Name: Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 배우세요 개방형 장기 칩을 이용한 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성 방법을. 피부, 폐포, 기도, 장 등의 원발 조직에서 전층 장기 칩 배양을 수립하고 성숙시키는 이 기법은 생체 내 미세환경을 정밀하게 모방하여 조직 특이적 마커와 기능을 유지합니다.

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저자는 잠재적인 경쟁 이익으로 간주될 수 있는 다음과 같은 재정적 이해관계/개인적 관계를 선언합니다. Varone Antonio는 Emulate Inc.의 전 직원이며 Emulate의 지분을 보유할 수 있습니다.

Open-Top Chip은 제어된 미세 환경에서 내피, 간질 및 상피 사이에서 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 실시간으로 조사할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 이 기술은 유체 전단(흐름), 순환 스트레칭 및 마이크로패터닝을 통해 달성된 상피 표면 지형의 재구성을 포함하여 인체 조직 미세 환경을 재구성하는 것과 관련된 물리적 및 생화학적 단서의 통합과 같은 기존의 기관형 및 오가노이드 배양에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 이 플랫폼 내에서 성장하는 인간 세포는 상부 및/또는 하부 구획에서 유출된 유체(또는 유출물)를 사용하는 면역 조직화학 및 생화학적 분석을 포함한 기존 기술을 통해 분석할 수 있는 조직 특이적 기능을 요약하기 위해 시너지 효과를 발휘합니다. 현재의 디자인은 세포가 조직 특이적 섬유아세포 및 기타 간질 세포와 직접 접촉하여 성장하는 상피층에 쉽게 접근할 수 있도록 하여 상피 조직의 다세포 구조를 모방합니다. 특히, Open-Top Chip 프로토타입은 다른 장기 칩 플랫폼의 사용과...

역사적으로 과학자들은 신약 개발을 위해 전임상 동물 실험에 의존해 왔지만, 인간 결과와의 상관관계가 낮기 때문에 이러한 방법에 의문이 제기되는 경우가 점점 늘어나고 있다1. 동물 실험을 대체, 감소 및 개선하기 위한 "3Rs" 원칙의 구현은 과학자들이 전임상 약물 및 화학 독성 위험 평가를 지원하기 위한 새로운 체외 대체 방법을 찾도록 촉구합니다2. 그러나 현재까지 개발된 많은 체외 모델에는 인간 생체 기관의 역동적인 특성을 요약하는 데 필요한 생물학적 구조, 세포 복잡성 및 기계적 환경이 부족합니다 3,4.
기존의 체외 전임상 시스템은 일반적으로 단단한 플라스틱 표면에서 성장한 인간 세포의 2D 단일 배양을 사용합니다. 이러한 방법은 간단한 기계론적 연구를 수행하고 약물 후보를 신속하게 스크리닝할 수 있는 도구를 제공합니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 견고성으로 인해 2D 모델은 종종 자동 고처리량 시스템과 쌍을 이루며 약물 개발 프로세스 5,6의 초기 단계에서 잠재적인 약물 후보를 신속하게 식별하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 2D 모델은 개발 전임상 단계에서 약물 안전성 및 효능을 정확하게 예측하는 데 필요한 치료 후보에 대한 조직 수준, 장기 수준 또는 전신 반응을 모델링하기 위한 번역 접근 방식을 제공하지 않습니다. 편평 세포 배양은 인간 조직의 복잡한 다세포 상호작용, 생체역학적 특성 및 3차원(3D) 구조를 포함한 천연 조직 미세 환경을 재현하지 않는다7. 평평한 표면에서 자라는 세포는 종종 성숙한 표현형을 얻지 못하므로 천연 조직에서와 같이 약리학적 자극에 반응할 수 없습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 성장한 1차 인간 폐포 상피 세포는 편평 표현형을 나타내고 계면활성제 단백질 C 및 B(SP-C 및 SP-B)8를 포함한 주요 표현형 마커를 잃습니다. 불충분한 분화와 더불어, 일차 세포는 조직 염증과 관련된 특정 생화학적 경로가 기능을 상실하기 때문에 시험관 내에서 생물학적 스트레스 요인에 둔감해지는 경우가 많다9. 이러한 세포 기능의 손실은 주로 뻣뻣한 기질의 사용뿐만 아니라 폐 섬유아세포 및 평활근 세포와 같은 조직 특이적 기질 세포에 의해 자연적으로 방출되는 가용성 인자의 부족과 관련이 있는 것으로 보인다10,11.
화학-물리적 및 생물학적 복잡성의 부족이 시험관 내 세포의 생리적 거동을 제한한다는 것을 이해함으로써 보다 정교한 다세포 모델의 개발을 촉진했으며, 이는 신체 외부의 인간 조직의 복잡성을 더 잘 포착하는 것으로 입증되었습니다12,13. 1970년대 초에 최초의 공동 배양 모델이 만들어진 이래14, 합성 및 천연 하이드로겔의 도입은 천연 조직 미세 환경을 모방하는 능력을 크게 향상시켰고, 세포 분화를 유도하고, 세포의 자가 조직을 조직과 유사한 구조로 유도하며, 천연 조직 기능의 회복을 위한 귀중한 도구가 되었다15,16. 예를 들어, 적절한 3D 스캐폴드에서 성장할 때, 인간 세포는 스페로이드 또는 오가노이드와 같은 기능적 구조로 자가 배열되어 줄기 세포 마커를 발현할 수 있으며, 자가 재생이 가능하다17. 대조적으로, 인간 세포(줄기 세포 포함)는 전통적인 2D 기질에서 성장할 때 몇 번의 계대 후에 빠르게 노화되고 노화를 겪습니다18. 또한, 하이드로겔은 다공성, 공극 크기, 섬유 두께, 점탄성, 지형 및 강성과 같은 특정 조직 특성에 맞게 "맞춤형"으로 제작되거나 생리학적 또는 병리학적 상태를 에뮬레이션할 수 있는 조직 유래 세포 성분 및/또는 생리활성 분자로 추가로 조작될 수 있습니다19,20. 약물 검사에 대한 엄청난 잠재력에도 불구하고, 제약 연구에 사용되는 3D 하이드로겔 기반 모델은 생체 내 조직의 복잡한 세포 구조를 완전히 재현하지 못하며, 정수압, 순환 스트레칭 및 유체 전단을 포함하여 인체에 일반적으로 존재하는 중요한 혈역학적 및 기계적 자극이 부족합니다21.
장기 온 칩(Organs-on-chip, OOC)과 같은 미세생리학적 시스템(Microphysiological systems, MPS)은 최근 시험관 내에서 복잡한 생리학적 반응을 포착할 수 있는 도구로 등장했다 22,23. 이러한 모델은 종종 생체 기관의 동적 미세 환경을 모델링할 수 있는 미세 유체 플랫폼을 사용합니다.
우리는 3D 조직 생명 공학과 기계 생물학의 원리를 결합하여 복잡한 인간 상피 조직의 Open-Top Chip 모델을 만들었습니다. 이를 통해 우리는 상피 조직의 다세포 및 동적 미세 환경을 면밀히 요약할 수 있었습니다. 여기에는 생체 장기에 자연적으로 존재하지만 전통적인 체외 모델에서는 종종 무시되는 조직 특이적 생화학적 및 생체역학적 단서가 포함된다 24. Open-Top Chip은 다공성 멤브레인으로 분리된 혈관 구획(그림 1A)과 기질 구획(그림 1B)의 두 구획을 통합하여 두 챔버 사이에 영양분을 확산시킬 수 있습니다(그림 1C). 혈관 구획은 생리학적 전단 응력을 재현하기 위해 지속적인 유체 흐름에 노출되는 반면, 기질 챔버의 신축성 있는 설계는 호흡 운동 또는 장 연동 운동과 관련된 기계적 변형을 모델링할 수 있습니다. 기질 구획에는 조직 특이적 섬유아세포의 생리학적 성장을 지원하도록 설계된 조정 가능한 3D 하이드로겔 스캐폴드가 있습니다. 그것은 점막 조직의 인간 생리학을 더 잘 에뮬레이션 할 수있을뿐만 아니라 상피층에 직접 약물을 투여하기 위해 조직에 직접 접근 할 수있는 상태 인 공기 - 액체 계면의 확립을 용이하게하는 탈착식 뚜껑을 가지고 있습니다. 보충 그림 1은 치수 및 생물학적 구획(보충 그림 1A-D)과 이 프로토콜에 설명된 주요 기술 단계(보충 그림 1E)를 포함하여 Open-Top Chip 설계의 주요 구성 요소 중 일부를 캡처합니다.
Open-Top 칩의 관류는 프로그래밍 가능한 연동 펌프를 통해 이루어집니다(그림 1D). 연동 펌프 설정을 통해 12개의 Open-Top 칩을 동시에 관류할 수 있습니다. 대부분의 인큐베이터는 인큐베이터당 최대 24개의 칩을 배양할 수 있는 두 가지 설정을 수용할 수 있습니다. 기계적 스트레칭은 맞춤형 프로그래밍 가능한 진공 압력 조절기를 사용하여 이루어집니다(그림 1E). 디지털-아날로그 변환기에 의해 전자적으로 제어되는 전기 공압식 진공 조절기로 구성됩니다. 즉, 전기 공압식 진공 조절기는 사용자가 결정한 진폭과 주파수를 가진 정현파 진공 프로파일을 생성합니다. 0%에서 15% 범위의 주기적 변형률은 0에서 -90kPa 범위의 진폭과 0.2Hz의 주파수에서 Open-Top Chip의 진공 채널에 부압을 가하여 생성됩니다. 이는 이전에 채택되어 다른 논문25에서 기술된 상업적으로 이용 가능한 Flexcell Strain Unit과 동등한 맞춤형 시스템입니다. 예를 들어, 폐의 호흡 운동 또는 장의 연동 운동과 관련된 기계적 조직 변형을 모방하기 위해 공압 액추에이터는 인간 세포가 천연 조직에서 경험하는 변형률 및 빈도의 생리학적 수준과 일치하도록 크기와 진폭을 조정할 수 있는 정현파 진공/변형파를 적용합니다.
여기에서는 프로토타입 Open-Top Chip 플랫폼에서 유기형 상피 등가물을 엔지니어링하고 배양하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이를 통해 피부, 폐포, 기도 및 결장과 같은 복잡한 장기 모델을 생성할 수 있으며 혈관액 흐름과 기계적 스트레칭을 통합할 수 있습니다. 복잡한 상피 모델을 생성하기 위한 조직 공학 원리를 구현하는 동안 고려해야 하는 주요 기술적 측면을 간략하게 설명합니다. 우리는 현재 디자인의 장점과 가능한 한계에 대해 논의할 것입니다.
흐름 및 스트레칭 매개변수를 포함하여 조직 및 장기 성숙을 달성하는 데 사용되는 주요 단계에 대한 개요는 피부의 경우 그림 2, 폐포의 경우 그림 3, 기도의 경우 그림 4, 장의 경우 그림 5에 보고됩니다. 상이한 장기 모델을 배양하는 데 사용되는 배지 조성 및 시약에 관한 추가 정보는 보충 표에 포함되어 있습니다(피부에 대한 보충 표 1; 폐포에 대한 보충 표 2; 기도에 대한 보충 표 3 및 장에 대한 보충 표 4).

<table><tbody><tr><td>EMEM 10개&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-684F</td><td>중간; Stroma</td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>MicroGroup</td><td>316H18RW</td><td>튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 18RW 풀 하드&nbsp;</td></tr><tr><td>19 게이지 바늘</td><td>MicroGroup</td><td>316H19RW</td><td>튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 19RW 풀 하드</td></tr><tr><td>2-Stop PharMed BPT&nbsp;</td><td>콜-팔머&nbsp;</td><td>EW-95723-12</td><td>튜브, 0.25 mm, 12/팩</td></tr><tr><td>70% 에탄올 및 와이프&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>표면 살균용&nbsp;</td></tr><tr><td>8-Bromoadenosine 3&prime;,5&prime;-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>미디엄 보충제&nbsp;</td></tr><tr><td>가-83-01&nbsp;</td><td>토크리스&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>A9795</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM/F12&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Airway 상피 세포</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0016</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>폐포 세포</td><td>세포 생물학적 제제</td><td>H6621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ABCA3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB24751&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 [3C9]&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-아쿠아포린5 알렉사 플루어 647&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB215225&nbsp; &nbsp;</td><td>토끼 단클론 항체 [EPR3747]&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티-아쿠아포린5&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB92320&nbsp;</td><td>토끼 단클론 항체 [EPR3747]&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 베타 IV 튜뷸린&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB11315&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 [ONS.1A6]&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-CD31 (PECAM-1)&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB9498&nbsp;</td><td>마우스 단클론 [JC/70A] 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티-CK5&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB75869&nbsp;</td><td>토끼 재조합 단클론 [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>항-사이토케라틴 10&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>MA5-13705&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 (DE-K10)&nbsp;</td></tr><tr><td>항-사이토케라틴 14&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB7800&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-E-Cadherin&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB1416&nbsp; &nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 필라그린&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>PA5-79267&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티-HTI-56&nbsp;</td><td>테라스 바이오테크&nbsp;</td><td>TB-29AHT1-56&nbsp; &nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체(IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-HTII-280&nbsp;</td><td>테라스 바이오테크&nbsp;</td><td>TB-27AHT2-280&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체(IgM)&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-인볼루크린&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>MA5-11803&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체(SY5)&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 이소폼 TA p63-&alpha;, -&beta;, -&gamma; &nbsp; &nbsp;</td><td>바이오렝겐트&nbsp;</td><td>618902&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티-Ki67&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB8191&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 [B126.1]&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-램프3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB111090&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-미성숙 SP-B&nbsp;</td><td>세븐 힐&nbsp;</td><td>WRAB-48604&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-MUC5AC&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>PA5-34612&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>항 뮤신 -2&nbsp;</td><td>SantaCruz Biotechnology</td><td>sc-7314</td><td>마우스 단클론 항체 (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-p63&nbsp; &nbsp;</td><td>다코&nbsp;</td><td>GA662&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 p63 단백질(Dako Omnis)&nbsp; 클론 DAK-p63&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 PCNA&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>PA5-32541&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티 포도플라닌 (AT-1&alpha;)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB128994&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Pro + 성숙한 계면활성제 단백질 B&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB40876&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>항-계면활성제 C&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>세븐 힐&nbsp; &nbsp;</td><td>WRAB-9337&nbsp; &nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>항자궁글로빈/SCGB1A1&nbsp;</td><td>하이컬트 바이오테크&nbsp;</td><td>HM2178&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-VE-cadherin&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB33168&nbsp;</td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>안티-ZO-1&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>33-9100&nbsp;</td><td>마우스 단클론 항체 [1A12]&nbsp;</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>흡인 피펫&nbsp;</td><td>코닝 / 팔콘&nbsp;</td><td>357558&nbsp;</td><td>2 mL, 폴리스티렌, 개별 포장&nbsp;</td></tr><tr><td>흡인 팁&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>멸균(오토클레이브)&nbsp;</td></tr>PBS 솔루션의 <tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (10X)&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>37525년&nbsp;</td><td>차단제&nbsp;</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I</td><td>어드밴스드 바이오매트릭스</td><td>5133</td><td>10 mg/mL (Stroma)</td></tr><tr><td>콜라겐 I&nbsp;</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td>3 mg/mL (혈관 ECM)</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>시그마</td><td>&nbsp; C5533</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐-IV</td><td>시그마&nbsp;</td><td>C5533-5MG&nbsp;</td><td>인간 태반에서 추출한 콜라겐, 5 mg 분말, 1 mg/mL로 재구성;</td></tr><tr><td>결장 섬유아세포&nbsp;</td><td>세포 생물제제</td><td>&nbsp; H6231</td><td></td></tr><tr><td>결장 미세혈관 내피 세포</td><td>&nbsp; 세포 생물제제</td><td>H6203&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>15 mL 및 50 mL&nbsp; 폴리프로필렌, 멸균&nbsp;</td></tr><tr><td>크로스링커(ER-1)&nbsp;</td><td>모방&nbsp;</td><td>10461</td><td>5 mg 분말&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 딜락테이트)&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>D3571&nbsp;</td><td>DNA 프로브&nbsp;</td></tr><tr><td>피부 섬유아세포</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-010</td><td></td></tr><tr><td>피부 미세혈관 내피 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12&nbsp;</td><td>지브코&nbsp;</td><td></td><td></td>11320082</tr><tr><td>DMEM/F-12, 글루타MAX&nbsp; &nbsp;</td><td>지브코&nbsp;</td><td>10565-018&nbsp;</td><td>ALI 배지용 기저 배지&nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150105&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB175472&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150107&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>&nbsp; AB150073&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB175470&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150075&nbsp;</td><td>당나귀 안티-마우스 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>둘베코' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ 제외)&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>21-031-이력서&nbsp;</td><td>1배&nbsp;</td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGF) 인간, 대장</td>균 <td>재조합 PromoCell</td><td>C-60170</td><td>중간 보충제&nbsp;</td></tr><tr><td>F-12 햄' s</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>21700-108</td><td>혈관 ECM</td></tr><tr><td>FibriCol&nbsp;</td><td>고급 바이오매트릭스&nbsp;</td><td>5133-20ML&nbsp;</td><td>콜라겐-I 용액 (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>코닝</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴, 인간, 자연,&nbsp; &nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>47743-654&nbsp;</td><td>인간 혈장 피브로넥틴&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 팁 정밀 핀셋&nbsp;</td><td>아벤</td><td>18056미국&nbsp;</td><td>Technik 스타일 5B-SA 정밀 스테인리스강 핀셋</td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>21700-108</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 594)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150080&nbsp;</td><td>염소 안티 마우스 2차 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150115&nbsp;</td><td>염소 안티 마우스 2차 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (핏씨)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB6785&nbsp;</td><td>염소 안티 마우스 2차 항체&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG1 알렉사 플루어 568&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>A-21124&nbsp;</td><td>염소 안티-마우스 IgG1 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgM Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>A-21042&nbsp;</td><td>염소 안티-마우스 IgM 2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>휴대용 진공 흡입기&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>4930년&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>열 비활성화 HyClone FetalClone II 세럼 (FCS)&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>혈구계&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 소금</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Human [Leu15] - Gastrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>임상 절제</td><td></td>에서 얻은<td>인간 콜로노이드</td><td>임상 절제에서 얻은</td></tr><tr><td>인간 EGF 재조합 단백질&nbsp;</td><td>열</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>인간 상피 성장 인자&nbsp;</td><td>써모&nbsp;</td><td></td><td></td>PHG0311</tr><tr><td>HyClone FetalClone II 세럼 (미국) &nbsp;</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td>SH30066.02안녕&nbsp; &nbsp;</td><td>멸균 FBS&nbsp; 열 비활성화&nbsp;</td></tr><tr><td>하이드로코르티손 21-헤미숙시네이트 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손&nbsp;</td><td>프로모션셀&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>중간 보충제&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>얼음 양동이&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>이스마텍 IPC-N&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-78000-41</td><td>저속 디지털 연동 펌프; q24-채널 (12개 칩당 1개)</td></tr><tr><td>ITES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-839Z</td><td></td></tr><tr><td>케라티노세포 성장 인자 (KGF), 또는 Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7)로도 알려져 있음, 인간, HEK</td><td>PromoCell</td><td>C-63821</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>바이올라미나</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>라미닌, 521 CTG (CT521)&nbsp;</td><td>바이올라미나&nbsp; &nbsp;</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td>인간 재조합 라미닌 521&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>폐 섬유아세포</td><td>생물학 제제</td><td>H6013</td><td></td></tr><tr><td>폐 섬유아세포</td><td>생명선 세포 기술</td><td>FC-0049</td><td></td></tr><tr><td>폐 미세혈관 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>폐 평활근 세포</td><td>생명선 세포 기술</td><td>FC-0046</td><td></td></tr><tr><td>수동 카운터&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Masterflex(TPE) 트랜스퍼 튜빙&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>FV-96880-02</td><td>PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32"</td></tr><tr><td>OD 중간 199, 페놀 레드</td><td>없음 Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td>11043023</tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>1.5 mL, 멸균&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 (카메라 포함)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>명시야 이미징용&nbsp;</td></tr><tr><td>N2</td><td>시그마</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>시그마</td><td>A5099</td><td></td></tr><tr><td>노긴 (HEK293T 조건 미디엄)</td><td>시그마</td><td>N17001</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 세럼&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>50062Z&nbsp;</td><td>차단 솔루션&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>O-포스포스릴에탄올아민&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(4% wt/vol)&nbsp; &nbsp;</td><td>EMS&nbsp;</td><td>15710년&nbsp;</td><td>고정제&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>10,000 U/mL; 10 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫 팁&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>P20, P200 및 P1000&nbsp; 멸균, 낮은 접착력</td></tr><tr><td>피펫&nbsp;</td><td>길슨&nbsp;</td><td>&nbsp; F167380&nbsp;</td><td>P20, P200 및 P1000&nbsp;</td></tr><tr><td>PluriQ 세럼 교체품 (또는 대체적으로 KO 세럼 교체)</td><td>AMSBIO (또는 Thermo)</td><td>N/A (또는 C1910828010)</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 코팅 현미경 유리 슬라이드&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P0425&nbsp;</td><td>유리 슬라이드&nbsp;</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold&nbsp; &nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td>P36931&nbsp;</td><td>DAPI를 사용한 안티페이드 마운트앤트;</td></tr><tr><td>레티노산&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y27632)</td><td>Tocris</td><td>TB1254-GMP/10</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin (HEK293T 조건 미디엄)</td><td>Sigma</td><td>SCC111</td><td></td></tr><tr><td>SAGM SingleQuots 보충제&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4124</td><td></td></tr><tr><td>SAGMTM 소기도 상피 세포 성장 매체 BulletKitTM&nbsp;</td><td>론자&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td>중간 보충제&nbsp;</td></tr><tr><td>SB2001190&nbsp;</td><td>토크리스&nbsp;</td><td>1264/10</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>2 mL, 5 mL, 10 mL, 그리고 25 mL 저 내독소, 멸균;</td></tr><tr><td>소기도 상피 세포 성장 배지 (SAGM)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>용제 완충액 (ER-2)&nbsp;</td><td>모방&nbsp;</td><td>10462</td><td>25 mL 병&nbsp;</td></tr><tr><td>스테리플립-HV&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>멸균 필터링 원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>sterilin 100 mm 스퀘어 페트리 접시</td><td>Thermo</td><td>103</td><td>멸균, 6개 당 1개&nbsp;</td></tr><tr><td>T25 플라스크&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>T75 플라스크&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>트리-요오드티로닌</td><td>시그마</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100 (0.3% (vol/vol)&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T8787&nbsp;</td><td>투과화제&nbsp;</td></tr><tr><td>트리판 블루&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>93595&nbsp;</td><td>0.4% 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypEE 솔루션&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>12604013&nbsp;</td><td>세포 분리 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P2287&nbsp;</td><td>투과화제&nbsp;</td></tr><tr><td>UV 라이트 오븐 (피크 주파수 365nm, 100 &micro의 강도; J/cm2)</td><td>VWR</td><td>21474-598</td><td>UVP, 장거리 UV, 365 nm 60Hz 모델 CL-1000L</td></tr><tr><td>진공 설정&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>최소 압력: -70 kPa&nbsp;</td></tr><tr><td>혈관 내피 성장 인자 165 (VEGF-165) 인간, 대장</td>균 <td>재조합 PromoCell</td><td>C-64420</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-165&nbsp; &nbsp;</td><td>프로모션셀&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>중간 보충제&nbsp;</td></tr><tr><td>Von Willebrand Factor conjugated FITC&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB8822&nbsp;</td><td>양 다클론 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>수조(또는 구슬)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>37 &deg;로 설정합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>Wnt3A (L-Wnt3A 조건화 매체)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr></tbody></table>

reconspartuting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

거의 모든 인간 장기에는 3차원(3D) 구조로 구성된 밀접하게 연결된 세포의 하나 또는 여러 층으로 구성된 상피 조직이 늘어서 있습니다. 상피의 주요 기능 중 하나는 밑줄 조직을 물리적 및 화학적 손상 및 감염원으로부터 보호하는 장벽을 형성하는 것입니다. 또한 상피는 영양소, 호르몬 및 기타 신호 분자의 수송을 매개하여 종종 장기 내에서 세포 위치 지정 및 구획화를 안내하는 생화학적 구배를 생성합니다. 장기 구조와 기능을 결정하는 중심적인 역할로 인해 상피는 동물 모델에 의해 항상 포착되지 않는 많은 인간 질병에 대한 중요한 치료 표적입니다. 명백한 종 간 차이 외에도 동물에서 상피의 장벽 기능 및 수송 특성에 대한 연구 연구는 살아있는 시스템에서 이러한 조직에 접근하는 것이 어렵기 때문에 더욱 복잡해집니다. 2차원(2D) 인간 세포 배양은 기본적인 과학적 질문에 답하는 데 유용하지만 생체 내 예측이 좋지 않은 경우가 많습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 10년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)으로 알려진 수많은 마이크로 엔지니어링 생체 모방 플랫폼이 전통적인 체외 및 동물 실험에 대한 유망한 대안으로 부상했습니다. 여기에서는 피부, 폐 및 내장을 포함한 장기 특이적 상피 조직을 모델링하기 위해 설계된 플랫폼인 Open-Top Organ-Chip(또는 Open-Top Chip)에 대해 설명합니다. 이 칩은 기계적 활성 시스템 내에 조직 특이적 섬유아세포와 내피 세포를 통합하여 3D 기질 구성 요소를 재현하는 기능을 포함하여 상피 조직의 다세포 구조와 기능을 재구성할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 Open-Top Chip은 단일 세포에서 다층 조직 구조에 이르기까지 여러 규모의 해상도에서 상피/중간엽 및 혈관 상호 작용을 연구하기 위한 전례 없는 도구를 제공하여 건강 및 질병에서 상피 기관의 세포 간 누화의 분자 해부를 가능하게 합니다.

표면 마이크로패터닝 세포외 기질(ECM)의 마이크로패터닝은 장 음와 인터페이스의 공간 구성을 복제하는 데 사용할 수 있습니다. Open-Top Chip 구성은 결장 상피-기질 경계면(그림 6A,B)과 마이크로미터 규모의 장 선와(그림 6C-E)의 자연 지형을 모방하도록 특별히 설계된 미세 패턴 스탬프를 통합하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 피부, 기도 및 폐포 모델에 대해 평평한(패턴이 없는) 표면을 사용했다는 점에 유의하십시오. 이 경우 상피세포에 씨드하여 균일한 하이드로젤 표면을 얻기 위해 스탬프를 사용하였다. 우리는 장 점막의 자연 구조를 모방할 수 있는 디자인을 선택했으며, 장 내부를 모방한 양성 돔과 음성 돔의 교대로 구성되었습니다.
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현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

전통적인 확산 배양 방법은 종종 살아있는 장기의 복잡한 환경을 재현하지 못하여 조직 특이적 마커와 기능의 상실로 이어집니다. 우리는 확산 배양과 미세 유체 원리를 결합하여 상피 조직의 미세 환경을 밀접하게 모방하는 개방형 칩을 개발했습니다. 살아있는 장기에 자연적으로 존재하지만 전통적인 체외 모델에서는 종종 무시되는 생화학적 및 생체역학적 신호를 포함함으로써 개방형 칩은 폐쇄형 시스템 간의 더 나은 대안을 나타냅니다.이 절차를 시연하는 것은 오늘 내 실험실의 연구생 인 Adya Panchal이 될 것입니다. 시작하려면 필요한 시약을 얼음 위의 생물 안전 캐비닛 아래로 가져옵니다. 조직 특이적 중간엽 세포를 배양하여 80%에서 90%의 밀도를 얻은 다음 제조업체의 권장 사항에 따라 트립신 또는 기타 방법을 사용하여 세포를 해리합니다.세포를 250g에서 섭씨 24도에서 5분 동안 펠렛화합니다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 225X EMEM 및 재구성 완충액의 각각 10마이크로리터에 재현탁합니다. 피펫팅으로 세포를 혼합하고 1, 800 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 콜라겐 1 용액을 첨가하십시오.다음으로, 얼음 위에서 프리겔 용액을 5-6회 피펫팅하여 혼합합니다. 프리겔 용액을 18마이크로리터의 일반 수산화나트륨으로 중화하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 기포를 피하면서 150마이크로리터의 셀 함유 하이드로겔을 오픈 탑 칩의 중앙 챔버에 피펫팅합니다. 각 페트리 접시에 2 밀리리터의 멸균 이중 증류수로 채워진 원심 분리기 튜브 캡을 포함하여 칩을 별도의 페트리 접시로 그룹화하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 페트리 접시를 배양합니다.스트로멀 하이드로겔의 표면 마이크로패터닝을 수행하기 위해, 멸균된 3D 프린팅 스탬프의 패터닝된 표면에 중화된 콜라겐 1 프리겔 용액 20마이크로리터를 피펫팅하고, 스트로말 하이드로겔이 여전히 액체 형태인 상태에서 오픈 탑 챔버 내부에 스탬프를 삽입합니다. 흡전기를 사용하여 개방형 챔버 상단에서 쏟아질 수 있는 하이드로겔 잔류물을 제거합니다. 앞에서 설명한 것처럼 모든 칩을 물로 채워진 원뿔형 튜브 캡이 있는 별도의 페트리 접시로 그룹화합니다.그리고 모든 페트리 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 90분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 칩을 생물 안전 캐비닛 아래로 다시 가져오고 정밀 핀셋을 사용하여 스탬프를 부드럽게 제거하여 하이드로겔 손상 위험을 줄입니다. 배양된 세포가 80%에서 90%의 밀도에 도달하면 세포 제공자가 권장하는 단백질 분해 효소 절차를 사용하여 세포를 해리합니다.해리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상피 세포를 원고에 기재된 바와 같은 적절한 세포 단편 밀도로 재현탁시킨다. 상피 세포를 시딩하기 위해, 칩을 인큐베이터로부터 생물 안전 캐비닛으로 옮기고, 100 마이크로리터의 신선한 상피 세포 배양 배지로 기질 표면을 3회 헹구어 과량의 코팅 용액을 제거한다. 헹굼 배지가 흡인되면 적절한 세포 밀도를 사용하여 50 마이크로 리터의 상피 세포 현탁액으로 하이드로 겔 표면을 시드 한 다음 칩을 다시 2 시간 동안 인큐베이터로 옮깁니다.세포 파편을 제거하려면 세포 배양 배지로 하이드로겔 표면을 부드럽게 두 번 헹구고 밀봉된 오토클레이브 용기에서 오토클레이빙하여 배지를 새로 고친 다음 칩을 연동 펌프에 연결합니다. 연동 펌프를 일시 중지하고 펌프에서 칩을 조심스럽게 분리한 다음 칩 하우징 캐리어를 빼냅니다. 칩을 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮긴 후 상단 저장소에 남아있는 배지의 부피를 제거하십시오.그런 다음 상단 미세유체 채널에서 모든 배지를 부드럽게 흡인하고 바인더 클립을 사용하여 상단 입구에 연결된 짧은 미세유체 튜브를 고정하여 매체 증발 및 공기-액체 계면(ALI)의 유지를 줄입니다. 하우징 캐리어의 개방형 칩을 인큐베이터에 다시 놓습니다. 칩을 연동 펌프에 다시 연결하고 연동 펌프를 시작하여 흐름을 재개합니다.혈관 챔버를 내피 세포 배양 배지로 헹구고 25 마이크로 리터의 내피 세포 현탁액을 시드합니다. 칩을 거꾸로 뒤집어 내피 세포가 미세유체 챔버의 상부 표면에 부착되도록 합니다. 칩을 페트리 접시로 그룹화하십시오.앞서 설명한대로 인큐베이터에 다시 넣고 내피 세포가 1 시간 동안 부착되도록합니다. 배양이 끝나면 칩을 배양기에서 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 혈관 채널을 내피 세포 배양 배지로 두 번 헹구어 세포 파편을 제거합니다. 혈관 채널의 바닥 표면에 내피 세포의 부착을 촉진하기 위해 칩을 평평하게 놓습니다.혈관 배지 저장소를 생물 안전 캐비닛 아래의 탈기된 혈관 세포 배양 배지로 채웁니다. 칩을 칩 하우징 캐리어 내부에 다시 넣고 칩을 한쪽 끝의 중간 저장소와 다른 쪽 끝의 연동 펌프에 다시 연결합니다. 미세 유체 연결을 검사하여 모든 칩이 올바르게 연결되어 있고 중간 물방울이 보이지 않는지 확인합니다.그런 다음 연동 펌프를 시작하여 유체 흐름을 재개합니다. 세포가 있거나 없는 미세 패턴의 젤 표면이 시각화됩니다. 조직학적 분석 결과 성숙한 다층 층화 표피가 칩 상에서 분화되는 것으로 나타났습니다.피부 칩의 평면도 사진은 진피층 내부에 섬유아세포의 존재를 보여주었다. PECAM-1, VE-cadherin, von Willebrand는 open-top skin chip에서 공동 배양한 인간 미세혈관 내피세포의 분화를 보여주었다. MUC5AC, 알파 및 베타 튜불린, 클로로세포 단백질 16, p63, 및 ZO-1 형광 염색은 성숙한 기도 상피를 나타내었다.박동 섬모 및 분화된 성숙한 유사 층화 상피가 개방 상부 기도 칩에서 관찰되었습니다. Type I, Type II 및 E-cadherin 형광 염색은 칩 상에 성숙한 폐구의 존재를 보여주었다. 전자 현미경은 성숙한 폐포 표현형의 증거인 미세 융모 및 리소좀 소포의 존재를 밝혀냈습니다.조직학적 분석은 I형 표현형과 일치하는 편평한 편평 세포, II형 표현형과 일관된 입방체 조약돌 유사 세포 및 진피층 내부의 섬유아세포의 존재를 보여주었습니다. 장세포 및 성숙한 잔의 존재는 뮤신 2 및 E-cadherin 염색에 의해 확인되었다. 진피층 내부의 섬유아세포는 단순한 원주형 상피의 존재를 확인하였다.모든 시약은 차가워야 하며 젤 표면은 균일한 표면을 얻기 위해 적절하게 헹궈야 합니다. 균일한 세포 접착력과 조밀한 오염 단층 및 혈관벽을 얻기 위해 부착되지 않은 세포와 파편을 제거하는 것이 중요합니다. 유사한 접근법을 사용하여 장 및 폐와 같은 다른 유형의 상피 기관 모델을 생성하여 특정 약물 또는 환경 요인이 상피 및 혈관 장벽 기능에 특히 중점을 두고 인간 조직의 항상성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 평가할 수 있습니다.기질 구획의 효능 단계에 쉽게 접근할 수 있게 되면서 연구를 통해 이제 특정 얼굴 패턴을 생성하고 다른 장치로는 달성하기 어려운 크립트비베올리와 같은 기능적 조직 구조를 재현할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

여기에서는 최대 28일 동안 미세유체 다기관 칩에서 일차 세포, 조직 모델 및 펀치 생검을 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 인간 피부 미세혈관 내피 세포, 간 응집체 및 피부 생검이 공통 매체 순환에서 성공적으로 결합되었습니다.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

이 간행물 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접 정량화에 대 한 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제작을 설명합니다. 유효성 검사, 혈액-뇌 장벽 안쪽이 미세 장치 유사 했다 및 장벽 기능 모니터링 했습니다. 전극 통합 및 직접 TEER 정량화에 대 한 제시 방법 일반적으로 적용 됩니다.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

여기, 우리 stretchable, 듀얼 채널의 제작, 기관 수준 기능 체 외업과 위한 기관 칩 미세 세포 문화 장치를 설명 하는 프로토콜을 제시.

Stretchable, 듀얼 채널, 미세 기관 칩의 확장 가능한 제작

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

폴리디메틸실록산(PDMS) 칩 장치의 막을 위한 방수 실리콘 기반 밀봉을 위한 새로운 밀봉 프로토콜. 실험실, 칩 모델 설정 및 소규모 칩 플랫폼 개발을 위한 것입니다. 우리는 플라스틱 및 천연 조직 막을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 PDMS, 톨루엔, 몰드, 멤브레인, 진공 챔버만 필요합니다.

유연하고 신뢰할 수 있는 접착을 위한 접근 가능한 실리콘 칩-멤브레인 밀봉 절차

배우세요 개방형 장기 칩을 이용한 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성 방법을. 피부, 폐포, 기도, 장 등의 원발 조직에서 전층 장기 칩 배양을 수립하고 성숙시키는 이 기법은 생체 내 미세환경을 정밀하게 모방하여 조직 특이적 마커와 기능을 유지합니다.

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