실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법
December 9th, 2022
다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.
실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE는 다발성 경화증 환자에 대한 새롭고 개선된 치료법을 개발하기 위해 사용되는 동물 모델이다. EAE에서 질병을 유도하려면 일관된 결과를 얻기 위해 완벽한 오일 및 물 에멀젼이 필요합니다. 여기에 제시된 에멀젼 제조 방법은 인간의 영향을받지 않으므로 한 실험에서 다른 실험으로의 불일치를 제한합니다.
이 방법은 EAE에 최적화되었지만 다른자가 면역 질환 모델 및 암 백신 테스트에도 사용할 수 있습니다. CFA 슬러리를 100 밀리그램의 동결건조된 M 결핵 H37 RA 및 5개, 3.2 밀리미터 스틸 비드를 7 밀리리터 튜브로 제조하였다. 최고 속도 설정에서 60 초 동안 균질 기의 튜브를 흔 듭니다.
튜브에 5 밀리리터의 IFA 보조제를 넣고 최고 속도로 60 초 동안 다시 흔 듭니다. 그런 다음 슬러리를 피펫으로 새 튜브로 옮기고 비드를 남기고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. CFA/펩타이드 에멀젼을 준비하려면 보충 파일 1을 다운로드하여 각 시약에 필요한 양을 계산하십시오.
그런 다음 스크류 캡핑 튜브와 사용할 시약을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로 에멀젼 성분을 첨가하십시오. 먼저 PBS, 이어서 펩타이드, CFA 슬러리.
마지막으로 IFA입니다. 튜브를 여러 번 조이고 풀어 캡으로 단단히 닫습니다. 시약을 미리 혼합하기 위해 손으로 5-10초 동안 튜브를 세게 흔듭니다.
튜브를 흔들리는 균질화기에 넣고 막대로 고정합니다. 속도를 최고 설정으로 설정하고 시간을 60초로 설정합니다. 달리기가 끝나면 튜브를 얼음 위에 3 분 동안 놓고 동일한 설정으로 한두 번 더 달리기를 반복하십시오.
튜브를 300G에서 1분에서 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 에멀젼을 압축합니다. 튜브에서 캡을 제거하십시오. 플런저를 튜브에 삽입하고 에멀젼 상단에 도달 할 때까지 천천히 아래로 누릅니다.
튜브 바닥에 있는 스냅 오프 인클로저를 비틀어 제거합니다. 다음으로 모든 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기에 바늘을 추가합니다. 그런 다음 주사기 뒷면을 튜브 바닥의 전용 잠금 장치에 부착하고 짧게 비틀어 잠급니다.
플런저를 부드럽게 밀어 튜브에서 주입 주사기로 에멀젼을 옮깁니다. 에멀젼이 주사기의 0.15 밀리리터 눈금에 도달하면 중지하십시오. 튜브에서 주사기를 분리하고 이 주사기에 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 플런저를 조심스럽게 삽입합니다.
에멀젼이 바늘에서 나올 때까지 플런저를 밀고 튜브에 존재하는 나머지 에멀젼에 대해 이 과정을 반복합니다. 물과 기름 입자의 크기를 분석하려면 현미경 슬라이드에 에멀젼의 작은 방울을 추가하고 커버 슬립으로 번진 다음 원을 그리며 세게 밀어 에멀젼을 평평하게 만듭니다. 400배 배율의 위상차 현미경으로 얼룩진 에멀젼을 검사하고 에멀젼의 단층이 있는 필드에 초점을 맞춥니다.
작고 균일 한 회색 또는 흰색 입자가 보이는지 확인하십시오. 균질화 방법에 의해 생성 된 에멀젼은 물과 오일 에멀젼의 작은 방울을 나타내는 회색 또는 흰색 콩 모양의 입자를 표시했습니다. 대조적으로, 주사기 방법을 사용하여 생성 된 에멀젼 방울은 더 크고 넓었다.
와류 방법에서, 에멀젼에 갇힌 기포에 상응하는 큰 회색 또는 검은 색 입자가 관찰되었다. 물 및 오일 에멀젼에 대한 레이저 굴절 입자 크기 분석기를 사용하여 측정한 시간 경과에 따른 입자 크기 분포의 변화는 6주 동안 입자 크기의 변화를 나타내지 않았습니다. 신선한 3주령 및 15주령의 에멀젼은 모두 실험 전반에 걸쳐 시험된 모든 동물에서 유사한 EAE 질환을 유도하였다.
마우스는 모든 실험에서 유사한 질병 패턴을 개발하여 여기에 제시된 균질화 방법이 일관되고 재현 가능한 방식으로 EAE를 유도하는 에멀젼을 생성한다는 것을 밝혔습니다. 실험을 위해 에멀젼을 만들기 전에 보충 파일 번호 1을 다운로드하여 낭비를 최소화하는 데 필요한 각 구성 요소의 양을 계산하십시오. 여기에 제시된 방법은 전임상 연구뿐만 아니라 향후 클리닉에서 암 백신을 준비하기 위해 에멀젼 제제를 표준화하는 데 사용될 수 있습니다.
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개요
이 기사는 다발성 경화증의 동물 모델인 실험 자가면역 뇌수막염(EAE)을 유도하기 위해 수성-유성 에멀젼을 준비하는 표준화된 방법을 제시합니다. 이 방법은 에멀젼 준비 중 인간의 영향을 최소화하여 결과의 변동성을 줄이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 자가면역 질환 연구
배경
- 실험 자가면역 뇌수막염(EAE)은 다발성 경화증을 연구하는 데 사용됩니다.
- 일관된 에멀젼 준비는 신뢰할 수 있는 실험 결과를 위해 중요합니다.
- 현재의 방법은 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 이 연구는 신속하고 간단한 균질화 프로토콜을 소개합니다.
연구 목적
- 에멀젼 준비를 위한 표준화된 방법을 제시합니다.
- EAE 유도의 변동성을 줄입니다.
- 다른 자가면역 모델 및 암 백신 테스트에 적용 가능한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 동결 건조 M tuberculosis H37 RA를 사용한 CFA 슬러리 준비.
- 에멀젼 준비를 위한 강철 비드와 균질화기의 사용.
- 일관성을 위한 흔들기 시간 및 속도의 최적화.
- EAE 및 다른 모델에 방법을 적용.
주요 결과
- 이 방법은 EAE 유도에 적합한 안정적인 에멀젼을 생성했습니다.
- 인간의 영향을 줄이면 더 일관된 실험 결과가 나타났습니다.
- 다른 자가면역 질환 모델에 적용 가능성을 입증했습니다.
- 암 백신 테스트에 잠재적 사용 가능성이 지적되었습니다.
결론
- 표준화된 에멀젼 준비 방법은 EAE 연구의 재현성을 향상시킵니다.
- 이 접근 방법은 다양한 연구 응용에 적용될 수 있습니다.
- 미래의 연구는 이 프로토콜을 활용하여 실험 결과를 개선할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
