Name: 정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 학습하세요 정적 및 동적 방법을 결합하여 유기 과산화산의 낙농 생물막 박멸 효능을 평가하는 프로토콜을. Pseudomonas azotoformans를 사용한 이 접근법은 식품 및 의료 분야의 생물막 제어 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc 및 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (RDCPJ516460-17)의 지원을 받았습니다. 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Teresa Paniconi에게 감사드립니다.

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

MBEC 분석법(biofilm microplate assay)은 ASTM17에 의해 표준 생물막 박멸 시험법으로 인정된 최초의 방법이었다. 우리의 연구와 다른 사람들은이 분석을 사용할 때 두 가지 중요한 단계가 있음을 보여주었습니다 : 초음파 처리 단계 (시간 및 전력)와 소독제 처리 시간18. Stewart와 Parker는 또한 미생물 종, 생물막 나이, 표면적/부피 비율 등과 같은 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 매개변수를 제안했습니다. 19. 마지막으로, 마이크로플레이트 뚜껑의 못 주위에 생물막의 형성은 이질적일 수 있으며 사용된 박테리아에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
MBEC 방법은 잠재적으로 다양한 유형의 소독제와 함께 사용될 수 있습니다. SEM 및 컨포칼 현미경과 같은 현미경 기술의 사용은 상호 보완적이며 ...

낙농 산업은 캐나다를 포함하여 전 세계적으로 주요 산업 부문으로, 10,500개 이상의 낙농장에서 매년 약 9,000만 hL의 우유를 생산하고 있습니다1. 가공 공장을 포함하여 낙농 산업에서 부과되는 엄격한 위생 요구 사항에도 불구하고 우유는 미생물을 위한 훌륭한 배양 배지를 구성하므로 유제품에는 부패 또는 병원성 미생물을 포함한 미생물이 포함될 가능성이 높습니다. 이 병원체는 다양한 질병을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 살모넬라균 과 리스테리아 모노사이토제네스는 각각 위장염과 수막염을 유발할 수 있다2. 부패 미생물은 가스, 세포외 효소 또는 산을 생성하여 유제품의 품질과 관능적 특성에 영향을 미칠 수 있다3. 우유의 모양과 색상은 예를 들어 Pseudomonas spp.4에 의해 변경될 수도 있습니다.
이러한 미생물 중 일부는 스테인리스 스틸을 포함하여 다양한 표면에 생물막을 형성할 수 있습니다. 이러한 생물막은 장비 표면의 미생물의 지속성 및 증식을 가능하게 하여 유제품의 오염을 가능하게 한다5. 생물막은 또한 열 전달을 방해하고 장비의 부식을 가속화하여 장비의 조기 교체로 이어져 경제적 손실을 초래하기 때문에 문제가 된다6.
CIP(Clean-in-Place) 절차를 통해 식품 산업은 미생물의 성장을 제어할 수 있습니다. 이러한 절차에는 수산화 나트륨, 질산 및 때로는 하이포아염소산 및과 아세트산 7,8을 함유 한 살균제의 순차적 사용이 포함됩니다. 하이포아염소산은 미생물에 대해 매우 효과적이지만 천연 유기물과도 반응하여 독성 부산물을 형성합니다9. 과초산은 유해한 부산물을 생성하지 않는다10; 그러나 식품 산업에서 생물막에 대한 효과는 매우 다양합니다10,11. 최근에, 퍼프로피온산 및 퍼락트산을 포함한 다른 퍼옥시산이 항균 활성에 대해 연구되었으며, 이들은 생물막에서 미생물 성장을 조절하기 위한 좋은 대안으로 보인다12,13.
따라서 본 연구는 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석법, 정적 고처리량 스크리닝 방법, 질병통제센터(CDC) 생물막 반응기, in situ를 모방한 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 유제품 생물막 박멸을 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산, 과락트산 및 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 했습니다 여건. MBEC 분석은 이후 프로토콜에서 "생물막 마이크로타이터 플레이트"로 지칭된다. 여기에 제시된 프로토콜과 대표적인 결과는 유기 퍼옥시산의 효능과 낙농 산업에서 미생물 생물막을 제어하기 위한 잠재적 응용을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; M 필터&nbsp;</td><td>Corning</td><td>09-754-28</td><td>직경: 50 mm, PTFE- 멤브레인</td></tr><tr><td>316 스테인리스 스틸 디스크 쿠폰</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>RD128-316</td><td></td></tr><tr><td>316 스테인리스 스틸 슬라이드 쿠폰</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2128-316</td><td></td></tr><tr><td>96-마이크로타이터 플레이트</td><td>Corning</td><td>07-200-89</td><td>세포 배양 처리, 평면 바닥 마이크로플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>27225</td><td>RT</td></tr><tr><td>알루미늄 스텁</td><td>전자 현미경 과학</td><td>75830-10</td><td>32x5mm</td></tr><tr><td>수성 글루 타르 알데히드 EM 등급 25 %</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>16220</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>AB204-S/FACT 분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td></td></tr><tr><td>세균 벤트 필터(0.45 &마이크로; m)</td> <td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>BST 02915</td><td></td></tr><tr><td>BioDestroy</td><td>Groupe Sani Marc</td><td>09-10215</td><td>상업용 과아세트산 기반 소독제, RT</td></tr><tr><td>Carboy LDPE 20 L</td><td>Cole Parmer</td><td>06031-52</td><td></td></tr><tr><td>CDC 생물막 반응기</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CRB 90</td><td>생물 반응기</td></tr><tr><td>세륨 (IV) 황산염</td><td>Thermo Scientific</td><td>35650-K2</td><td>RT</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 매장&nbsp; LSM 700</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dey-Engley 중화 국물</td><td>Millipore</td><td>D3435-500G</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>EMS950x + 350s 골드 스퍼터&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>전자 현미경 과학</td><td>14121</td><td>BDMA</td></tr><tr><td>에틸 알코올 95%, USP</td><td>Greenfield 글로벌</td><td>P016EA95</td><td>RT</td></tr><tr><td>페로인 표시기 솔루션</td><td>시그마 알드리치</td><td>318922-100ML</td><td>RT</td></tr><tr><td>충전 / 환기 캡</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-06258-00</td><td></td></tr> <tr><td>저장FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>형광 세포 생존 키트 (SYTO 9: 녹색 형광 염색, Propidium iodide: 적색 형광 염색), 보관 위치 - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>유리 플로우 브레이크</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>FB 50</td><td></td></tr><tr><td>Gold with silver paint&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12684-15</td><td></td></tr><tr><td>가열판 세트</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>110V 교반 플레이트</td><td></td></tr><tr><td>육각 스크루 드라이버</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 5497</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마</td><td>216763</td><td>4 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>VWR</td><td>12000-812</td><td>sterile, 10 &micro; l</td></tr><tr><td>젖산</td><td>Laboratoire MAT</td><td>LU-0200</td><td></td></tr><tr><td>RT MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 EASY-LOAD II 연동 펌프 및 77200-50 헤드</td><td>Cole Parmer</td><td>77200-60</td><td></td></tr><tr><td>MBEC(최소 생물막 박멸 농도) 분석 생물막 접종기 96웰 베이스</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td>Biofilm microtiter 플레이트</td></tr><tr><td>Oxford 한천 베이스</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXCM0856B</td><td>4 &deg에 매장; C</td></tr><tr><td>플라스틱 쿠폰 홀더</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2203</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 슬라이드 홀더 막대</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2203-GL</td><td></td></tr><tr><td>요오드화 칼</td>륨 <td>Fisher Chemical</td><td>P410-500</td><td>RT</td></tr><tr><td>정밀 일자 드라이버(1.5mm x 40mm)</td><td>Wiha</td><td>26015</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Laboratoire 보관 </td><td>RT</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius BCE822-1S Entris&reg의 MAT PF-0221 매장; II 기본 필수 탑로딩 밸런스</td><td>Cole Parmer</td><td>&nbsp; UZ-11976-3</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경 JSM-6360LV 모델</td><td>JEOL</td><td>JSM-6360LV</td><td>SEM 및 사용자 제어 인터페이스</td></tr><tr><td>나사 캡 튜브, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>(Lx&Oslash;): 120 x 17 mm, 재질: PP, 원뿔형 베이스, 투명, HD-PE</td></tr><tr><td>나사 캡 튜브, 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td>(Lx&Oslash;): 114 x 28 mm, 재질: PP, 원뿔형 베이스, 투명, HD-PE</td></tr><tr><td>나트륨 카코딜레이트 트리하이드레이트</td><td>전자 현미경 과학&</td><td>nbsp; 12300</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>나트륨 티오 황산</td>염 <td>Thermo Scientific</td><td>AC124270010</td><td>RT</td></tr><tr><td>Sonication bath</td><td>Fisher</td><td>15-336-122</td><td>5,7 L</td></tr><tr><td>전분 용액</td><td>Anachemia</td><td>AC8615</td><td>매장</td></tr> RT <tr><td>Sulic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258105-500ML</td><td>매장</td></tr> RT <tr><td>Tryptic soy 한천</td><td>BD Bacto</td><td>DF0369-17-6</td><td>RT 매장</td></tr>RT <tr><td>튜빙 Masterflex L/S 16 25'Cole</td> <td>Parmer</td><td>MFX0642416</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Masterflex L/S 18 25'Cole</td> <td>Parmer</td><td>MFX0642418</td><td></td></tr> Tygon SPT-3350 실리콘 튜빙에서 <tr><td>Tryptic soy broth</td><td>BD Bacto</td><td>DF0370-17-3</td><td>스토어</td></tr><tr><td>;</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABW18NSF</td><td>IDx OD: 1/4인치 x 7/16</td></tr>인치<tr><td>Vortex</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-04724-00</td><td></td></tr><tr><td>수조&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89202-970</td><td></td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

낙농 산업에서 생물막의 존재는 가공 공장에서 자주 사용되는 대부분의 CIP(clean-in-place) 절차에 대한 높은 내성으로 인해 안전하지 않고 변경된 유제품의 생산으로 이어질 수 있기 때문에 주요 관심사입니다. 따라서 낙농 산업을 위한 새로운 생물막 제어 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 정적 및 동적 방법의 조합을 사용하여 유제품 생물막을 박멸하기 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산 및 과락트산 및 상업용 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 합니다. 모든 소독제는 정적 고처리량 스크리닝 방법인 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석을 사용하여 단일 또는 혼합 생물막에서 가장 강력한 생물막 생성 박테리아에 대해 테스트되었습니다. 권장 농도의 소독제와 5분의 접촉 시간으로 단일 및 혼합 생물막을 모두 성공적으로 박멸했습니다. 현장 조건을 모방하는 동적 방법인 질병 통제 센터(CDC) 생물막 반응기를 사용하여 이러한 관찰을 확인하기 위한 연구가 현재 진행 중입니다. 이러한 유형의 생물 반응기는 대부분의 산업 장비 및 표면을 구성하는 스테인리스 스틸 표면을 사용할 수 있습니다. 반응기의 예비 결과는 생물막에 대한 유기 퍼옥시산의 효능을 확인하는 것으로 보입니다. 이 연구에서 설명된 결합된 접근 방식은 생물막을 제어하고 미생물을 박멸하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형을 개발하고 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.

SEM 분석은 생물막 마이크로플레이트 못 상에서 P. azotoformans PFl1A에 의해 생성된 생물막의 존재를 보여줍니다(그림 2A). 3차원 생물막 구조를 관찰할 수 있습니다. P. 아조토포르만스 PFl1A는 이전에 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 강력한 생물막 생산자(A570 &gt; 1.5)로 확인되었다12.
또한, 생물반응기를 이용하여 스테인리스 스틸 슬라이드 상에 형성된 P. azotoformans PFl1A 생물막은 매우 치밀한 것으로 나타났으며, 3차원 구조를 갖는 성숙한 생물막의 형태학적 특성을 나타내었다(도 2B). 또한, 동적 시스템에서 이 분리주에 의해 개발된 생물막의 박테리아 계수 결과는 TSB 배양 배지 및 멸균 탈지유에서 각...

이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

생물막 형성 미생물은 낙농 산업을 포함한 식품 산업의 주요 문제입니다. 제품의 품질에 부정적인 영향을 미치기 때문에 생물막 제어 전략을 개발하는 것이 중요합니다. 이 접근 방식은 정적 고처리량 스크리닝 방법과 현장 조건을 모방하는 동적 방법을 결합합니다.이 두 가지 방법은 생물막에 대한 소독제의 효능을 연구하는 데 상호 보완적입니다. 이 접근법은 식품, 의료 또는 환경 부문에서 생물막을 제어하기 위해 새로운 생물학적 또는 화학적 제형을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. Pseudomonas azotoformans 박테리아 배양 튜브를 vortexing하여 시작하십시오.100 마이크로리터의 박테리아 배양물을 10 밀리리터의 멸균 트립신 대두 브로스 또는 TSB 배지로 무균적으로 옮겨 밀리리터당 약 2배의 10 내지 7번째 CFU의 최종 농도를 달성한다. 배양 튜브를 소용돌이. 이어서, 다채널 피펫을 이용하여, 희석된 박테리아 배양물 150 마이크로리터를 생물막 마이크로타이터 플레이트 웰에 3배로 옮긴다.150마이크로리터의 TSB 배지를 대조군으로 3개의 새 웰에 로드합니다. 다음으로, 생물막 마이크로타이터 플레이트를 섭씨 30도에서 교반 없이 24시간 동안 배양한다. 마그네틱 바에 의해 홀더에 부착 된 1 리터 유리 비커 안에 평평한 블레이드를 넣기 전에 생물 반응기의 부품을 청소하고 자연 건조시킵니다.바이오리액터 뚜껑의 안쪽에 부착된 플라스틱 막대를 사용하여 설정을 똑바로 유지합니다. 드라이버를 사용하여 스테인리스 스틸 쿠폰이나 슬라이드를 폴리프로필렌 막대에 놓습니다. 쿠폰이나 슬라이드를 노치에 정렬 핀을 넣지 않고 뚜껑의 구멍에 삽입하여 살균 중에 증기가 빠져나갈 수 있도록 합니다.모든 생물 반응기 통풍구를 알루미늄 호일로 덮고 나머지 장비, 즉 크기 18 튜브 및 크기 16 튜브, 유리 흐름 브레이크, 용기 캡, 드라이버, 집게 및 0.2 마이크로 미터 필터를 알루미늄 호일로 감 쌉니다. 섭씨 121도에서 20분 동안 건조 사이클로 설정된 생물반응기를 오토클레이브합니다. 배치 모드에서 생물막 형성의 첫 번째 단계를 수행하려면 생물 안전 캐비닛 내부에서 크기 18 튜브의 한쪽 끝을 생물 반응기의 출구 스파우트에 연결하고 다른 쪽 끝을 알루미늄 호일로 싸서 유지합니다.바이오리액터 뚜껑으로부터 하나의 쿠폰 또는 슬라이드 홀더를 제거하고, 멸균된 50 밀리리터 튜브에 넣는다. 이어서, 50 밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여, 로드에 의해 점유된 구멍을 통해 300 밀리리터 TSB 배지의 340 밀리리터로 생물반응기 비커를 채운다. 생물 반응기에서 배양 배지를 접종하기 위해, 5 밀리리터 피펫을 사용하여 오리피스를 통해 밀리리터 당 8 번째 CFU에 10 밀리리터의 슈도모나스 아조 토 포르만스 박테리아 용액을 첨가하고 막대를 원래 위치로 되돌린다.핀이 각 노치에 맞도록 덮개 구멍에 이미 배치된 막대를 배치합니다. 그런 다음 바이오리액터 뚜껑에 있는 가장 작은 직경의 튜브 끝에 0.2마이크로미터 박테리아 공기 퍼지 필터를 놓습니다. 동일한 직경의 다른 튜브는 금속 나사 캡 또는 단단히 닫히는 실리콘 플러그로 영구적으로 막힌 상태로 유지됩니다.섭씨 30도로 설정된 가열판 위에 생물반응기를 24시간 동안 놓고 130RPM으로 교반합니다. 24시간 후, 연속 흐름 모드로 생물반응기에서 생물막 형성의 제2 단계를 수행한다. 18리터의 멸균 증류수가 들어 있는 카보이를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.그런 다음 리터당 1000 밀리그램의 TSB 배양 배지 2 리터를 첨가하여 리터당 100 밀리그램의 최종 농도를 얻습니다. 두 개의 튜브가 연결된 멸균 캡으로 용기를 덮으십시오. 첫 번째는 매체를 펌핑하기 위해 캡의 인터페이스에 고정된 실리콘 튜브입니다.두 번째는 크기 16 튜브가 외부 포트에 연결되어 액체가 바이오리액터로 흐를 수 있도록 합니다. 크기 16 튜브를 유리 흐름 브레이크의 끝단에 연결한 후 후자를 생물 반응기 뚜껑의 가장 큰 튜브에 다른 쪽 끝으로 삽입한 다음 연동 펌프에 크기 16 튜브를 설치합니다. 또 다른 20리터 카보이를 사용하여 생물 반응기에서 폐수를 수집합니다.생물 반응기 배출구에 연결된 튜브의 끝을 폐기물 용기의 캡에 부착합니다. 이 용기의 뚜껑에 있는 튜브에 0.2마이크로미터 필터를 삽입합니다. 완료되면 분당 11.3밀리리터의 유량으로 연동 펌프를 시작하고 시스템을 24시간 동안 작동 상태로 두십시오.24 시간 후, 연동 펌프를 끄고 바이오 리액터의 교반 및 가열을 중지하십시오. 박테리아 생물막을 회수하려면 40 밀리리터의 PBS에서 쿠폰 또는 슬라이드를 헹구어 플랑크톤 박테리아를 제거하십시오. 그런 다음 40 밀리리터의 PBS가 들어있는 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 방출합니다.30 초의 볼텍싱 후, 튜브를 40 킬로 헤르츠에서 30 초 동안 초음파 처리합니다. 이것을 세 번 반복하십시오. 완료되면 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 40 밀리리터의 생물막 현탁액을 수집하고 두 개의 멸균 PBS 용액으로 쿠폰 또는 슬라이드를 헹굽니다.이 헹굼 액체를 회수하여 이미 수집 된 생물막 현탁액에 첨가하십시오. 섭씨 30도에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼냅니다. 200 마이크로리터의 PBS를 96-웰 마이크로플레이트의 3개의 웰에 첨가한다.생물막을 세척하고 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해, 못 상에 형성된 생물막이 있는 생물막 마이크로플레이트의 뚜껑을 PBS가 들어 있는 96-웰 마이크로플레이트로 10초 동안 옮긴다. 필요한 농도의 소독제를 준비하고 각 소독제 농도의 200마이크로리터를 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 세 번 추가합니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 소독제가 들어 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트 위로 옮기고 원하는 노출 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.다음으로, 200 마이크로 리터의 Dey-Engley 중화 브로스를 새로운 96 웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 첨가하십시오. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 중화 브로스가 들어 있는 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. 마이크로타이터 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 30분 동안 40킬로헤르츠의 수조 초음파 처리기에 넣습니다.30분 후, 초음파 처리된 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 100마이크로리터의 분리된 생물막을 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 행으로 옮깁니다. 그런 다음 첫 번째 행을 제외하고 180 마이크로리터의 멸균 PBS를 96웰 플레이트에 추가합니다. 다음에, 20 마이크로리터의 생물막 용액을 제1 열로부터 180 마이크로리터의 PBS를 함유하는 제2 열의 웰로 옮겨 희석 10을 마이너스 1로 달성한다.그런 다음 두 번째 줄에서 다음 줄의 우물로 20 마이크로 리터를 옮겨 10에서 2를 뺀 희석을 달성하십시오. 이것을 반복하여 10에서 마이너스 5 사이와 10에서 마이너스 7 사이의 희석을 얻습니다. 원하는 희석액 100마이크로리터를 TSA에 접종하고 박테리아의 성장 매개변수에 따라 플레이트를 배양합니다.바이오리액터 내의 쿠폰 상에 슈도모나스 아조토포르만스 PFLA 1 생물막을 형성하고, 쿠폰을 담고 있는 막대를 제거하고, 30 밀리리터의 PBS를 함유하는 원뿔형 튜브 내부의 막대를 헹구어 플랑크톤 세포를 제거한다. 드라이버를 사용하여 각 쿠폰을 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 떨어 뜨립니다. 그런 다음 대조군을 위해 적절한 유기 퍼옥시산 용액 또는 PBS 4밀리리터를 추가합니다.배양 5 분 후, Dey-Engley 중화 국물 36 밀리리터를 첨가하십시오. 원뿔형 튜브를 30 초 동안 볼텍싱 한 후 40 킬로 헤르츠에서 30 초 동안 초음파 처리합니다. 이 과정을 3회 반복하여 생물막 현탁액을 얻었다.다른 막대에 대해 동일한 절차를 반복하고, 생물막 현탁액의 연속 망상을 준비하고, 앞에서 설명한 대로 TSA 배지에 현탁액을 플레이트합니다. SCM 분석은 슈도모나스 아조토포르만스 PFL1A에 의한 생물막 마이크로플레이트 못 상의 생물막의 존재를 보여주었다. 바이오리액터를 이용하여 스테인리스 스틸 슬라이드 상에 형성된 슈도모나스 아조토포르만스 PFL1A 바이오필름은 매우 치밀하게 나타났으며, 성숙한 3차원 바이오필름의 형태학적 특성을 나타내었다.동적 시스템에서 이 분리주에 의해 개발된 생물막의 박테리아 계수 결과는 TSB 배양 배지에서 제곱당 8.74 log CFU 및 멸균 탈지유에서 제곱당 7.86 log CFU 센티미터 제곱에 해당하는 상당한 세포 밀도를 보여주었습니다. B.vesicularis 분리 물로 얻은 결과는 영양소 농도가 리터당 100에서 900 밀리그램으로 증가하면 생물막의 박테리아 수가 6.11에서 8.71 log CFU 센티미터 제곱으로 증가한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 유속이 분당 6.0밀리리터로 감소되었을 때 상당한 생물막 성장이 관찰되었으며, 이는 특정 요인이 생물반응기 내의 생물막 형성에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다.생물막에는 유기 과산화 산과 500 ppm 및 100, 000 ppm의 접촉 시간에 검출 가능한 생존 세포가 포함되어 있지 않았으며, 과산화수소 농도의 소독제는 일반적으로 낙농 식물에 적용되었습니다. SCM은 처리되지 않은 최소 생물막 박멸 농도 또는 MBEC 생물막의 3차원 구조를 보인 반면, 처리된 MBEC 생물막은 3차원 형태를 잃었습니다. 이 프로토콜을 수행하는 동안 무균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.또한 사용자는 생성된 결과가 고유한 격리 및 소독제와 관련이 있음을 기억해야 합니다. 소독제와 기계적 진동, 초음파 또는 효소 처리를 병용하면 생물막 박멸의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 생물막을 형성하기 위해 정적 및 동적 방법을 사용하는 이 접근 방식은 연구자들이 다양한 분야에서 생물막을 더 잘 제어하기 위해 새로운 항생물막 제형을 선별하고 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 테이, S. B., et.al. 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 박테리아 세포 신호를 교란하는 효소를 도입하여 바이오필름 형성을 억제하는 과정을 보여줍니다. 이 효소는 박테리아가 세포외 고분자 물질을 생성하는 것을 막아, 유리 바닥 마이크로디시에서 바이오필름 발생을 감소시킵니다. 마지막으로, 형광 렉틴과 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 바이오필름 구조를 시각화합니다.

효소 매개 바이오필름 형성 억제의 현미경 평가

출처: Bucher, T. 외 B. subtilis 바이오필름을 소분자 바이오필름 억제제 특성 모델로 연구하는 방법론. J. Vis. 경험 (2016).이 영상은 바이오필름 매트릭스 무결성이 세균의 에탄올 내성에 미치는 영향을 미처리된 및 억제제 파괴된 바이오필름의 군락 형성 단위를 비교하여 보여줍니다. 억제제 처리 샘플에서 감소된 CFU는 세포외 기질이 바이오필름 내장된 세포를 항균 스트레스로부터 보호하는 데 필수적임을 보여줍니다.

바이오필름 매트릭스 무결성 평가를 위한 에탄올 저항성 분석법

이 동영상은 담즙염 유도 생물막 형성을 정량화하기 위한 형광 기반 방법을 보여줍니다. 병원성 장 세균의 배양에 담즙염을 첨가하면 생물막의 세포외 고분자 물질(EPS) 매트릭스의 다당류에 결합하는 형광 렉틴을 사용하여 생물막 생성이 감지됩니다.

EPS Matrix Detection을 통한 담즙염 유도 생물막 형성을 연구하기 위한 분석

이 비디오는 다중 웰 플레이트를 사용한 생물막 분산 분석을 보여줍니다. 완충액과 포도당 처리는 생물막을 분해하여 박테리아를 방출하는 반면, 담즙염은 스트레스를 유발하여 박테리아를 보호하는 세포외 고분자 물질에 유지합니다. 완충액과 포도당을 사용한 더 높은 분산은 성공적인 생물막 분해를 확인하며, 이는 집락 형성 단위 측정으로 추정됩니다.

Dispersion Assay를 통한 Biofilm 분해 검출

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