Name: 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans 장내 마이크로바이옴의 고속 정량화 방법을 통해 개별 웜의 생리학적 상태와 미생물 정착 수준의 상관관계를 실시간으로 분석하는 기술을 익히세요.

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이 연구는 NIH 보조금 DP2DK116645(B.S.S.), Dunn Foundation 파일럿 상 및 NASA 보조금 80NSSC22K0250(B.S.S.)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 베일러 의과대학의 세포분석 및 세포 분류 코어(Cytometry and Cell Sorting Core)의 지원을 받아 CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672), NIH(S10 OD025251, CA125123 및 RR024574), Joel M. Sederstrom의 지원과 LPS NIH 보조금(S10 OD025251)을 위한 계측 보조금을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다.

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
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<li>Bäckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li>
<li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).</li>
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<li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li>
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<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).</li>
<li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+need+microbes+too%3A+microbiota%2C+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li>
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<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
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<li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Team+R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Core%22%5BJournal%5D)">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li>
<li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22tidyverse%22">tidyverse</a>. , (2019).</li>
<li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput%2C+high-content%2C+liquid-based+C.+elegans+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).</li>
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<li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877(2018).</li>
<li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li>
<li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li>
<li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIP-MAP%3A+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

유동 지렁이 측정법은 여러 연구에서 병원균 집락화 및 독성에 대한 예쁜꼬마선충 유전자 및 경로를 특성화하는 데 사용되었습니다21,22. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하여 장내 마이크로바이옴이 숙주 생리학을 조절하는 방법을 조사하는 고처리량 조정 가능한 접근법을 제시합니다. 콜로니 형성 단위(CFU) 또는 16S rRNA 앰플리콘 염기서열분석 9,16,17,23,24를 사용하는 기존 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 노동 집약적인 계수가 필요하거나 잠재적인 PCR 바이어스를 도입하지 않습니다.</...

동물의 진화는 끊임없는 미생물의 영향을 받고 있다1. 동물 숙주는 환경의 다양한 미생물로부터 숙주의 능력을 확장하고 생리적 특성과 질병에 대한 감수성을 촉진하는 특정 파트너2를 획득한다3. 예를 들어, 장내 마이크로바이옴에 대한 메타게놈 분석은 비만 마우스에서 더 많은 에너지 수확 및 저장을 제공할 수 있는 미생물 유전자의 풍부한 대사 클래스를 밝혀냈으며4 그 중 다수는 인간의 장내 마이크로바이옴에서도 발견된다5. 인과 관계를 확립하고 마이크로바이옴 영향의 분자 결정 요인을 정확히 찾아내야 할 필요성이 여전히 크지만, 대규모 스크리닝에 대한 숙주 시스템의 마이크로바이옴 복잡성과 다루기 쉬움으로 인해 진전이 방해를 받고 있습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans) 모델 유기체는 마이크로바이옴과 숙주 생리학 간의 연관성에 대한 분자적 이해를 증진할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 점막층과 융모 구조를 가진 20개의 장 세포를 가지고 있습니다. 이 세포는 미생물 생성물을 감지하고 잠재적으로 장내 집락을 조절하는 항균 분자를 생성하는 풍부한 화학 수용체 유전자를 갖추고 있습니다 6,7. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 보존된 생물학은 인슐린 신호전달, TGF-beta 및 MAP Kinase 8,9,10을 포함하여 장내 미생물을 조절하는 숙주 신호전달에 대한 엄청난 수의 발견으로 이어졌습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)은 발달 중 성장을 위한 식단과 성인이 된 마이크로바이옴 모두에서 미생물을 활용합니다. 나이가 들어감에 따라 일부 미생물은 장 내강에 과도하게 축적될 수 있으며, 숙주-미생물 관계는 공생에서 발병 기전으로 바뀔 수 있다11. 자연 서식지에서 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 다양한 박테리아 종을 만난다12,13. 자연 서식지(썩은 과일, 식물 줄기 및 동물 벡터)에서 수집된 대표 샘플에서 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 자연 마이크로바이옴은 프로테오박테리아(Proteobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 피르미쿠테스(Firmicutes), 악티노박테리아(Actinobacteria) 등 4가지 박테리아 문(phyla)이 지배적이라는 사실이 밝혀졌습니다. 이러한 구분 내에는 서식지12,13,14,15에 따라 박테리아의 다양성과 풍부함에 큰 차이가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구 커뮤니티17를 위해 만들어진 최고의 마이크로바이옴 속(genera)을 대표하는 63명의 회원(BIGbiome)16 및 12명의 회원(CeMbio) 컬렉션을 포함하여 여러 정의된 커뮤니티가 구축되었습니다. 마이크로바이옴과 구성 균주는 모두 예쁜꼬마선충의 생리학에 신체 크기, 성장 속도 및 스트레스 반응과 같은 다양한 영향을 미칠 수 있습니다 9,16,17. 이러한 연구는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 마이크로바이옴 연구의 모델로 확립하기 위한 리소스와 사례를 제공합니다.
여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 시스템을 활용하여 인구 규모에서 마이크로바이옴 구성과 숙주 생리학의 기본 측정을 동시에 측정하는 대형 입자 분류기(LPS) 기반 워크플로우(그림 1)를 제시합니다. 미생물 측면에서, 워크플로우는 정의된 마이크로바이옴 또는 단일 미생물을 조합하여 증가하는 미생물 상호 작용과 함께 군집의 견고성과 가소성을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 숙주 측에서 워크플로우를 통해 고처리량 분석을 통해 마이크로바이옴에서 형광 미생물의 집락화 수준을 측정하고 발달, 신체 크기 및 번식 측면에서 숙주 생리학적 판독을 수행할 수 있습니다. 종합하면, 예쁜꼬마선충(C. elegans) 마이크로바이옴 모델은 숙주 생리학을 조절하는 대사 및 유전적 결정 요인을 정확히 찾아낼 수 있는 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>15mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>96개의 딥 웰 플레이트(1mL)</td><td>Axygen</td><td>P-DW-11-C</td><td></td></tr><tr><td>96개의 딥 웰 플레이트(2mL)</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>96웰 Costar 플레이트</td><td>Corning</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>Standard 세균학 한천도 충분합니다.</td></tr><tr><td>흡인 매니폴드</td><td>V& P scientific</td><td>VP1171A</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach 솔루션&nbsp;</td><td></td><td></td><td>표백제와 5M 나트륨 차아염소산염 2:1 (v/v)</td></tr> <tr><td>세포 이미징 멀티모드 리더</td><td>혼합 Biotek</td><td>Cytation 5</td><td>세균 OD 측정</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>Sorvall Legend XTR</td><td>96 웰 플레이트 및 원추형 튜브</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>ggplot: 데이터 플로팅을 위한 다양한 R 프로그래밍 도구.</td><td>R 패키지</td><td>버전 3.3.2</td><td></td></tr><tr><td>대형 입자 자동 시료 주입기</td><td>Union Biometrica</td><td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>대형 입자 분류기</td><td>Union Biometrica</td><td>COPAS Biosorter</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher</td><td>AC187870100</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>RPI</td><td>L24066</td><td>Bacto-tryptone, 효모 추출물 및 NaCl을 사용한 표준 LB 가정용 레시피도 있습니다. 충분한.</td></tr><tr><td>M9 솔루션&nbsp;</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4 모노염기성, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td></tr><tr><td>선충 성장 매체</td><td>RPI</td><td>N81800-1000.0</td><td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 오토클레이빙 후 첨가.</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>GNU</td><td>버전 1.3.1093</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5M NaOH</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>멸균 10cm 직경 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>멸균 12웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-894</td><td></td></tr><tr><td>멸균 24웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>멸균 직경 6cm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

예쁜꼬마선충(caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

장내 마이크로바이옴의 구성은 동물의 발달과 생활 전반에 걸쳐 숙주 생리학에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 마이크로바이옴의 조성 변화를 측정하는 것은 이러한 생리적 변화 사이의 기능적 관계를 식별하는 데 매우 중요합니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )은 숙주-마이크로바이옴 상호작용의 분자 동인을 조사하기 위한 강력한 숙주 시스템으로 부상했습니다. 투명한 신체 구조와 형광 태그가 부착된 천연 미생물을 통해 개별 예쁜꼬마선 충 동물의 장내 미생물 군집 내 미생물의 상대적 수준은 대형 입자 분류기를 사용하여 쉽게 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 마이크로바이옴의 실험적 설정, 원하는 생애 단계에서 예쁜꼬마선충 개체군의 수집 및 분석, 분류기의 작동 및 유지 관리, 결과 데이터 세트의 통계 분석을 위한 절차를 설명합니다. 또한 관심 미생물을 기반으로 분류기 설정을 최적화하기 위한 고려 사항, 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 생애 단계에 대한 효과적인 게이팅 전략 개발, 장내 마이크로바이옴 구성을 기반으로 동물 개체군을 풍부하게 하기 위해 선별기 기능을 활용하는 방법에 대해서도 논의합니다. 잠재적인 응용 프로그램의 예가 프로토콜의 일부로 제시되며, 여기에는 처리량이 많은 응용 프로그램으로의 확장 가능성이 포함됩니다.

성충 및 유충 개체군 게이트 정의 여기에서 동기화된 예쁜꼬마선충(C. elegans) L1은 표준 실험실 식단인 E. coli OP50(Eco)으로 파종된 NGM 플레이트에서 성장했습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 개체군은 20°C에서 96시간 또는 120시간 성장한 후 LPS 분석을 위해 수집되었습니다(그림 2A). 멸종의 점도표(EXT, 신체 밀도의 대리물)와 비행 시간(TOF, 신체 길이의 대리)은 시각적으로 분리된 두 개의 동물 구름을 만듭니다. 각 점은 유충에 비해 성충에서 더 높은 EXT 및 TOF 값이 관찰되는 단일 동물을 나타냅니다(그림 2B). 이 두 매개변수는 개체군 증가와 생리학에 대한 귀중한 추론입니다. 예를 들어, 유충 TOF의 밀도 플롯은 유충 단계의 분포를 시각화할 수 있습니다. 생후 2일 된 성체의 자손...

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

장내 마이크로바이옴은 숙주의 생리를 형성하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히 이 프로토콜은 단일 세포 동물에서 형광 장내 미생물 집락화 수준을 대규모로 고처리량으로 평가할 수 있습니다. 이 방법의 주요 이점 중 하나는 살아있는 동물의 장내 마이크로바이옴을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것인데, 이를 통해 숙주의 생리학에 따른 변화를 식별하고 상관 관계를 파악할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 내 실험실의 연구원인 Dana Blackburn입니다. 박테리아 잔디밭에서 벌레를 1-2 밀리리터의 M9-TX로 씻어내는 것으로 시작하십시오. 웜을 멸균 된 2 밀리리터 96 웰 깊이의 플레이트로 옮깁니다.300G에서 1분 동안 펠릿화하고 흡입 매니폴드를 사용하여 액체를 제거합니다. 1.2 밀리리터 멀티 채널 피펫을 사용하여 1.8 밀리리터의 M9-TX를 피펫팅으로 혼합된 딥 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 최종 세척 후 흡인 매니폴드를 사용하여 각 웰의 부피를 100마이크로리터로 가져옵니다.100 마이크로 리터의 10 밀리 몰 레바미솔과 M9-T를 각 웰에 넣고 벌레가 5 분 동안 마비되도록합니다. 그런 다음 박테리아 덩어리를 줄이기 위해 2분 동안 각 웰에 4% 표백제 용액을 추가합니다. 표백제 처리 후 M9-TX를 플레이트의 각 웰에 추가하여 벌레를 씻습니다.플레이트를 원심 분리하고 두 번째 세척 후 최종 부피 100 마이크로 리터까지 흡인합니다. 웜을 150 마이크로 리터의 10 밀리몰의 레바미솔과 M9-TX를 포함하는 평평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 웜 밀도를 우물 당 50-100 마리의 웜으로 유지하고 개체군이 너무 붐비면 웜을 여러 개의 우물로 나눕니다.공기 압축기, 컴퓨터 및 LPS 기기를 켭니다. 폐기물 탱크를 확인하고 비우십시오. 양이 적으면 덮개와 물 탱크를 확인하고 다시 채우십시오.250마이크로미터의 유체 및 광학 코어 어셈블리가 제자리에 있는지 확인합니다. 오토샘플러를 연결하고 켭니다. 오토샘플러 기기 소프트웨어를 열어 오토샘플러와 LPS 소프트웨어를 엽니다.LPS 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 새 실험을 클릭한 다음 파일을 다시 선택하고 새 샘플 검사를 클릭합니다. 레이저가 488 및 561 나노미터 레이저를 켤 수 있도록 합니다(아직 수행되지 않은 경우). 이제 LPS 소프트웨어 창에서 ToF(Time of Flight), 소광(extinction) 및 형광 채널(fluorescent channel)을 사용하여 획득 도트 플롯을 위한 템플릿을 만들 수 있습니다.그래프 본문 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 배율을 수정합니다. 다음으로, 대조군 샘플을 불러옵니다. 자동 샘플러 창에서 prime을 선택하고 파일로 이동한 다음 스크립트 열기를 클릭하여 올바른 기본 제공 스크립트를 선택하고 확인을 클릭합니다.샘플러 소프트웨어 메뉴의 플레이트 템플릿으로 이동하여 분석을 위해 원하는 웰을 선택합니다. 플레이트를 오토샘플러 스테이지에 로드하고 고정한 후 오토샘플러 창에서 플레이트 실행을 누르고 메시지가 표시되면 파일을 저장한 다음 LPS 소프트웨어 창의 상단 리본에 있는 현재 데이터 저장 버튼을 클릭하고 데이터를 다시 저장합니다. LPS 소프트웨어를 엽니다.파일로 이동하여 새 실험을 선택한 다음, 파일로 돌아가서 새 샘플을 클릭합니다. X축에 비행 시간(time of flight)이 표시되고 Y축에 소멸(extinction)이 있는 점도표를 만듭니다. X축에 ToF(Time of Flight)가 있고 Y축에 빨간색이 있는 또 다른 점도표를 만듭니다.레이저가 488 및 561 나노미터 레이저를 활성화할 수 있도록 활성화를 선택해야 합니다. control sample tube를 샘플 포트에 배치한 다음, acquire and dispense 대화 상자 내에서 acquire를 클릭합니다. 메시지가 표시되면 파일을 저장해야 합니다.개체군을 구별할 수 있을 만큼 충분한 웜이 측정되면 비행 시간과 멸종 시간을 보여주는 점도표에서 중단을 선택합니다. 성인 인구를 나타내는 지역 주위에 게이트를 그립니다. 그런 다음 보기로 이동하여 gating hierarchy를 클릭하고 형광 게이트가 성인 인구 게이트 아래에 올바르게 나열되는지 확인합니다.비행 시간 대 빨간색 점 그림에서 높은 값과 낮은 빨간색 영역 주위에 게이트를 만들어 성충의 마이크로바이옴 집락을 보여주는 관심 영역을 강조 표시합니다. 설정이 최적화되면 파일로 이동하여 실험 저장을 클릭한 다음 파일을 클릭하고 샘플 저장을 선택합니다. 수집 장치를 로드하려면 로드 플레이트 A를 선택하여 수집 stage는 수집 튜브 또는 96웰 플레이트를 로드할 수 있는 위치로 이동합니다.96웰 플레이트에 디스펜싱하려면 설정 섹션으로 이동하여 플레이트를 선택한 다음 보정된 플레이트를 클릭하고 96웰 플레이트를 선택합니다. 그런 다음 웜을 정렬할 웰을 선택하고 각 웰에 정렬할 개체 수를 입력합니다. 제어된 관심 영역도 지정해야 합니다.여러 게이트 영역이 동일한 플레이트로 정렬되는 경우 각 웰에 게이트라고 표시된 상자를 선택해야 합니다. 확인을 클릭하여 변경 사항을 저장합니다. 번호를 분류하고 위치를 할당한 후 샘플을 샘플 포트에 로드하고 획득 및 분주 대화 상자에서 주입 플레이트 버튼을 클릭하여 96웰 플레이트로 분주를 시작합니다.더 높은 연장 및 비행 시간 값은 유충에 비해 성충에서 관찰됩니다. 생후 2일 된 성체의 자손은 L1 및 L2 단계에 의해 지배된 반면, 생후 3일 된 성체의 자손은 대부분 L3 및 L4 단계에 도달했습니다. 대장균에서 자랐을 때, 비행 시간 및 확장 값은 2일차에 비해 3일차에 증가했습니다.ochrobactrum, BH 3 및 혼합 배양에서 자랄 때 cenor abdidas allegands는 비행 시간 및 확장 값의 차이를 보였습니다. 증가된 ochrobactrum BH3 집락화는 ochrobactrum BH3 단독에서보다 혼합 조건에서 관찰되었습니다. 대조적으로, 녹색의 형광 값은 OP50 단독보다 혼합 조건에서 OP50 집락화가 더 낮다는 것을 나타냅니다.웜은 Y축 쪽으로 심하게 치우쳐 있어 대부분의 웜에서 OP50 군집이 낮고 ochrobactrum, BH3 군집 수준이 개체군에 고르게 분포되어 있음을 시사합니다. ochrobactrum, BH3 군집 수준과 체밀도 및 번식 패턴의 차이와 같은 숙주의 발달 사이의 관계도 관찰되었습니다. 두 구성원 혼합에서 자란 3일 된 성체는 마이크로바이옴에서 광범위한 RFP 강도를 보였으며, 이는 그룹 내 ochrobactrum 집락화의 개인차를 나타냅니다.높은 RFP 게이트와 낮은 RFP 게이트에서 분류된 15개의 개별 웜이 포함된 웰의 RFP 이미지가 표시됩니다. 가장 중요한 것은 프로토콜과 시스템이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 모든 단계에 적절한 컨트롤을 사용하는 것을 기억하는 것입니다. 실시간으로 특정 특징을 가진 동물을 사용하여 숙주 또는 미생물 돌연변이 풀에서 균주를 분리하여 미생물 후 상호 작용을 조절하는 유전자를 식별할 수 있습니다.분리된 동물은 또한 단일 동물 또는 RNA-seq 등과 같은 농축된 표현형 풀 기반 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 정말로, 기회는 정말 무궁무진합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 FITC 표지된 덱스트란을 지렁이에 공급하여 예쁜꼬마선충 장 내강의 무결성을 시각화하고 측정하는 방법을 소개합니다. 예시 프로토콜은 3,3'-디인돌릴메탄(DIM) 처리 및 병원균 사육 지렁이로 수행된 분석을 보여줍니다.

FITC-덱스트란 공급: 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 정량화하는 방법

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

출처: Le, T. A. N . 외, 박테리아 및 화학물질이 카 에노르하브디티스 엘레간스의 장 투과성에 미치는 영향 측정. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 Pseudomonas aeruginosa에 노출된 C. elegans의 장 투과성을 정량화하기 위한 형광 기반 분석 방식을 보여줍니다. 대장균을 먹인 대조군과 비교하면, 병원체 처리된 벌레는 체강으로의 형광체 누출이 증가하여 상피 장벽 손상을 나타냅니다.

세균 노출 후 C. elegans 의 장 투과성 평가

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.

케노하브디티스 예쁜꼬마선충의 장 내 침투성에 대한 박테리아와 화학물질의 영향 측정

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

배우세요 Caenorhabditis elegans 장내 마이크로바이옴의 고속 정량화 방법을 통해 개별 웜의 생리학적 상태와 미생물 정착 수준의 상관관계를 실시간으로 분석하는 기술을 익히세요.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

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