Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 주요 지방형성 전사 인자, 성숙한 지방세포 마커를 발현하고 성숙한 갈색 지방세포의 열발생 전위 및 형태학적 표현형을 갖는 갈색 지방세포의 효율적이고 재현성 있는 분화를 가능하게 합니다. 이것은 신생아 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직에서 성숙한 갈색 지방 세포의 특성을 가진 세포를 얻기 위한 간단하고 복제 가능한 2상 분화 절차입니다. 이 프로토콜은 비만 치료를 위한 표적으로 갈색 지방 조직의 활성화 메커니즘을 연구할 수 있도록 합니다.

그것은 지방이영양증의 병태생리학에 관련된 메커니즘을 결정하기 위한 모델이었습니다. 이 기술을 처음 수행하는 것은 어려울 것으로 예상됩니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 상세한 프로토콜을 갖고 중요한 점을 강조하는 것이 중요합니다.

먼저 안락사된 쥐를 엎드린 자세로 놓고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 등 중간 부분을 1cm 길이의 피부를 절개합니다. 피부를 조심스럽게 제거하고 작은 가위를 사용하여 시체에서 iBAT를 외과적으로 분리합니다. 커브 팁 플라이어를 사용하여 두 iBAT 로브를 모두 수확하여 로브를 독립적으로 제거합니다.

실온에서 1.5ml의 멸균 PBS가 들어 있는 플라스틱 튜브에 두 개의 로브를 넣습니다. 콜라겐분해효소 2형 분해 완충액에서 iBAT 조직을 섭씨 37도에서 45분 동안 800RPM으로 지속적으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. P1000 마이크로피펫과 필터 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 콜라겐분해효소 유형 2 분해 완충액의 조직 현탁액을 기계적으로 파괴합니다.

각 샘플에 대해 새 팁을 사용하십시오. 분리되지 않은 조직을 개별 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 새로운 1.5밀리리터 튜브에 통과시킵니다. 500 마이크로리터의 ACK 완충액을 여과된 조직 샘플에 추가합니다.

튜브를 4-5회 뒤집어 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫과 여과된 팁을 사용하여 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 현탁액을 새로운 1.5밀리리터 튜브에 통과시킵니다. 원심 융합은 텍스트 원고에 설명 된대로 펠릿을 재현탁시킵니다.

그런 다음 각 웰에 현탁액 1m리터를 추가하여 각 샘플을 24웰 배양 플레이트의 6개 웰에 파종합니다. 미분화 지방세포는 매우 낮거나 검출할 수 없는 수준의 ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 및 CD36을 나타냈습니다. 대조적으로, 이러한 마커는 분화 7일째에 유의하게 높았습니다.

갈색 지방세포에 여러 지질 방울이 축적된 것은 이전에 발표된 결과와 일치했습니다. 미토콘드리아 질량 마커 TOM 20과 산화적 인산화 복합체 단백질 수준이 분화 7일째에 유의한 증가가 관찰되었습니다. 이 세포 유형의 선의의 마커인 UCP1은 분화 7일째에 성숙한 갈색 지방세포에서 실질적으로 발현된 반면, 미분화 지방세포에서는 검출되지 않았습니다.

미토콘드리아는 0일째에 길쭉한 관 모양에서 7일째에 둥글거나 콩 같은 모양으로 진화했습니다. 미토콘드리아 내부 구조는 또한 지방 형성에 의해 수정되어 평행하게 포장된 크리스타의 밀도가 높아졌습니다. 중요한 것은 미토콘드리아가 분화된 갈색 지방세포의 지질 방울과 밀접하게 연관되어 있었기 때문에 미토콘드리아의 외막과 지질 방울의 표면 사이의 식별 가능한 거리는 고해상도 투과 전자 현미경으로도 감지할 수 없었다는 것입니다.

견갑골 간 지방 조직의 수술적 제거는 매우 중요합니다. 비효율적인 조직의 양은 분화될 세포의 가용성을 제한합니다. 이 이미징 기법은 in vitro에서 분화된 갈색 지방세포의 형태를 특성화하는 데 도움이 됩니다.

미토콘드리아 기능, 베타 안드로겐 활성화 및 자가포식 억제에 대한 분석을 수행할 수 있습니다.