Name: S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 S. cerevisiae에서 타임랩스 현미경과 단백질 단계별 핵 고갈을 이용한 감수 분열 연구 방법입니다. 이 기법은 특정 단백질의 시간적 기능을 밝혀 염색체 분리 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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인디애나 대학교의 광학 현미경 이미징 센터에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (GM105755)의 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜은 세포를 동기화하는 NDT80-in 시스템, 핵에서 단백질을 고갈시키는 앵커 어웨이 기술, 감수 분열 동안 신진 효모 세포를 이미지화하는 형광 타임 랩스 현미경을 결합합니다. NDT80-in 시스템은 전상 I 정지 및 방출 4,8을 이용하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 방법입니다. 개별 세포는 각각의 후속 감수 분열 단계에서 소요되는 시간이 약간 다르지만 대부분의 세포는 감수 분열 전반에 걸쳐 높은 수준의 동기화를 유지합니다.
앵커 어웨이 기술은 유사분열 및 감수 분열 연구에 적응할 수 있는 도구입니다. 라파마이신의 앵커 떨어져 표적 단백질 및 시간을 추가로 변경함으로써, 이 방법은 출아성 효모 감수 분열의 임의의 단계 동안 다양한 단백질을 연구하는데 적응될 수 있다. 신진 효모 유사 분열을 연구하기 위해 조건부 돌연변이를 만드...

타임랩스 형광 현미경은 신진 효모 1,2에서 감수 분열 염색체 분리의 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 신진 효모 세포는 주요 영양소의 기아를 통해 감수 분열을 겪도록 유도 될 수 있습니다3. 감수 분열 동안 세포는 한 번의 염색체 분리 후 두 번의 분열을 거쳐 포자로 포장되는 4 개의 감수 분열 생성물을 만듭니다 (그림 1). 감수 분열의 각 단계에서 개별 세포를 시각화 할 수 있으며, 이는 고정 세포 이미징으로 쉽게 놓칠 수있는 공간 및 시간 데이터를 생성합니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 형광 현미경을 이전에 확립된 두 가지 방법인 유도성 NDT80 시스템(NDT80-in) 및 앵커 어웨이 기법과 결합하여 별개의 감수 분열 단계에서 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 보여줍니다.
NDT80-in 시스템은 중간 감수 분열 전사 인자 NDT80 4,5의 유도 가능한 발현에 의존하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 강력한 도구입니다. NDT80 발현은 prophase I 출구 6,7에 필요합니다. NDT80-in 시스템에서 NDT80은 에스트로겐 수용체(Gal1-ER)4에 융합된 Gal4 전사 인자를 발현하는 세포에서 GAL1-10 프로모터의 제어 하에 있습니다.4,5. Gal4-ER은 β- 에스트라 디올에 결합 할 때만 핵으로 들어가기 때문에 NDT80-in 세포는 β- 에스트라 디올이없는 상태에서 전상 I에서 정지하여 전상 I에서 세포의 동기화를 허용합니다 (그림 1). β- 에스트라 디올 첨가는 Gal4-ER 전사 인자의 핵으로의 전좌를 촉진하여 GAL1-10에 결합하여 NDT80의 발현을 유도하여 감수 분열로의 동시 진입을 유도합니다. 타임 랩스 현미경 검사는 동기화없이 수행 할 수 있지만 동기화를 사용하면 세포가 감수 분열의 특정 단계에있는 동안 억제제 또는 약물을 추가 할 수 있다는 장점이 있습니다.
앵커 어웨이 기술은 라파마이신8의 첨가로 단백질이 핵으로부터 고갈될 수 있는 유도성 시스템이다. 이 기술은 효모 세포가 핵 외피가 분해되지 않는 폐쇄 유사 분열 및 감수 분열을 겪기 때문에 신진 효모의 세포 분열 동안 핵 단백질을 연구하는 데 이상적입니다. 또한,이 기술은 감수 분열 전반에 걸쳐 여러 기능을 가진 단백질에 매우 유용합니다. 결실, 돌연변이 대립 유전자 또는 감수 분열 널 대립 유전자와 달리 특정 단계에서 핵에서 표적 단백질을 제거해도 초기 단계에서 표적 단백질 활성이 손상되지 않아 결과를보다 정확하게 해석 할 수 있습니다. 앵커 어웨이 시스템은 리보솜 성숙8시 발생하는 핵과 세포질 사이의 리보솜 서브 유닛의 왕복을 이용합니다. 핵으로부터 표적 단백질을 고갈시키기 위해, 표적 단백질은 리보솜 서브유닛 Rpl13A가 FKBP12로 태그된 균주에서 FKBP12-라파마이신-결합 도메인 (FRB)으로 태그된다. 라파마이신이 없으면 FRB와 FKBP12는 상호 작용하지 않으며 FRB 태그가 부착 된 단백질은 핵에 남아 있습니다. 라파마이신 첨가시, 라파마이신은 FKBP12 및 FRB와 안정한 복합체를 형성하고, 복합체는 Rpl13A와의 상호작용으로 인해 핵 밖으로 셔틀된다(도 1). 라파마이신 첨가시 세포 사멸을 방지하기 위해, 세포는 TOR1 유전자의 tor1-1 돌연변이를 보유한다. 또한, 이들 세포는 S. 세레비시아에 FKBP12 단백질의 널 대립유전자인 fpr1Δ를 함유하여, 내인성 Fpr1이 FRB 및 라파마이신 결합에 대해 Rpl13A-FKBP12와 경쟁하는 것을 방지한다. 앵커 어웨이 배경 돌연변이 tor1-1 및 fpr1Δ는 감수 분열 타이밍 또는 염색체 분리2에 영향을 미치지 않습니다.
이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 전반에 걸쳐 상이한 시점에서 고갈되었다. Ctf19는 유사 분열에 필수적이지만 감수 분열 9,10,11,12,13에서 적절한 염색체 분리에 필요한 키네토 코어의 구성 요소입니다. 감수 분열에서 키네 토코 레는 프로 페이즈 I에서 흘려지고 Ctf19는 키네 토코 레 재 조립에 중요합니다 9,14. 이 프로토콜의 경우, NDT80-in 시스템과 세포를 동기화하고, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 전구 단계 I에서 방출되기 전후와 감수 분열 I 염색체 분리 후에 핵에서 표적 단백질 Ctf19를 고갈시켰다 (그림 1). 이 프로토콜은 감수 분열 및 유사 분열의 모든 단계에서 관심있는 다른 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>95% EtOH</td></tr><tr><td>0.22 uM 스레드 보틀탑 필터</td>로 <td>1mM 재고 만들기 Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td> ConA 24 mm x 50 mm 커버슬립 No. 1.5 VWR<td>의 용매로 사용하기 위해 1:10 희석</td></tr><tr><td></td><td> 북미</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm 현미경 슬라이드</td><td>VWR 북미</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 헤미설페이트 염</td><td>Millipore</td><td>Sigma A9126</td><td>SC, SCA 및 1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Make as 1mg/mL in 1X PBS</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2 CCD camera</td><td>섹션 4.3</td>D-glucose <td></td> Fisher Scientific D16-10 Difco 효모 질소 염기 w/o 아미노산 BD 291920 Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore Sigma D5879 Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope Nikon에서 사용되는 광도측정 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 섹션 4.4 Fiji NIH <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE 개인용 DeltaVision 현미경</td><td>적용 정밀도</td><td></td>에서 <td>다운로드 섹션 4.3</td></tr><tr><td>L-Tryptophan&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>SC, SCA 및 1% Kac</td></tr><tr><td>모델링 클레</td>이 <td>크레욜라</td>를 보충하기 위해<td>&nbsp; 2302880000</td><td>커버 슬립을 슬라이드 홀더에 고정하려면</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td>섹션 4.4에서 사용</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>섹션 4.4에서 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 팁 홀더</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>이 제품의 랙 부분의 4 제곱 x 4 스퀘어 섹션을 자릅니다.</td></tr><tr><td>Pottassium 아세테이</td>트 <td>피셔 사이언티픽</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>라파마이신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP29631</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>실리콘 실란트</td><td>Aqueon</td><td>100165001</td><td>수족관 접착제로도 알려져 있습니다.</td></tr><tr><td>소프트웍스7.0.0&nbsp; 섹션</td><td>4.3</td>Kaiser(Synthetic Complete Mixture)에 사용된 <td>이미징 소프트웨어 응용 정밀도</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>타입 N 이멀젼 오일&nbsp;</td><td>니콘</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

s. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

타임랩스 형광 현미경은 고정된 세포를 이미징하는 방법으로는 종종 볼 수 없는 시간적 및 공간적 데이터를 제공함으로써 감수 분열 세포 주기 이벤트에 대한 이해에 혁명을 일으켰습니다. 신진 효모는 많은 감수 분열 유전자가 고도로 보존되어 있기 때문에 감수 분열 염색체 분리를 연구하는 중요한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 신진 효모에서 감수 분열의 타임 랩스 현미경 검사를 통해 다양한 감수 분열 돌연변이를 모니터링하여 돌연변이가 감수 분열 과정을 어떻게 방해하는지 보여줄 수 있습니다. 그러나 많은 단백질이 감수 분열의 여러 지점에서 기능합니다. 따라서 기능 상실 또는 감수 분열 null 돌연변이의 사용은 초기 과정을 방해하여 이후 과정을 차단하거나 방해하고 각 개별 역할과 관련된 표현형을 결정하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 이 프로토콜은 감수 분열의 특정 단계에서 단백질이 핵에서 조건부로 고갈되는 동시에 타임랩스 현미경을 사용하여 감수 분열 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 세포가 I 단계에서 동기화되는 방법, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 특정 감수 분열 단계에서 핵에서 단백질을 고갈시키는 방법, 감수 분열 염색체 분리를 모니터링하기 위해 타임 랩스 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 유용성의 예로서, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 동안 다른 시점에서 핵으로부터 고갈되었고, 감수 분열 II의 말기에 염색질 질량의 수를 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 감수 분열을 모니터링하면서 핵에서 다른 핵 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.

염색질 분리를 모니터링하기 위해, 히스톤 단백질 Htb2에 mCherry로 태그를 지정하였다. 전립선 I 단계에서 염색질은 단일 Htb2 덩어리로 나타납니다. 상동 염색체가 첫 번째 감수 분열에서 분리 된 후, 염색질은 두 개의 별개의 덩어리로 나타납니다 (그림 3A). 자매 염색분체가 분리된 후 염색질은 4개의 덩어리로 나타납니다. 일부 염색체가 스핀들 미세 소관에 부착되지 않으면 감수 분열 I 또는 감수 분열 II 후에 추가 덩어리가 보일 수 있습니다.
위에서 설명한 방법은 신진 효모 감수 분열에서 적절한 염색체 분리를 보장하는 키네토코어 성분 Ctf19의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. FRB로 태그된 Ctf19를 발현하는 앵커 떨어져 효모 균주를 NDT80-in 시스템을 사용하여 프로페이즈 I에서 동기화하였다 (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; ...

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

prophase 1에서 세포를 동기화 한 다음 특정 단계에서 표적 단백질을 고갈시킴으로써이 방법은 특정 단백질의 일시적으로 구별되는 기능을 식별 할 수 있습니다. 근증의 특정 단계에서 조건부로 고갈되는 단백질은 전통적인 근염 돌연변이가 후기 단계에서 가질 수 있는 잔류 효과를 방지합니다. 이 방법은 신진 효모 유사 분열 및 핵 외피 파괴를 겪지 않는 다른 유기체를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.또한이 방법은 핵 외피 파괴 전에 세포주기 이벤트를 연구하기 위해 다른 유기체에서 사용할 수 있습니다. 시작하려면 이미징을위한 세포의 단층을 만드는 데 사용할 한천 패드를 만드십시오. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 캡과 바닥 1/3을 잘라내어 폐기하여 한천 패드의 금형 역할을 할 실린더를 만듭니다.절단된 미세 원심분리기 튜브 실린더를 튜브 상단을 거꾸로 하여 슬라이드에 놓은 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다. 50밀리리터 비커에 5%한천 용액 6밀리리터를 만듭니다. 피펫의 끝을 잘라 더 큰 구멍을 만들고 약 500 마이크로 리터의 용융 한천을 마이크로 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다.한천이 굳을 때까지 실온에 두십시오. 효모 세포를 준비하려면 1밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 2분 동안 800G에서 200마이크로리터의 포자 형성 배양물을 스핀다운합니다. 180 마이크로 리터의 상청액을 버립니다.튜브를 소용돌이 치고 튕겨서 나머지 상청액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 농축된 세포를 6 마이크로리터의 커버 슬립 상에 피펫팅하여 ConA와 함께 그 자리에서 챔버의 중앙에서 미끄러진다. 한천 패드로 실린더를 잡고 유리 슬라이드에서 조심스럽게 밀어냅니다.한천이 바닥에서 완전히 평평한지 확인하고 피펫 팁의 바닥을 사용하여 한천 패드가 튜브 경계보다 약간 위로 밀려 나오도록 미세 원심 분리기 몰드에 약간의 압력을 가합니다. 다음으로, 한천 패드가 챔버를 향하도록 금형을 뒤집습니다. 집게를 사용하여 한천 패드를 세포 위에 부드럽게 놓고 피펫 팁을 사용하여 한천 패드를 챔버 주위로 10-20 회 부드럽게 밀어 커버 슬립에 세포 단층을 만듭니다.한천 패드를 챔버에 12-15 분 동안 유지하십시오. 다음으로, 2 밀리리터의 포자 형성 배양 물을 2 개의 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 15, 700 G에서 2 분 동안 회전시킨다. 상청액을 깨끗한 미세 원심 분리 튜브로 옮긴 후 동일한 조건에서 다시 회전하고 상청액을 수집하여 미세 원심 분리 튜브를 청소합니다.2 밀리리터의 상청액을 한천 패드를 포함하는 챔버에 적가한다. 액체가 챔버의 상단에 도달하면 한천 패드가 떠 있을 가능성이 큽니다. 한천 패드를 집게로 부드럽게 제거하고 버립니다.이미징 중 증발을 방지하기 위해 챔버 상단에 24 x 50mm 커버 슬립을 놓습니다. 현미경에서 동영상을 설정하려면 슬라이드 홀더 안에 커버 슬립을 맞춥니다. 성형 점토를 커버 슬립 측면에 부착하여 슬라이드 홀더에 단단히 고정하십시오.이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 거칠고 미세한 조정 손잡이를 사용하여 DIC 또는 명시야를 사용하여 셀의 초점을 맞춥니다. 이미지 수집 소프트웨어의 메인 메뉴에서 파일을 클릭하고 획득을 선택하면 4개의 창이 나타납니다.Resolve 3D라는 창에서 삼각 플라스크 아이콘을 클릭합니다. 그러면 타임랩스 동영상을 설정하기 위한 실험을 설정하기 위한 컨트롤이 포함된 디자인 실행 실험이라는 창이 열립니다. 디자인 탭에서 단면화라는 레이블이 지정된 탭으로 이동합니다.Z 단면 옆에 있는 상자를 선택하고 광학 단면 간격을 1마이크로미터로, 광학 단면 수를 5로 설정합니다. 그런 다음 채널 탭에서 더하기 아이콘을 클릭하고 적절한 채널을 선택합니다. 그런 다음 참조 이미지 옆의 상자를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 Z 위치를 샘플 중간으로 설정합니다.드롭다운 메뉴에서 투과율 및 노출 시간 값을 선택합니다. 타임랩스 탭에서 타임랩스 옆의 상자를 선택하고 분 및 시간 값을 입력하여 이미지 획득 시간 간격을 식별합니다. 궁극의 초점으로 초점 유지 옆에 있는 상자를 선택하여 동영상 중에 스테이지 드리프트를 방지합니다.그리고 포인트 탭에서 방문 포인트 리스트 옆에 있는 상자를 선택합니다. 메인 메뉴에서 보기를 클릭하고 포인트 리스트를 선택합니다. 스테이지를 셀의 단층을 보여주는 챔버 영역으로 이동합니다.점 리스트 창에서 점 표시를 클릭합니다. 스테이지를 이동하여 겹치지 않고 25-30 개의 포인트를 선택하여 각 시간 코스 동안 셀과 각 필드를 이미지화하지 않도록하십시오. 점 리스트 창에서 모두 보정을 선택하여 각 점에 대한 최종 초점을 설정합니다.실행 탭에서 파일을 컴퓨터의 적절한 대상에 저장합니다. 실험 실행 창에서 재생 단추를 선택하여 동영상을 시작합니다. 피지 소프트웨어를 엽니다.DIC 및 m체리 채널을 엽니다. 이미지를 클릭한 다음 스택 및 Z 프로젝트를 클릭하여 mCherry 채널의 단일 최대 강도 투영을 얻고 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다. DIC 및 mCherry 채널을 하나의 이미지로 병합하려면 이미지, 색상을 클릭하고 채널 병합을 선택합니다.감수 분열을 통해 단일 세포를 따르십시오. 감수 분열 II 완료 후, DNA 질량의 수를 기록한다. 닻이 떨어져 있는 배경이 있는 야생형 세포에서는 감수 분열 II의 끝에 일반적으로 감수 분열의 4가지 생성물을 나타내는 4개의 DNA 덩어리가 있습니다.세포의 작은 부분에서, 감수 분열 II 후에 단지 3 개의 질량이 보인다.Ctf19-FRB가 prophase I의 방출 시점에 멀리 고정되면, 약 47 %감수 분열의 완료시 세포의 4 개 이상의 DNA 덩어리를 나타내며, 이는 키네 토코 레스와 미세 소관의 부착에 결함이 있음을 시사한다. 키네토코어 조립 후 감수 분열 I 이전 또는 감수 분열 II 후에 Ctf19-FRB를 고정하면 약 16%의 세포가 추가 DNA 덩어리를 나타냅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분 중 하나는 단층이 파괴되지 않도록 상청액을 챔버에 적가하는 것입니다.또한 분석에서 이미징을 고려하기 위해 이미징을 준비하는 데 필요한 시간을 기록해 둡니다. 형광으로 채워진 단백질을 변경함으로써이 절차는 세포주기 기간, 염색체 분리, 단백질 풍부도 및 단백질 국소화에 관한 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

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생물학

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