실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법
2022년 12월 9일
다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.
실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE는 다발성 경화증 환자에 대한 새롭고 개선된 치료법을 개발하기 위해 사용되는 동물 모델이다. EAE에서 질병을 유도하려면 일관된 결과를 얻기 위해 완벽한 오일 및 물 에멀젼이 필요합니다. 여기에 제시된 에멀젼 제조 방법은 인간의 영향을받지 않으므로 한 실험에서 다른 실험으로의 불일치를 제한합니다.
이 방법은 EAE에 최적화되었지만 다른자가 면역 질환 모델 및 암 백신 테스트에도 사용할 수 있습니다. CFA 슬러리를 100 밀리그램의 동결건조된 M 결핵 H37 RA 및 5개, 3.2 밀리미터 스틸 비드를 7 밀리리터 튜브로 제조하였다. 최고 속도 설정에서 60 초 동안 균질 기의 튜브를 흔 듭니다.
튜브에 5 밀리리터의 IFA 보조제를 넣고 최고 속도로 60 초 동안 다시 흔 듭니다. 그런 다음 슬러리를 피펫으로 새 튜브로 옮기고 비드를 남기고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. CFA/펩타이드 에멀젼을 준비하려면 보충 파일 1을 다운로드하여 각 시약에 필요한 양을 계산하십시오.
그런 다음 스크류 캡핑 튜브와 사용할 시약을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로 에멀젼 성분을 첨가하십시오. 먼저 PBS, 이어서 펩타이드, CFA 슬러리.
마지막으로 IFA입니다. 튜브를 여러 번 조이고 풀어 캡으로 단단히 닫습니다. 시약을 미리 혼합하기 위해 손으로 5-10초 동안 튜브를 세게 흔듭니다.
튜브를 흔들리는 균질화기에 넣고 막대로 고정합니다. 속도를 최고 설정으로 설정하고 시간을 60초로 설정합니다. 달리기가 끝나면 튜브를 얼음 위에 3 분 동안 놓고 동일한 설정으로 한두 번 더 달리기를 반복하십시오.
튜브를 300G에서 1분에서 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 에멀젼을 압축합니다. 튜브에서 캡을 제거하십시오. 플런저를 튜브에 삽입하고 에멀젼 상단에 도달 할 때까지 천천히 아래로 누릅니다.
튜브 바닥에 있는 스냅 오프 인클로저를 비틀어 제거합니다. 다음으로 모든 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기에 바늘을 추가합니다. 그런 다음 주사기 뒷면을 튜브 바닥의 전용 잠금 장치에 부착하고 짧게 비틀어 잠급니다.
플런저를 부드럽게 밀어 튜브에서 주입 주사기로 에멀젼을 옮깁니다. 에멀젼이 주사기의 0.15 밀리리터 눈금에 도달하면 중지하십시오. 튜브에서 주사기를 분리하고 이 주사기에 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 플런저를 조심스럽게 삽입합니다.
에멀젼이 바늘에서 나올 때까지 플런저를 밀고 튜브에 존재하는 나머지 에멀젼에 대해 이 과정을 반복합니다. 물과 기름 입자의 크기를 분석하려면 현미경 슬라이드에 에멀젼의 작은 방울을 추가하고 커버 슬립으로 번진 다음 원을 그리며 세게 밀어 에멀젼을 평평하게 만듭니다. 400배 배율의 위상차 현미경으로 얼룩진 에멀젼을 검사하고 에멀젼의 단층이 있는 필드에 초점을 맞춥니다.
작고 균일 한 회색 또는 흰색 입자가 보이는지 확인하십시오. 균질화 방법에 의해 생성 된 에멀젼은 물과 오일 에멀젼의 작은 방울을 나타내는 회색 또는 흰색 콩 모양의 입자를 표시했습니다. 대조적으로, 주사기 방법을 사용하여 생성 된 에멀젼 방울은 더 크고 넓었다.
와류 방법에서, 에멀젼에 갇힌 기포에 상응하는 큰 회색 또는 검은 색 입자가 관찰되었다. 물 및 오일 에멀젼에 대한 레이저 굴절 입자 크기 분석기를 사용하여 측정한 시간 경과에 따른 입자 크기 분포의 변화는 6주 동안 입자 크기의 변화를 나타내지 않았습니다. 신선한 3주령 및 15주령의 에멀젼은 모두 실험 전반에 걸쳐 시험된 모든 동물에서 유사한 EAE 질환을 유도하였다.
마우스는 모든 실험에서 유사한 질병 패턴을 개발하여 여기에 제시된 균질화 방법이 일관되고 재현 가능한 방식으로 EAE를 유도하는 에멀젼을 생성한다는 것을 밝혔습니다. 실험을 위해 에멀젼을 만들기 전에 보충 파일 번호 1을 다운로드하여 낭비를 최소화하는 데 필요한 각 구성 요소의 양을 계산하십시오. 여기에 제시된 방법은 전임상 연구뿐만 아니라 향후 클리닉에서 암 백신을 준비하기 위해 에멀젼 제제를 표준화하는 데 사용될 수 있습니다.
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개요
본 논문은 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위한 수중유형(water-in-oil) 에멀젼 제조의 표준화된 방법을 제시합니다. 이 방법은 에멀젼 제조 과정 중 인위적인 영향을 최소화하여 결과의 변동성을 줄이는 것을 목적으로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 자가면역질환 연구
배경
- 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증 연구에 활용됩니다.
- 일관된 에멀젼 조제는 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다.
- 기존 방법들은 변동성이 커 재현성에 영향을 줄 수 있습니다.
- 본 연구에서는 신속하고 간편한 균질화 프로토콜을 소개합니다.
연구 목적
- 에멀션 조제물을 위한 표준화된 방법을 제시합니다.
- EAE 유도의 가변성을 줄입니다.
- 다른 자가면역 모델 및 암 백신 테스트에 적용 가능한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 동결 건조된 M tuberculosis H37 RA를 이용한 CFA 슬러리 제조.
- 유제 조제를 위한 스틸 비드 및 균질기 사용.
- 일관성을 위한 교반 시간 및 속도의 최적화.
- 해당 방법의 EAE 및 기타 모델로의 적용.
주요 결과
- 이 방법은 EAE 유도에 적합한 안정적인 에멀션을 생성했습니다.
- 인적 영향의 감소로 인해 더욱 일관된 실험 결과가 도출되었습니다.
- 다른 자가면역 질환 모델에 대한 적용 가능성을 입증했습니다.
- 암 백신 테스트에서의 잠재적 활용 가능성이 확인되었습니다.
결론
- 표준화된 에멀젼 조제 방법은 EAE 연구의 재현성을 높여줍니다.
- 이 접근 방식은 다양한 연구 응용 분야에 맞게 조정될 수 있습니다.
- 향후 연구에서 실험 결과를 개선하기 위해 본 프로토콜을 활용할 수 있을 것입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
표준화된 항원/면역증강제 유제(emulsion) 제조는 다발성 경화증 약물 발견의 핵심 전임상 모델인 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)의 재현 가능한 유도를 위해 매우 중요합니다. 이 균질화 기반 방법은 작업자 간의 변동성을 최소화하여, 초기 발견 단계에서 강력한 타겟 검증과 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다. 신뢰할 수 있는 유제 품질은 자가면역 및 면역 요법 프로그램의 예측 신뢰도와 포트폴리오 분류(triage)에 직접적인 영향을 미칩니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 신경면역학의 기능적 표적 검증을 위해 일관된 EAE 유도를 가능하게 합니다.
- 항원 전달 및 면역 활성화를 표준화하여 기전적 모호성을 줄여줍니다.
- 질병 관련 전임상 모델에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
- 재현 가능한 생물학적 결과를 보장함으로써 포트폴리오 우선순위 결정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 면역화 워크플로우를 위해 검증된 에멀젼을 준비합니다.
- 연구 전반의 분석 재현성과 표준화를 개선합니다.
- 에멀젼 입자 크기와 안정성의 정량적 평가를 가능하게 합니다.
- 다기관 연구를 위한 확장 및 전송 가능한 프로토콜을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- EAE 모델 유도를 질환 관련 중개 엔드포인트와 일치시킵니다.
- 배치 간 변동성을 최소화하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 보장합니다.
- 강력하고 재현 가능한 질환 모델을 제공하여 연구 진행 결정의 리스크를 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 균질화 방법은 초기 발견과 전임상 모델 개발의 접점에 통합되어, 가설 검증부터 리드 물질 발굴에 이르는 워크플로우를 지원합니다.
- 발견 생물학: 가설 기반의 면역 활성화 연구를 위해 항원/면역증강제 전달 방식을 표준화합니다.
- 스크리닝: EAE 모델에서 화합물 또는 생물학적 제제의 신뢰할 수 있는 평가를 위해 재현성 있는 유제(emulsion)를 제공합니다.
- 분석: 품질 관리를 위한 정량적 입자 크기 분석 및 안정성 모니터링을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 바이오마커 및 효능 연구를 위해 질환 모델의 충실도를 유지합니다.
- 기업적 재사용: 다른 자가면역 및 면역치료 모델에 적용 가능한, 작업자 독립적인 확장 가능 프로토콜을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 자가면역 모델 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 불확실성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 팀 전반에 걸쳐 표준화되고 재현 가능하며 확장 가능한 에멀션 조제 방법을 제공합니다.
- 전략적 가치: 실험 변동성을 최소화하여 go/no-go 결정의 품질과 자본 효율성을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 면역학 및 신경 염증 자산의 위험 조정 우선순위 지정 및 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 균질기 작동 및 에멀전 품질 평가에 대한 기술적 전문 지식이 필요합니다.
- QC를 위해 쉐이킹 균질기, 위상차 현미경 및 입자 크기 분석기 사용이 가능해야 합니다.
- 시약 계산 및 취급 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 자가면역 또는 면역 치료 모델을 위해 여러 항원 및 면역 증강제에 적용 가능합니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 초기 장비 투자 비용과 재현성을 위한 프로토콜 준수가 있습니다.
