형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사
2022년 10월 14일
형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.
이 방법은 단백질-단백질 상호 작용의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 살아있는 세포 내부에서 서로 10 나노 미터 이내에있는 두 개의 단백질을 직접 검출 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 재현하기 쉽다는 것입니다. 또한 많은 현대 실험실에서 사용할 수 있는 간단한 재료가 필요합니다.
이 측정은 관심 단백질에서 전이적으로 퍼지는 모든 생체 조직 또는 배양 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 이 기술을 처음 사용하는 경우 양성 대조군과 음성 대조군을 사용하여 시스템을 먼저 테스트하는 것이 좋습니다. 시작하려면 니코 티아나 벤타미 아나 씨앗을 젖은 토양이 들어있는 냄비에 고밀도로 뿌립니다.
심은 씨앗을 섭씨 23 도로 설정된 성장 챔버에 보관하십시오. euphyll의 직경이 0.3-0.5 센티미터에 이르면 묘목을 더 큰 화분으로 옮기고 동일한 매개 변수로 동일한 챔버에서 자랄 수 있도록하십시오. 다음으로, FRET 구축물을 포함하는 각 아그로박테리움 콜로니를 항생제와 150 마이크로몰 아세토시링곤이 보충된 5밀리리터의 LB 배지에 접종하여 농업 침윤을 위한 박테리아 세포를 준비합니다.
배양물을 섭씨 28도에서 밤새 배양하십시오. 배양 후, 세포를 실온에서 5분 동안 3, 000 G에서 원심분리한다. 농윤 완충액에 세포를 0.5의 OD 600으로 재현탁시킨다.
이중 구조물 농 침투의 경우, 재현 된 세포를 1 대 1 부피비로 적절한 구조물을 보유하고있는 세포와 결합하십시오. 세포를 섭씨 28도에서 30분 내지 1시간 동안 배양한다. 농업 침투를 수행하려면 박테리아 배양 물을 1 밀리리터 바늘없는 주사기에 넣으십시오.
부드럽지만 단단하게, 완전히 확장 된 Nicotiana benthamiana 잎의 축 방향 쪽에 대해 주사기의 노즐을 누르면서 축 방향 쪽에 장갑을 낀 손가락으로 잎을 잡습니다. 잎에 최대 4 개의 지점, 식물 당 3 개의 잎, 각 박테리아 배양에 대해 2 개 또는 3 개의 식물에 침투합니다. 농윤화 식물을 24 내지 36 시간 동안 앞서 설명한 것과 동일한 조건 하에서 동일한 성장 챔버에 유지한다.
침투 24-36 시간 후, 면도날을 사용하여 각 농작물 침투 잎을 정맥 사이에 2 x 4 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 축 방향 잎 표면이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 잎 조각을 놓습니다. 잎 조각에 물 한 방울을 놓고 커버 유리로 덮으십시오.
커버 유리를 살짝 두드려 기포를 제거합니다. 그런 다음 현미경과 레이저를 켭니다. 슬라이드를 현미경 스테이지 홀더에 놓습니다.
SE-FRET에 대한 파라미터를 설정하려면 다차원 수집 도구를 엽니다. 그런 다음 405 나노 미터의 여기 레이저에서 공여체 형광 색소 GFP의 여기 및 방출을위한 도너 채널을 설정하고 400에서 597 나노 미터에서 방출 필터를 설정합니다. 수용체 형광 mRFP 및 561 나노미터의 여기 레이저 및 방출 필터의 여기 및 방출을 위한 수용체 채널을 400 내지 597 나노미터로 설정한다.
405 나노 미터 여기 레이저 및 597-617 나노 미터 방출 필터를 사용하여 공여체의 여기 및 수용체 형광 색소의 방출을위한 FRET 채널을 설정하십시오. 기증자 여기 강도를 최소 수준으로 설정하여 광퇴색을 피하면서 FRET를 관찰하십시오. 공여체를 여기시키고 수용체의 예상되는 형광 신호를 포함하는 세포를 스캔합니다.
관심 있는 형광 신호가 포함된 영역을 선택합니다. 스냅 버튼을 눌러 SE-FRET 이미지 시퀀스를 획득합니다. AB-FRET에 대한 파라미터를 설정하려면 SE-FRET에 설정된 도너 및 억셉터 채널 파라미터를 활용하되 FRET 채널은 끕니다.
그런 다음 수용체 mRFP의 광 표백을위한 매개 변수를 설정할 준비를하십시오. 5개의 이미지 후에 표백이 시작되는지 확인합니다. 각 영역 표백제에 대해 200회 반복을 허용합니다.
100 나노 미터에서 561 % 레이저 강도를 유지하십시오. 표백 지속 시간을 45 초로 유지하십시오. 400Hz에서 512 x 512 픽셀의 스캔 속도를 보장합니다.
표백할 세포의 영역을 검색하여 그리고, 실험 시작 버튼을 눌러 표백을 활성화합니다. 양성 대조군의 경우 5 개의 이미지 후에 표백이 시작되고 관심 영역이 녹색으로 바뀝니다. 평균 ROI를 확인하여 GFP의 강도가 증가하는 동안 mRFP의 강도가 감소하는지 확인합니다.
또는 mRFP가 표백되고 GFP가 증가하고 있음을 보여주는 레이아웃을 확인하십시오. SE-FRET 데이터를 분석하려면 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오. 이미지를 열고 기증자 만 스택을 만듭니다.
이미지를 8비트 단위로 TIF 파일로 저장합니다. 마찬가지로, 수용체에 대한 스택을 만든 다음 기증자와 수용체의 결합 된 스택을 만듭니다. 다음으로 PixFRET 플러그인을 사용하여 SE-FRET 효율성의 이미지를 생성합니다.
생성된 스택을 열고 스펙트럼 블리드를 뺀 후 수정된 FRET 이미지를 생성합니다. 이미지를 의사 컬러 이미지로 표시합니다. AB-FRET 데이터를 분석하려면 이 공식을 사용하여 mRFP 광퇴색 후 GFP 방출의 백분율 증가로 AB-FRET를 백분율로 계산합니다.
특이적 단백질-히스톤 데우비퀴티나제 OTLD1과 전사 인자 LSH10의 단백질 상호작용을 SE-FRET에 의해 연구하였다. 세포핵을 3개의 채널에서 동시에 기록하고, SE-FRET 효율을 묘사하기 위해 유사색 스케일을 생성하였다. 파란색에서 빨간색으로의 전환은 FRET 효율 및 단백질 - 단백질 근접성의 증가에 해당합니다.
LSH10 및 OTLD1의 동시 발현에 따른 SE-FRET 강도는 양성 대조군 mRFP-GFP에 대해 관찰된 것과 유사하였다. OTLD1, mRFP 및 LSH4-GFP의 동시 발현 또는 유리 mRFP 및 LSH10-GFP와 같은 음성 대조군에서는 SE-FRET가 관찰되지 않았습니다. AB-FRET 이미지는 LSH10-GFP와 OTLD1-mRFP의 동시 발현이 RFP 수용체가 광표백된 후 GFP 공여체 형광이 증가한다는 것을 보여주었습니다.
공여체 형광의 유사한 증가가 양성 대조군에서 관찰되었지만, 수용체 형광이 비활성화되었을 때 음성 대조군에서는 관찰되지 않았다. AB-FRET 데이터의 정량 분석은 LSH10 및 OTLD1을 동시 발현한 후 공여체 형광의 통계적으로 유의한 증가를 입증했습니다. 양성 대조군은 약 30%의 AB-FRET를 생성했지만 음성 대조군은 아무 것도 생성하지 않았습니다.
SE-FRET와 AB-FRET는 GFP-MRFP 단백질의 핵세포질 특성뿐만 아니라 전사 인자 히스톤 변형 효소 복합체의 세포내 국소화와 일치하는 세포핵 내 신호를 보였다. 프로토콜을 따르기 전에 기억해야 할 가장 중요한 것은 컨포칼 나노스코피 모델에 따라 올바른 기증자 수용체 익스프레스 쌍으로 테스트하는 것입니다. 실행하고 반복을 수행 한 후 결과를받는 데 24-36 시간 밖에 걸리지 않습니다.
이 비디오를 본 후에는 FRET 기술을 사용하여 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해해야 합니다.
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개요
이 연구는 살아있는 식물 세포 내 단백질 상호작용을 조사하기 위한 FRET 프로토콜을 제시하며, 특히 유전자 조절에 관련된 히스톤 변형 효소와 전사 인자의 연관성에 초점을 맞추고 있습니다. 니코티아나 벤타미아나를 모델 시스템으로 사용하여 얻은 결과는 이 이미징 기법이 단백질-단백질 상호작용과 동태를 분석할 수 있는 잠재력을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 단백질-단백질 상호작용
- 유전자 발현 조절
- 식물의 후성 유전 변형
배경
- 히스톤 변형 효소와 전사 인자의 연관성을 이해하는 것은 유전자 조절을 규명하는 데 중요합니다.
- FRET 기법은 살아있는 세포 내 나노미터 근접성 내의 상호작용을 감지할 수 있습니다.
- 이 방법은 식물 연구의 다양한 생물학적 응용을 위해 표준화될 수 있습니다.
사용된 방법
- 형광 공명 에너지 전달(FRET) 이미징
- 생물학적 시스템으로서의 니코티아나 벤타미아나
- 단백질 발현 및 분석을 위한 아그로인필트레이션의 사용
주요 결과
- SE-FRET를 사용하여 OTLD1과 LSH10 간의 상호작용을 성공적으로 시각화했습니다.
- 대조 실험은 관찰된 상호작용의 특이성을 확인했습니다.
- 정량적 분석은 단백질 근접성 및 상호작용 동태에 관한 결론을 지지했습니다.
결론
- 이 연구는 식물 시스템에서 단백질 상호작용을 분석하기 위한 FRET의 유용성을 입증합니다.
- 이 연구는 유전자 발현의 후성 조절 메커니즘 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Directly quantifying interactions between histone modifying enzymes and transcription factors in living cells addresses a critical challenge in target validation for epigenetic drug discovery. FRET-based detection of protein proximity within 10 nm enables mechanistic de-risking and increases predictive confidence in early discovery. This capability supports portfolio decisions by clarifying functional protein complexes relevant to gene regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-protein interactions in native cellular environments.
- Supports functional validation of epigenetic targets by confirming complex formation in vivo.
- Reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis for gene regulation.
- Improves predictive confidence for advancing targets into screening pipelines.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible readouts of protein interaction efficiency.
- Enables assay standardization using positive and negative controls for robust data.
- Supports scalability and platform reuse across diverse protein pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant chromatin regulation pathways.
- Ensures continuity from discovery-stage interaction mapping to preclinical model validation.
- De-risks translational advancement by confirming in vivo relevance of protein complexes.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET-based method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge from hypothesis-driven target validation to quantitative screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing direct protein interactions in living tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET efficiency measurements for assay readiness.
- Analytics: Enables statistical comparison of interaction strength across experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant chromatin regulation when supported by biological context.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse protein pairs and model systems for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Offers standardized, reproducible protocols compatible with common laboratory infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through early mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets and complexes for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and protein labeling strategies.
- Needs access to confocal nanoscopy and compatible FRET imaging platforms.
- Demands rigorous use of positive and negative controls for assay standardization.
- Adaptable across plant and potentially mammalian systems with appropriate construct design.
- Dependent on spectral compatibility of donor-acceptor fluorophore pairs and imaging system.
