 증폭하십시오. 250에서 Chromatin, 반응 당 000의 세포는 MNase의 4배 희석으로 소화되었다.가장 높은 농도인 10단위는 거의 독점적으로 단핵체 DNA로 구성된 과소화된 염색질을 보여주었습니다. 250의 MNase의 0.625 단위를 가진 000의 쥐 ES 세포의 소화는 Micro-C 실험에 있는 준비적인 소화를 위한 가장 유망한 출발점을 제안했다. 그러나, 100만 세포당 5단위에 해당하는 레인 3과 4에 표시된 조건 사이의 중간 MNase 농도를 고려해야 합니다.근접 결찰된 모노뉴클레오솜 밴드는 디뉴클레오솜과 유사한 300 염기쌍의 대략적인 크기를 가졌다. 따라서 모노 대 디뉴클레오솜 밴드 신호 비율은 주로 모노뉴클레오솜에서 디뉴클레오솜으로 이동했습니다. 준비된 염기서열분석 라이브러리의 품질 및 수량은 최소 PCR을 통해 평가하였다.시각화 결과 420개의 염기쌍에서 하나의 뚜렷한 밴드가 나타났으며, 어댑터 이량체에 대한 밴드는 없었습니다. 이 연구의 두 샘플 모두 높은 맵 비율을 보였지만 좋은 샘플은 시스 판독 비율이 더 높았습니다. transchromosomal 상호 작용의 높은 비율은 무작위 결찰 사건을 나타내지만 일부 transchromosomal 상호 작용이 중요할 수 있습니다.또한 양호한 샘플은 500 염기쌍 미만의 거리에서 적당한 비율의 정방향-역방향 매핑 읽기 쌍을 가졌습니다. 이는 2개의 근접 결찰된 뉴클레오솜과 유사한 크기를 갖는 MNase에 의해 절단되지 않은 디뉴클레오솜의 낮은 비율을 나타냈다. 적절한 MNase 분해도는 이 실험에 매우 중요합니다.과소화된 뉴클레오솜은 비효율적으로 연결되며, 소화 부족 염색질은 염기서열분석 라이브러리를 오염시킬 수 있는 소화되지 않은 디뉴클레오솜의 상당 부분을 가지고 있습니다. Micro-C는 매우 높은 해상도로 유전자좌 특이적 게놈 조직을 매핑하기 위한 캡처 접근 방식과 결합할 수 있습니다.

mapping-mammalian-3d-genome-interactions-with-micro-c-xl

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

3D 다색 DNA FISH는 3D 보존 핵 내에서 다중 게놈 궤시를 시각화하는 도구를 나타내며, 단일 세포 수준에서 핵 공간 내에서 상호 상호 작용 및 국소화를 명확하게 정의합니다. 여기서, 단계별 프로토콜은 인간 1차 세포의 광범위한 스펙트럼에 대해 기재된다.

인간의 1 차 세포에서 핵 아키텍처를 연구하는 3D 다색 DNA FISH 도구

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

배우세요 Micro-C-XL 기법을 사용한 포유류 3D 게놈 상호작용 매핑 방법을. 뉴클레오솜 해상도에서 염색질 고리와 단거리 상호작용을 정밀 분석하여 유전자 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

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