마이코플라스마 폐렴의 특이적 검출을 위한 항원-포획 효소 결합 면역흡착 분석

모든 마이코플라스마의 환자와 마찬가지로 마이코플라스마 폐렴 진단은 교차 반응으로 인해 어렵습니다. 우리가 제안한 ELISA는 흡착 기술을 사용하여 비특이적 마이코플라스마 폐렴 항원의 선택적 고갈을 기반으로 합니다. 이 비디오에 설명된 사내 항원 캡처 ELISA는 높은 넓은 특이성을 보장합니다.

그리고 실제로, 그것은 마이코 플라스마 폐렴 감염의 정확한 진단을위한 신뢰할 수있는 선별 검사로 입증되었습니다. ELISA 이전 단계를 시연하는 것은 박사 과정 학생 인 Imen Chniba입니다. 그리고 ELISA 단계는 우리 실험실의 기술자 인 Nadine Khadraoui가 될 것입니다.

항원 흡착 절차를 시작하려면 12개의 이종 박테리아 항원을 미세 원심분리 튜브로 당기고 흡착할 항혈청의 절반에 해당하는 단백질 농도를 조정합니다. 다음으로, 항원 혼합물을 섭씨 4도에서 10분 동안 14, 000 G에서 원심분리하여 펠렛을 수집하였다. 이어서, 정제된 폴리클로날 항-마이코플라스마 폐렴 IgG와 함께 펠렛을 재현탁시키고, 느린 교반과 함께 섭씨 37도에서 2시간 동안 인큐베이션한다.

배양이 끝날 때, 현탁액을 섭씨 4도에서 10 분 동안 14, 000 G에서 다시 원심 분리하고 특정 다클론 마이코 플라스마 폐렴 항혈청에 상응하는 상청액을 회수한다. 96웰 ELISA 플레이트를 포획 항체로 코팅하려면 항체를 밀리리터당 10마이크로그램 및 pH 9.6에서 0.1몰 탄산염 중탄산염 완충액으로 희석합니다. 이어서, 희석된 항체 100 마이크로리터를 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가하고, 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션한다.

다음날, 코팅 용액을 제거하고 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척한다. 다음으로, 각 웰에 100 마이크로 리터의 블로킹 용액을 첨가하여 코팅 된 웰의 결합되지 않은 표면을 차단한다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 피펫으로 블로킹 용액을 제거하고 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 세척한다.

동일한 양의 Mycoplasma pneumoniae 전체 단백질을 웰당 10나노그램의 농도로 추가하고 항원-항체 반응이 실온에서 2시간 동안 일어나도록 합니다. 배양 후, 과량의 항원을 제거하고 입증된 바와 같이 플레이트를 세척한다. 다음으로, 인간 혈청 시험 샘플을 희석하고 양성 및 음성 혈청 대조군을 참조한다.

그런 다음 100 마이크로리터의 희석된 테스트 샘플과 대조군을 적절한 웰과 복제본에 추가합니다. 항원이나 혈청이 들어 있지 않은 우물을 공백으로 표시하십시오. 플레이트를 실온에서 90분 동안 배양한 후, 혈청 용액을 제거하고 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척하였다.

각 웰에 적절한 희석된 효소 접합 검출 항체를 100 마이크로리터의 피펫으로 넣고 암실에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한다. 결합되지 않은 검출체를 제거하고 플레이트를 세척한 후 100마이크로리터의 TMB Chromogen 용액을 추가하여 항원-항체 결합을 시각화합니다. 플레이트를 실온에서 30 분 동안 현상시킵니다.

그런 다음 100 마이크로 리터의 7.5 % 황산을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 흡광도를 판독하고 양성 지수의 계산을 기반으로 결과를 정렬합니다. Mycoplasma pneumoniae 비 흡착 된 폴리 클로날 항 혈청과 이종 박테리아 항원 사이의 면역 블롯 분석은 교차 반응성을 나타내지 만 강도는 다양했습니다.

예를 들어, 마이코플라스마 갈리셉티쿰과 마이코플라스마 모방 항원은 조류 마이코플라스마임에도 불구하고 가장 강한 반응성을 나타냈습니다. 대조적으로, 우레아플라스마 우레알리티쿰의 두 인간 임상 분리 물 중 어느 것도 반응을 보이지 않았습니다. 그러나 나머지 인간 생식기 마이코플라스마 종의 항원 및 기타 박테리아 항원은 항혈청과 상당한 교차 반응을 일으켰습니다.

면역블롯 분석은 이종성 박테리아 항원에 대한 마이코플라스마 폐렴 다클론 항혈청 흡착의 효율을 확인하였다. 흡착 절차는 모든 교차 반응을 제거하여 Mycoplasma pneumoniae 항혈청을 이후의 모든 혈청학적 및 면역블로팅 검사에 특이적으로 만들었습니다. 또한, 본 연구에서 개발된 항원 포획 ELISA를 사용하여 시험된 인간 혈청 세트는 마이코플라스마 폐렴 IgG에 대해 양호한 특이성으로 양성으로 입증되었다.

이 ELISA의 특이성은이 중요한 단계를 신중하게 수행하고 적어도 두 번 또는 세 번 반복하는 것이 기본이기 때문에 주로 흡착 기술에 의해 보장됩니다. 이 기술의 원리는 일반적으로 다른 마이코 플라스마 종 또는 다른 박테리아를 진단하는 데 적용될 수 있습니다. 그러나, 흡착을위한 박테리아 항원의 선택은 부적절하고 적절해야한다.