Name: 식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 Pseudomonas syringae의 단일 세포 유전자 발현 분석 방법을 식물 조직에서 적용하는 기술입니다. 이 최적화된 프로토콜은 식물 세포 잔해 오염을 최소화하면서 세균을 효과적으로 회수하여 유세포 분석이 가능합니다.

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1. 식물 준비
<ol><li>아래 단계에 따라 Arabidopsis Col-0 식물을 준비하십시오.<ol><li>직경 10cm의 화분에 1:3 질석-식물 기질 혼합물( 재료 표 참조)을 채우고 이전에 물을 주고 15mm x 15mm 구멍이 있는 1.6cm x 1.6cm 금속 메쉬로 화분을 덮습니다. 고무 밴드를 사용하여 젖은 토양에 금속 메쉬를 조정합니다(그림 1A).</li>
		<li>젖은 이쑤시개로 애기장대 씨앗을 금속 메쉬의 구멍에 뿌립니다. 냄비 안의 먼 위치에 3-4 개의 씨앗을 놓습니다 (그림 1B, C).</li>
		<li>높은 상대 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔으로 냄비를 덮고 성층화를 위해 4°C에서 72시간 동안 배양합니다. 참고: 층화(설명된 대로 높은 습도와 낮은 온도에서 배양)는 씨앗의 발아율과 동시성을 향상시킵니다.</li>
		<li>짧은 하루 조건(8°C에서 16시간 밝음/21시간 어두움, 광도: 100μmol·m-2·s-1, 상대 습도: 70%)에서 화분을 식물 성장 챔버로 옮깁니다.</li>
		<li>종자 발아 후 (8-10 일), 핀셋을 사용하여 대부분의 묘목을 제거하고 냄비의 각 위치 (6 개의 묘목 / 냄비)에 하나의 묘목을 유지합니다 (그림 1D). 플라스틱 돔을 제거하여 냄비를 드러냅니다. 참고: 식물은 발아 후 4-5주 후에 사용할 준비가 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Phaseolus vulgaris 콩 (품종 Canadian Wonder) 식물을 준비하십시오.<ol><li>페트리 접시의 바닥을 젖은 수건 종이로 덮고 그 위에 콩씨를 놓습니다. 페트리 접시를 수술용 테이프로 밀봉하고 28°C에서 3-4일 동안 배양합니다(그림 2A).</li>
		<li>발아 된 씨앗을 젖은 10 : 1 질석-식물 기질 혼합물로 채워진 직경 3cm 냄비에 옮깁니다.</li>
		<li>장일 설정(23°C에서 16시간 밝음/8시간 어두움, 광도: 100μmol·m−2·s−1, 상대 습도: 70%)에서 식물 성장 챔버에서 배양합니다. 알림: 식물은 발아 후 10일 후에 사용할 준비가 됩니다(그림 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 애기장대와 콩식물의 접종
참고: 이 연구에서 균주 P. syringae pv. 토마토 DC3000 및 P. syringae pv. phaseolicola 1448A를 사용하였다.
<ol><li>P. syringae 접종물을 준비합니다.<ol><li>적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L NaCl, 5g/L 효모 추출물 및 16g/L 세균 한천, 표 참조)에 -80°C 글리세롤 스톡에서 관심 있는 P. syringae 균주를 줄무늬로 제거합니다. 28°C에서 40-48시간 동안 배양합니다. 참고: 관심 균주가 플라스미드 또는 게놈 내성 유전자를 가지고 있는 경우 항생제를 사용하는 것이 좋습니다. P. syringae 에 권장되는 항생제 농도는 다음과 같습니다: 카나마이신(15μg/mL), 겐타마이신(10μg/mL), 암피실린(300μg/mL)( 재료 표 참조).</li>
		<li>박테리아 바이오매스를 긁어내고 5mL의 10mMMgCl2에 재현탁합니다. OD600을 측정하고 10 mMMgCl2를 첨가하여 0.1로 조정한다. 참고: P. syringae 배양액의 OD600 0.1은 5 x 107 CFU·mL-1에 해당합니다.</li>
		<li>10mM MgCl2로 연속 희석을 수행하여 최종 접종물 농도 5 x 105 CFU·mL-1에 도달합니다. 애기장대 식물에 200mL, 콩 식물에 50mL의 접종물을 준비합니다.</li>
		<li>접종 직전에 계면활성제인 Silwett L-77( 표 참조)을 최종 농도로 콩 접종의 경우 0.02%, 애기장대의 경우 0.01%로 첨가합니다. Silwett는 애기장대 조직에 다소 해롭습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>진공 침투를 수행합니다.<ol><li>애기장대 침윤의 경우 냄비 위에 X를 형성하는 두 개의 나무 막대기를 놓고(그림 1E) 200mL 접종물이 들어 있는 직경 14cm의 페트리 접시 위에 냄비를 아래로 향하게 놓습니다(그림 1F).</li>
		<li>콩 잎 접종의 경우 접종물이 들어 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 잎을 넣습니다(그림 2C).</li>
		<li>접종 용액에 담근 식물을 진공 챔버 (그림 1G 및 그림 2D)에 넣고 30 초 동안 500mbar의 펄스를 주어 잎에 침투시킵니다. 잎이 완전히 침투 할 때까지 진공 펄스를 2-3 회 반복합니다 (그림 1H 및 그림 2E).</li>
		<li>종이로 초과 접종 용액을 배출하고 식물을 해당 성장 챔버로 되돌립니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 아포플라스트에서 박테리아 추출
<ol><li>접종 4일 후, 애기장대 식물의 공중 부분이나 콩 식물의 접종된 잎을 잘라내어 바늘 없이 20mL 주사기에 넣습니다(그림 2G). 콩 잎의 경우 그림 2F와 같이 잎을 굴리고 축면이 바깥쪽을 향하도록 합니다.</li>
	<li>조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 증류수를 추가합니다(보통 10-15mL).</li>
	<li>플런저를 삽입하고 팁이 위를 향하도록 주사기를 수직 위치에 놓고 모든 공기가 팁 근처에 위치할 때까지 배럴을 부드럽게 두드려 주사기 내부의 과도한 공기와 기포를 제거합니다. 그런 다음 플런저를 밀어 공기를 빼냅니다. 주사기 내부에 가능한 한 적은 공기가 있으면 주사기 배럴의 끝을 파라핀 필름으로 덮습니다.</li>
	<li>조직이 어두워질 때까지 플런저를 조심스럽게 눌러 양압을 생성합니다(그림 1I 및 그림 2H). 그런 다음 플런저를 당겨 음압을 생성합니다(그림 1J 및 그림 2I). 이 단계를 3-5 번 반복하십시오.</li>
	<li>파라핀 필름과 플런저를 제거하고 도 2J에서와 같이 아포플라스트 추출 박테리아를 포함하는 유체를 수집합니다.</li>
</ol>4. 아포플라스트 추출 박테리아의 단세포 분석
<ol><li>아래 단계에 따라 컨포칼 현미경으로 시각화합니다.<ol><li>증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비한다. 녹으면 나란히 놓인 두 현미경 슬라이드 사이의 공간을 채울 만큼 충분한 부피를 추가하고 그 위에 다른 슬라이드를 놓습니다(그림 3). 15분 동안 건조시킨 후 상단에 놓인 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 칼날을 사용하여 사용 직전에 아가로스 패드를 5mm x 5mm 조각으로 자릅니다.</li>
		<li>동시에, 실온에서 1분 동안 12,000 x g 에서 추출된 아포플라스트 박테리아 1mL를 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 물 20μL에 재현탁하여 세포를 농축합니다. 농축된 세포 2μL 방울을 0.17mm 커버슬립에 놓고 그림 3과 같이 이전에 1단계에서 얻은 5mm x 5mm 아가로스 패드 조각으로 방울을 덮습니다.</li>
		<li>컨포칼 현미경으로 박테리아 준비를 시각화합니다( 재료 표 참조). 녹색 형광 박테리아를 식별하려면 488nm의 여기 레이저와 500nm에서 550nm 범위의 방출 필터를 사용하십시오. 모든 박테리아를 식별하려면 명시 필드를 사용하고 두 필드를 병합하십시오.</li>
		<li>Fiji를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리합니다( 재료 표 참조). 이를 위해 MicrobeJ 플러그인을 사용하여 박테리아 세포의 윤곽을 식별하고 내부의 형광 강도를 측정합니다. 참고: 이 분석에는 분리된 박테리아(클러스터되지 않음)에서 이미지를 획득하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유세포 분석에 의한 분석을 수행합니다.<ol><li>아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 분취량을 채취하여 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다. 이벤트 100,000개를 획득합니다.</li>
		<li>박테리아와 식물 파편을 구별하기 위해 접종하지 않은 식물에서 추출한 아포플라스트를 분석하고 전방 산란(FSC) 세포 크기와 측면 산란(SSC) 세포 크기를 보여주는 점도표를 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 세포 크기와 비교합니다. 비형광 박테리아를 식별하려면 비형광 동종 박테리아를 접종한 식물에서 추출한 아포플라스트를 사용하고 형광 방출을 비교하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
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<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 제시된 방법은 박테리아가 식물 잎 조직으로 침투할 수 있도록 하는 비침습적 절차를 설명하여 조직 파괴를 최소화하면서 대량의 신속한 접종을 가능하게 합니다. P. syringae 종 복합체의 특징 중 하나는 식물 아포플라스트 내부와 식물 표면에서 착생식물(epiphyte)로 생존하고 증식하는 능력이다14. 따라서 본 프로토콜을 사용하여 추출된 박테리아가 식물 아포플라스트에서만 나올 가능성을 배제할 수 없습니다. 그러나 이전에 공초점 현미경을 사용하여 잎 표면의 박테리아 비율이 식물 잎 내부의 박테리아 성장에 비해 현저히 미미하다는 것이 입증되었습니다5. 이것은 추출 전에 잎 표면을 현미경으로 검사하여 확인할 수 있습니다. 또한, 본 프로토콜에서 모델로 사용된 P. syringae 균주인 Pto DC3000 및 Pph 1448A는 추출된 박테리아의 무의미한 비율을 나타내는 약한 epiphites<sup cla...

병원성 박테리아는 다양한 표현형의 차이를 나타내어 유전적으로 동일한 집단 내에서 하위 집단을 형성합니다. 이 현상은 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)으로 알려져 있으며, 박테리아-숙주 상호작용 중 적응 전략으로 제안되었다1. 형광 단백질과 결합된 컨포칼 현미경, 유세포 분석 및 미세 유체의 광학 해상도의 최근 발전은 박테리아 개체군에 대한 단일 세포 분석을 촉진했습니다2.
그람 음성균(Gram-negative Pseudomonas syringae)은 학문적, 경제적 중요성 때문에 전형적인 식물 병원성 박테리아이다3. P. syringae의 수명주기는 물 순환4과 관련이 있습니다. P. syringae는 기공이나 상처와 같은 자연적인 구멍을 통해 식물의 잎 아포플라스트인 중엽세포(mesophyll cell) 사이의 세포간 공간으로 들어간다5. 일단 아포플라스트에 들어가면, P. syringae는 III형 분비계(T3SS)와 III형-전위 이펙터(T3E)에 의존하여 식물 면역을 억제하고 병원체의 이익을 위해 식물 세포 기능을 조작한다6. T3SS 및 T3E의 발현은 표적 유전자7의 프로모터 영역에서 hrp-box 모티프에 결합하는 대체 시그마 인자인 마스터 조절인자 HrpL에 의존한다.
관심 유전자의 하류에 있는 형광 단백질 유전자에 염색체 위치 전사 융합체를 생성함으로써, 단일 세포 수준8에서 방출되는 형광 수준을 기반으로 유전자 발현을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 hrpL의 발현은 실험실에서 자란 박테리아 배양과 식물 아포플라스트 8,9에서 회수된 박테리아 개체군 내에서 이질적이라는 것이 확인되었습니다. 단일 세포 수준의 유전자 발현 분석은 일반적으로 실험실 배지에서 성장한 박테리아 배양에서 수행되지만, 이러한 분석은 식물 내에서 자라는 박테리아 개체군에 대해서도 수행될 수 있으므로 자연적 맥락에서 하위 개체군 형성에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 식물에서 추출한 박테리아 개체군 분석에 대한 잠재적인 한계는 아포플라스트에 주사기 압력 침투에 의한 고전적인 접종 방법에 이어 잎 조직의 침용에 의한 박테리아 추출이 일반적으로 다운스트림 분석을 방해하는 다량의 세포 식물 파편을 생성한다는것입니다 10. 대부분의 세포 파편은 GFP 형광과 겹치는 엽록체의 자가형광 단편으로 구성되어 있어 오해의 소지가 있는 결과를 초래합니다.
본 프로토콜은 2개의 모델 병리학에서 단세포 유전자 발현 이질성을 분석하는 과정을 설명한다: 하나는 P. syringae pv에 의해 형성된다. 토마토 균주는 DC3000 및 애기장대 탈리아나 (Col-0)이고, 다른 하나는 P. syringae pv에 의한 것이다. phaseolicola 균주 1448A 및 콩 식물 (Phaseolus vulgaris 품종 Canadian Wonder). 진공 챔버와 펌프를 이용한 진공 침투를 기반으로 한 접종 방법을 제안하여 잎 전체에 빠르고 손상없이 침투하는 방법을 제안합니다. 또한, 기존 프로토콜을 개선한 것으로, 주사기 내에서 소량의 부피를 사용하여 양압 및 음압 주기를 적용하여 아포성형액 추출을 기반으로 조직 파괴를 크게 줄이는 아포플라스트에서 박테리아 집단을 추출하는 더 부드러운 방법이 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.17mm 커버슬립</td><td></td><td></td>, <td>특별 요구 사항 없음</td></tr>, <tr><td>1.6 x 1.6mm 금속 메쉬</td>, <td>Buzifu</td><td></td><td>, 유리 섬유 스크린 메쉬</td></tr>, <tr><td>직경 10cm, 냄비,</td><td>특별한 요구 사항 없음</td>, <td></td><td></td></tr><tr><td>140mm 페트리 접시</td><td></td><td></td>, <td>특별 요구 사항 없음</td></tr>, <tr><td>20mL 주사기</td><td></td><td></td>, <td>특별 요구 사항 없음</td></tr>, <tr><td>50mL 원추형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin 나트륨</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세균학 한천</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 스텔라리스</td><td>라이카 마이크로 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS버스 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피지 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이트</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>Phytotechnology</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td></td><td></td></tr><tr><td>공장 기질</td><td></td><td></td><td>특별한 요구 사항 없음</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cromton Europe Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이쑤시개</td><td></td><td></td><td>특별한 요구 사항 없음</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td>특별한 요구 사항 없음</td></tr><tr><td>진공 챔버 직경 25cm</td><td>Kartell</td><td>554</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>GAST</td><td>DOA-P504-BN</td><td></td></tr><tr><td>질석</td><td></td><td></td><td>특별한 요구 사항 없음</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

식물 조직 내 pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

과다한 병원성 미생물이 지속적으로 식물을 공격합니다. 슈도모나스 주사기 종 복합체는 다양한 숙주와 특별한 관련이 있는 그람 음성 식물 병원성 박테리아를 포함합니다. P. syringae 는 잎 표면에서 식물로 들어가 아포플라스트 내에서 빠르게 증식하여 세포간 공간을 차지하는 미세 콜로니를 형성합니다. 박테리아에 의한 형광 단백질의 구성적 발현은 미세 콜로니의 시각화와 현미경 수준에서 감염의 발달을 모니터링할 수 있게 합니다. 단일 세포 분석의 최근 발전은 클론 동종 박테리아 집단이 도달하는 큰 복잡성을 밝혀냈습니다. 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)이라고 하는 이러한 복잡성은 박테리아 군집 간의 유전자 발현(유전적 차이와 관련이 없음)의 세포 간 차이의 결과입니다. 단일 세포 수준에서 개별 유전자좌의 발현을 분석하기 위해 형광 단백질에 대한 전사 융합이 널리 사용되었습니다. 식물 아포플라스트의 집락화 동안 발생하는 것과 같은 스트레스 조건에서 P. syringae 는 주요 독성 유전자(즉, Hrp 유형 III 분비 시스템)의 이질적인 발현을 기반으로 별개의 하위 집단으로 분화됩니다. 그러나 식물 조직에서 회수된 P. syringae 개체군의 단일 세포 분석은 접종 및 박테리아 추출 공정에 내재된 기계적 파괴 중에 방출되는 세포 파편으로 인해 어렵습니다. 본 보고서는 애기장대와 콩 식물의 집락화 동안 단일 세포 수준에서 관심 있는 P. syringae 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 개발된 방법을 자세히 설명합니다. 식물의 제조 및 진공 챔버를 이용한 접종에 사용되는 박테리아 현탁액이 설명된다. 아포소성 유체 추출에 의한 감염된 잎에서 내생 박테리아의 회수도 여기에 설명되어 있습니다. 박테리아 접종 및 박테리아 추출 방법 모두 식물 및 박테리아 세포 손상을 최소화하도록 경험적으로 최적화되어 현미경 및 유세포 분석 분석에 최적의 박테리아 제제를 제공합니다.

III형 분비 시스템의 발현은 식물 내 박테리아 성장에 필수적입니다. T3SS 유전자의 적시 발현은 복잡한 조절을 통해 이루어지며, 그 중심에는 T3SS 관련 유전자 발현의 핵심 활성화인자인 세포외 기능(ECF) 시그마 인자 HrpL이 있다11. hrpL의 발현 분석은 이전에 하류 프로모터가 없는 gfp 유전자에 대한 염색체 위치 전사 융합을 사용하고 공초점 현미경 및 유세포 분석에 의한 발현 패턴을 추적하여 수행되었습니다9. 이들 융합체는 PCR 및 전통적인 클로닝을 통해 생성된 플라스미드-인코딩된 구축물의 상동성 재조합-매개 통합을 통해 생성되고, 관심있는 유전자 (STOP 코돈 포함)의 ORF의 마지막 500개 염기쌍 및 서열의 500개 염기쌍을 바로 하류에 운반하여, 사용될 형광 리포터 유전자의 리보솜-결합 부위 및 ORF를 측면화한다 (이 경우, GFP), 항생제 내성 카세트(이 경우 ...

본 프로토콜은 식물 아포플라스트 내에서 성장한 슈도모나스 시린지와 집단에 대한 단일 세포 유전자 발현 분석을 허용하는 방법을 설명합니다.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

당사의 프로토콜은 유세포 분석과 같은 단일 세포 유전자 발현 분석에 적합한 잎 아포플라스트에서 자란 박테리아 개체군을 회수할 수 있는 부드러운 식물 접종 및 추출 방법을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 식물 세포 파편으로 샘플을 크게 오염시키지 않고 아포 플라스트에서 상당한 양의 박테리아를 추출 할 수 있습니다. 아포형성 박테리아 회수를 위한 이 최적화된 방법은 식물 병원성 박테리아 또는 유익한 내세포 박테리아를 포함하는 여러 식물 박테리아 시스템에 직접 또는 약간의 수정을 가하여 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생 인 Nieves Lopez-Pagan이 될 것입니다. 시작하려면 직경 10cm의 화분에 이전에 물을 뿌린 1:3 질석 식물 기질 혼합물을 채웁니다. 구멍이 뚫린 금속 메쉬로 냄비를 덮고 고무 밴드를 사용하여 금속 메쉬를 젖은 토양에 맞게 조정하십시오.다음으로, 젖은 이쑤시개로 금속 메쉬의 구멍에 애기장 씨앗을 뿌립니다. 냄비 안의 먼 위치에 3-4 개의 씨앗을 놓습니다. 높은 상대 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔으로 냄비를 덮고 섭씨 4도에서 72시간 동안 성층화를 위해 배양합니다.짧은 하루 조건에서 화분을 식물 성장 챔버로 옮깁니다. 냄비를 드러내려면 플라스틱 돔을 제거하십시오. 씨앗이 발아되면 핀셋을 사용하여 대부분의 묘목을 제거하고 냄비의 각 위치에 하나의 묘목을 유지합니다.그런 다음 페트리 접시의 바닥을 젖은 종이 타월로 덮고 그 위에 콩 씨앗을 올려 Phaseolus vulgaris 콩 식물을 준비합니다. 페트리 접시를 수술 용 테이프로 밀봉하고 섭씨 28도에서 3-4 일 동안 배양합니다. 발아된 씨앗을 습식 1:3 질석 식물 기질 혼합물로 채워진 직경 10cm 화분에 옮기고 장시간 설정에서 식물 성장 챔버에서 배양합니다.섭씨 영하 80도에서 관심 있는 Pseudomonas syringae 균주의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트에 줄무늬로 채취합니다. 플레이트를 섭씨 28도에서 40 내지 48시간 동안 배양한다. 박테리아 바이오매스를 긁어내고 5밀리리터의 10밀리몰 염화마그네슘에 다시 현탁합니다.600 나노 미터에서 광학 밀도를 측정하고 10 밀리몰 염화 마그네슘을 첨가하여 0.1로 조정하십시오. 10 밀리몰 염화 마그네슘에서 연속 희석을 수행하여 밀리 리터 당 10에서 5 번째 CFU의 5 배의 최종 접종 농도를 얻습니다. 그런 다음 애기장대 식물에 200밀리리터, 콩 식물에 50밀리리터의 접종물을 준비합니다.접종 전에 계면활성제인 Silwet L-77을 최종 농도(콩 접종의 경우 0.02%, 애기장대의 경우 0.01%)로 첨가합니다. 애기장대 침투의 경우 냄비 위에 X를 형성하는 두 개의 나무 막대기를 놓고 14밀리리터의 접종물이 들어 있는 직경 200cm의 페트리 접시 위에 냄비를 아래로 향하게 놓습니다. 콩 잎 접종을 위해 식물과 접종 용액을 진공 챔버에 넣고 접종 물이 들어있는 50 밀리리터 원추형 원심 분리기 튜브에 잎을 넣습니다.나뭇잎에 침투하기 위해 30 초 동안 500 밀리바의 펄스를줍니다. 종이 한 장으로 초과 접종 용액을 배출하고 계획을 해당 성장 챔버로 되돌립니다. 접종 4 일 후, 애기장대 식물의 공중 부분 또는 콩 식물의 접종 된 잎을 잘라 바늘없이 20 밀리리터 주사기에 넣습니다.콩 잎의 경우, 잎을 굴려서 축 방향면을 바깥쪽으로 남겨 둡니다. 조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 증류수를 첨가하십시오. 그런 다음 주사기를 똑바로 세운 플런저를 삽입하고 모든 공기가 팁 근처에 위치할 때까지 배럴을 가볍게 두드려 주사기 내부의 과도한 공기와 기포를 제거하고, 공기를 제거한 후 주사기 배럴의 끝을 파라핀 필름으로 덮습니다.이제 플런저를 조심스럽게 눌러 조직이 어두워 질 때까지 양압을 생성합니다. 그런 다음 플런저를 당겨 음압을 생성합니다. 파라핀 필름과 플런저를 제거하고 아포플라스트가 추출한 박테리아가 포함된 유체를 수집합니다.단일 세포 분석을 위해 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비합니다. 녹으면 나란히 놓인 두 현미경 슬라이드 사이의 공간을 채울 만큼 충분한 양을 추가하고 그 위에 다른 슬라이드를 놓습니다. 15분 동안 운전하게 하고 상단에 놓인 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.블레이드를 사용하여 사용하기 전에 아가로스 패드를 5 밀리미터 x 5 밀리미터 조각으로 자릅니다. 병행으로, 아포플라스트가 추출한 박테리아 1mm를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 20마이크로리터의 물에 재현탁하여 세포를 농축합니다.농축된 세포의 2마이크로리터 방울을 0.17mm 커버 슬립에 놓고 아가로스 패드 조각으로 방울을 덮습니다. 컨포칼 현미경으로 박테리아 제제를 시각화하여 특정 레이저를 사용하여 녹색 형광 박테리아를 식별합니다. 명시야를 사용하여 모든 박테리아를 식별하고 두 필드를 병합합니다.유세포 분석에 의한 분석을 수행하려면 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 분취량을 취합니다. 유세포 분석기를 사용하여 분석하고 100, 000 개의 이벤트를 수집합니다. GFP의 hrpL 발현은 GFP 형광에 의해 모니터링된다.도트 플롯 그래프는 모집단에서 GFP 대 세포 크기의 형광 강도 분포를 보여주고, 히스토그램은 GFP 대 세포 수의 형광 강도를 보여줍니다. hrpL ON 백분율은 hrpL OFF의 해당 백분율보다 높았다. 형광 현미경 이미지는 hrpL의 발현과 관련된 GFP의 이질적인 수준을 보여줍니다.GFP 형광이 낮거나 전혀 나타나지 않는 박테리아가 관찰됩니다. 최적의 결과를 얻으려면 박테리아 추출 단계에서 부드럽게 하여 식물 조직의 손상을 방지하고 식물 세포 내용물로 인한 오염을 제한하십시오. 얻어진 박테리아 샘플은 후속 박테리아 게놈 또는 전사체 분석을 위한 핵산 추출과 같이 식물 오염을 줄이는 것이 유리한 다른 목적으로 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

출처: Rufián, J. S. 외, 식물 조직 내 Pseudomonas 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 주사기 기반 압력 방법을 보여주며, 세포 세포 간 공간인 세포 간 공간인 아포플라스트에서 증식하여 미세군집을 형성하는 포포플라스틱 박테리아를 추출합니다. 이 방법은 단세포 분석에 적합한 잔해 없는 박테리아 샘플을 제공합니다.

주사기 기반 압력 방법을 이용한 부유성 박테리아 추출

출처: 루피안, J. S. 외 식물 조직 내 슈도모나스 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022).이 영상은 형광 표지 전사 인자를 사용하여 식물 추출 병원성 박테리아의 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 분석하는 방법을 시연합니다. 공초점 영상은 병원성 유전자 발현의 이질성을 드러내어 클론 박테리아 집단 내의 기능적 다양성을 강조합니다.

식물 추출 병원체에서 유전자 발현의 단세포 분석

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

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배우세요 Pseudomonas syringae의 단일 세포 유전자 발현 분석 방법을 식물 조직에서 적용하는 기술입니다. 이 최적화된 프로토콜은 식물 세포 잔해 오염을 최소화하면서 세균을 효과적으로 회수하여 유세포 분석이 가능합니다.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

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