약물 용출 물질의 종방향 항균 활성을 측정하는 새로운 방법

이 프로토콜에는 고분자 장치에서 용출된 항생제의 실시간 항균 효능 테스트가 포함되며, 이는 번역 가치를 높이는 효과적인 제형을 정확하게 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 실시간 항균 효능 테스트 기능을 통해 약물 용출 물질의 종적 활성을 모니터링하고 주어진 임플란트 제형에 대한 항균 활성 범위를 이해할 수 있습니다. 이 고분자 재료는 베어링 표면으로 전체 조인트 교체의 90% 이상에 사용됩니다.

그리고 이러한 항생제 용출 제제는 삽입물 주위 관절 감염에 대한 가능한 치료법으로 개발되고 있습니다. 이 분석법은 다공성 금속, 분해성 및 비분해성 폴리머, 젤 및 재료별 프로토콜 수정이 있는 미립자 물질과 같은 모든 약물 용출 장치와 함께 사용할 수 있습니다. 시작하려면 1밀리리터의 트립신 콩 국물에 박테리아를 밤새 배양하십시오.

이어서, 하룻밤 동안 성장한 박테리아 현탁액을 멸균된 Mueller Hinton Broth 또는 MHB에 희석하고, 원고에 기재된 바와 같이 실험 개시 전에 발광 유닛을 사용하여 생존 가능한 박테리아 계수를 검증한다. 처녀 및 약물 로딩 UHMWPE 스트립을 3밀리리터 주사기 안에 넣습니다. 그런 다음 MHB 함유 박테리아 현탁액을 부착 된 바늘을 통해 주사기에 최대 1.5 밀리리터 표시까지 끌어 당깁니다.

표시된 시점인 6시간까지 진탕 인큐베이터에 주사기 설정을 놓은 다음 7일까지 매일 놓습니다. 표시된 각 시점 후에 주사기 설정을 꺼내고 2밀리리터 튜브에 배지를 분배합니다. 100 마이크로리터의 박테리아 현탁액을 사용하여 원고에 설명된 대로 실시간 미생물 생존율 분석을 수행합니다.

생존 가능한 박테리아 수를 결정한 후 해당 표준 곡선을 사용하여 발광 단위에서 밀리리터당 집락 형성 단위를 계산합니다. 검출 한계 미만의 발광 값을 보인 샘플에서 생존 가능한 박테리아가 없는지 확인하려면 트립신 대두 한천 플레이트에 배양물을 뿌립니다. 플레이트를 섭씨 35도에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 다음날 식민지의 존재를 확인하십시오. 남아있는 박테리아 현탁액을 원심 분리하십시오. 소비 된 매체를 부드럽게 흡인하십시오.

보이지 않는 펠릿이 있는 튜브에 100마이크로리터의 상청액을 남겨둡니다. 펠렛 박테리아를 신선한 MHB에 재현탁합니다. 완전한 재서스펜션을 보장하기 위해 10초 동안 소용돌이칩니다.

그런 다음 부착된 바늘을 통해 동일한 주사기 설정에 박테리아 현탁액을 끌어들입니다. 7일째 연구 완료 후 주사기 설정에서 처녀 및 약물 로딩 UHMWPE 표면을 검색하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 표면을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터의 멸균 PBS로 세 번 헹굽니다.

1 밀리리터의 멸균 PBS에서 40 분 동안 표면을 초음파 처리한다. 초음파 처리 된 샘플의 100 마이크로 리터에 발광 분석을 수행하여 부착 박테리아 생존력을 결정합니다. 반코마이신 및 겐타마이신 로딩 UHMWPE로부터의 약물 방출은 6시간에 버스트 방출을 입증한 후 7일까지 최소 억제 농도보다 큰 농도로 꾸준한 방출 속도를 보였다.

반코마이신과 겐타마이신을 사용한 UHMWPE는 6시간부터 감수성 ATCC 12600에 대해 3로그 이상의 감소를 보였으며 3일째에 완전한 박멸이 관찰되었습니다. 겐타마이신 감수성 및 반코마이신 중간 균주인 L1163의 경우, 두 약물 용출 물질 모두 6시간에 3로그 이상의 감소를 일으켰고 첫날에는 콜로니 성장이 관찰되지 않았습니다. UHMWPE의 겐타마이신 용출은 겐타마이신 내성 및 반코마이신 중간 균주인 L1101의 박테리아 생존력에 영향을 미치지 않았습니다.

반대로, UHMWPE의 반코마이신 용출은 6 시간에 박테리아 생존력을 유의하게 감소시켰다. 겐타마이신과 반코마이신 용출 UHMWPE의 표면은 7일 후 감수성 및 중간 내성 균주에 노출되었을 때 생존 가능한 부착성 박테리아를 나타내지 않았습니다. 그러나 겐타마이신 내성 L1101에 노출된 겐타마이신 용출 UHMWPE에는 일부 생존 가능한 박테리아가 존재했습니다.

대조 버진 폴리에틸렌의 표면은 각 균주에 노출되었을 때 생존 가능한 부착성 박테리아를 보여주었습니다. 미생물 집단의 이월을 촉진하는 각 시점에서 사용한 배지를 분리하는 것은 항생제에 대한 지속적인 노출을 시뮬레이션하는 데 중요합니다. 정적 방법을 개선하는 동안 이 반정적 시뮬레이션 방법은 감염에 대한 새로운 약물 제형의 활성 역학을 추가로 이해하기 위해 지속적인 설정으로 후속 조치를 취할 수 있습니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 균주 의존적 박테리아 역학에 대한 약물 용출의 효과를 포착할 수 있었습니다. 지속적인 항생제 전달 장치의 효능 평가를 위한 도구를 향상시킵니다.