Name: 다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 임상 미세유체 칩을 활용한 순환 종양 세포 분리 및 계수 방법을. MCF-7, MDA-MB-231, HeLa 세포주를 사용하여 혈액 샘플에서 CTC를 효율적으로 포착하고 면역형광 염색으로 신속하게 식별하는 기술을 익히세요.

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이 연구는 중국 안후이 자연 과학 재단 (1908085MF197, 1908085QB66), 중국 국립 자연 과학 재단 (21904003), 천진 교육위원회 과학 연구 프로젝트 (2018KJ154), 안후이 성 고등 교육 기관의 지방 자연 과학 연구 프로그램 (KJ2020A0239), 다차원 정보 처리의 상하이 핵심 연구소, 동중국 다차원 정보 연구소 처리, 화동 사범 대학 (MIP20221).

환자 혈액 샘플은 상하이 의과 대학 부속 Longhua 병원에서 제공했으며 프로토콜은 북경 대학 제 3 병원의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 연구 목적으로 샘플을 사용하는 것에 대해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 배양된 종양세포로 포획 효율을 확인하기 위한 사전 실험
<ol><li>포획 효율을 결정하기 위해 종양 세포 MCF-7, MDA-MB-231 및 HeLa를 배양하였다. 종양 세포 현탁액을 희석하고, 종양 세포의 수를 세고, PBS 1mL에서 원하는 세포 수가 얻어질 때까지 반복한다.<ol><li>세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 1 mL의 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 중 5개의 세포로 시작하는 세포 수를갖는 세포 배양 플라스크에서 배양한다. 5%CO2 분위기의 37°C에서 가습된 분위기에서 배양한다.</li>
		<li>세포주가 95% 합류까지 부착성 단층으로 성장하면 Chen et al.16에 설명된 대로 2분 동안 0.25% 트립신 용액으로 배양 접시에서 세포를 분리합니다.</li>
		<li>칼세인 AM으로 종양 세포를 염색하십시오. 배양 접시에 칼세인 AM 3μL를 넣고 접시를 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다. 그런 다음 트립신으로 모든 세포를 소화하십시오.</li>
		<li>세포 계수 챔버를 이용하여 PBS에서 배양된 종양 세포를 계수하고, PBS 1 mL 당 100개의 종양 세포가 얻어질 때까지 희석한다. 참고: 세포 수를 정확하게 열거하기 위해 얻은 세포 현탁액 50μL를 취하여 현미경으로 종양 세포의 수가 5개인지 여부를 확인합니다. 50μL의 세포 현탁액에 있는 실제 종양 세포 수에 따라 100개의 종양 세포를 얻기 위해 취해야 하는 세포 현탁액의 부피를 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>0.5mL/h, 1mL/h, 2mL/h, 3mL/h, 4mL/h 및 5mL/h의 다양한 유속으로 주사기 펌프가 있는 주사기를 사용하여 PBS 1mL당 100개의 종양 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 다양한 유량에 대한 포집 효율을 구하고 최적의 유량을 결정합니다.<ol><li>칩에 포획되어 배출구에서 흘러 나오는 종양 세포의 수를 세십시오. 아래와 같이 캡처 효율을 계산합니다. 포획 효율 = 포획된 세포 수/(포획된 셀 수 + 유출되는 셀 수) × 100%</li>
		<li>10 내지 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100)의 상이한 수의 종양 세포에 대한 포획 효율을 얻기 위해 반복한다.</li>
	</ol></li>
	<li>희귀 한 수의 종양 세포에 대해 미세 유체 칩을 테스트하고 검증합니다. 1mL의 PBS에 희석된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 종양 세포를 흡인하기 위해 마이크로피펫 풀러로 만든 중공 바늘을 사용하여 이 10개의 샘플 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 칩에 캡처한 후 각 샘플에 대한 종양 세포의 수를 감지하고 열거합니다. 알림: 속이 빈 바늘의 길이는 약 3cm이고 외경은 1mm입니다.</li>
	<li>정상 혈액 샘플에 스파이크된 종양 세포에 대한 임상 실험 전 테스트를 수행합니다.<ol><li>칼세인 AM으로 종양 세포를 염색한 다음 5μL의 PBS에 100개의 종양 세포를 열거합니다. 이 세포를 1mL의 전혈 샘플에 스파이크합니다. 이 세포를 칩에 도입하고 녹색 면역 형광으로 칩에 포획 된 종양 세포의 수를 열거합니다. 상기와 같이 칩에 대한 in vivo enumeration을 수행하고, 포획 후 포획 효율을 계산한다.</li>
		<li>10 내지 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90)의 9 개의 추가 농도의 종양 세포 수에 대해 1.4.1 단계를 반복한다.</li>
		<li>단계 1.3에 기술된 바와 같이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 종양 세포를 염색 없이 열거하고, 전정상 혈액 1mL에 스파이크하고, 이들 샘플을 미세유체 칩에 도입하고, 칩 상의 종양 세포를 포획한다.</li>
		<li>Hoechst, CK-FITC 및 CD45-PE로 칩에 얼룩을 묻히십시오. 3-5 μL의 형광 염료를 20-30 μL의 PBS에 넣은 다음 이 용액을 주사기로 미세유체 칩에 도입합니다. 칩에 포획된 종양 세포의 수를 청색 및 녹색 면역형광법으로 열거하여 포획 효율을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>anti-EpCAM의 친화성 기반 캡처를 위해 미세유체 칩의 변형을 수행합니다. 참고: 웨이브 칩은 친화성 기반 및 물리적 특성 기반 절연을 모두 결합하므로 에이전트로 칩을 수정하십시오.<ol><li>실온에서 45분 동안 에탄올에 4%(v/v) 3-메르캅토프로필 트리메톡시실란 100μL로 칩 표면을 수정합니다. 이 용액을 칩의 내부 구조, 특히 상단 표면과 기판 유리의 결합을 파괴할 경우를 대비하여 조심스럽게 천천히 칩에 주입하십시오. 알림: 칩 표면은 메르캅토실란을 사용하여 수정됩니다. 칩에서 발생하는 상호 작용은 화학 결합에 의해 결정됩니다. 화학 결합은 항원으로 변형 된 항체의 결합을 실현하기 위해 확립됩니다. 칩 내부에서 다양한 시약이 변형되어 서로 연결되는 화학 결합을 형성합니다. 마지막으로 변형될 시약은 항-상피 접착 분자(anti-EpCAM)이다. EpCAM의 종양 세포 표면 항원은 칩 내부의 anti-EpCAM과 결합하여 CTC의 캡처를 실현합니다.</li>
		<li>에탄올로 3 번 씻으십시오. 커플링제 N-y-말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르(GMBS, 1μM) 100μL를 칩에 넣고 30분 동안 상호 작용하도록 합니다.</li>
		<li>PBS 3x로 세척하십시오. 주사기를 사용하여 PBS 1mL를 칩에 주입하여 세척합니다.</li>
		<li>실온에서 30분 동안 40μL의 10μg/mL 뉴트라비딘으로 칩을 처리하여 세포를 GMBS에 고정시킨 다음 PBS로 플러시하여 과량의 아비딘을 제거합니다.</li>
		<li>1%(w/v) BSA가 포함된 PBS 100μL에 10μg/mL 농도의 항비오티닐화 EpCAM 항체 3μL로 칩을 수정합니다. 이것을 밤새도록 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 순환 종양 세포(CTCs)를 열거하기 위한 칩에 대한 임상 실험
<ol><li>적혈구 용해(RBCL) 용액을 사용하여 임상 암 환자 혈액 샘플을 전처리하거나 주사기를 사용하여 2-3mL의 혈액 샘플을 미세유체 칩에 직접 삽입합니다.<ol><li>약 30분이 소요되는 전처리를 수행합니다. 항응고 튜브에서 전혈 샘플을 수집합니다. 6-9 mL의 RBS 용해 용액을 2-3 mL의 혈액에 넣는다. 실온에서 5-8분 동안 111 x g 로 원심분리하고 적색의 투명한 액체의 상층을 버립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 대로 칩의 세포를 캡처, 염색, 인식 및 열거합니다.<ol><li>단계 1.Hoechst, CK-FITC 및 CD45-PE를 사용하여 캡처된 CTC에 대해 칩을 염색하는 단계에 설명된 대로 칩 상의 세포를 캡처합니다. CK-FITC는 종양 세포에 대한 특이적 염색이고 CD45-PE는 백혈구에 대한 것입니다.</li>
		<li>20 μL의 PBS에 3 μL의 CK-FITC를 추가합니다. 이것을 주사기에 넣고 희석된 CK-FITC를 칩에 펌핑합니다. 30분 동안 염색합니다. 300 μL의 PBS를 칩에 주입하여 칩을 세척합니다.</li>
		<li>20 μL의 PBS에 3 μL의 CD45-PE를 추가합니다. 이것을 주사기에 넣고 희석된 CD45-PE를 칩에 펌핑합니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 300 μL의 PBS를 칩에 주입하여 칩을 세척합니다.</li>
		<li>20x 또는 40x 배율에서 도립 형광 현미경으로 CTC를 식별합니다. CTC는 청색 형광과 녹색 형광을 모두 방출하고 백혈구(WBC)는 청색 형광과 적색 형광을 모두 방출합니다. 청색 및 녹색 형광이 모두 있는 CTC와 청색 및 적색 형광이 모두 있는 백혈구를 식별합니다.</li>
		<li>면역형광 이미지에서 칩에 캡처된 CTC의 수를 열거합니다. CTC를 Hoechst+/CK-FITC+/CD45−로 열거하고 WBC를 Hoechst+/CK-FITC−/CD45+로 열거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>미세유체 칩 상에 역방향으로 주사기를 통해 PBS로 플러싱하여 포획된 CTC를 농축하여 칩에 포획된 CTC를 입구로부터 수집한다. PBS 1mL가 든 주사기를 사용하여 배출구에서 주입하여 2-3분 이내에 칩에 포착된 CTC를 농축하고 입구에서 수집합니다. 각 세척 단계마다 PBS 1mL를 사용하고 3회 반복합니다.</li>
	<li>아래에 설명된 대로 미세유체 칩에 포획된 종양 세포 또는 CTC를 염색합니다.<ol><li>칼세인 AM을 사용하여 얼룩을 묻히십시오. 5 μL의 칼세인 AM을 20 μL의 PBS에 첨가하고, 세포를 30 분 동안 염색 한 다음, 실온에서 2 분 동안 111 x g 에서 원심 분리하여 종양 세포를 얻고, 1 mL의 PBS에 현탁시킨다.</li>
		<li>세포핵을 식별하려면 큰 타원 마이크로필터의 경우 1mL/h, 사다리꼴 마이크로필터의 경우 1.5mL/h의 최적 유속으로 20μL의 DAPI 용액(PBS 20μL의 DAPI 시약 10μL)을 칩에 추가합니다. 20μL의 항-사이토케라틴 원액(20μL의 PBS에 3μL의 항-사이토케라틴 항체)을 통과시켜 30분 동안 칩과 반응시킵니다.</li>
		<li>칩에 포착된 WBC를 얼룩지게 합니다. CTC가 칩에 포획된 후 25μL의 항-CD45 항체 용액(20μL의 PBS에 5μL의 항-CD45 용액)을 칩에 추가하고 30분 동안 염색합니다. PBS로 세척하고, 청색 및 녹색 형광 모두로 상피 세포를 확인한다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 대로 형광 현미경으로 면역형광 식별을 수행합니다.<ol><li>형광 현미경을 사용하여 청색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 핵 세포인 파란색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 10x, 20x 또는 40x 배율 중 하나를 사용합니다. 종양 세포에 대한 명확한 필드를 찾으십시오. 청색 레이저 소스의 경우 여기판 파장 420-485nm와 방출판 파장 515nm를 사용합니다.</li>
		<li>샘플을 이동하지 않고 다른 레이저 소스를 사용하십시오. 형광 현미경을 회전시키고 녹색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 종양 세포를 나타내는 녹색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 이 녹색 레이저 소스로 동일한 배율로 동일한 필드의 이미지를 촬영하십시오. 청색과 녹색 형광을 모두 방출하는 세포는 종양 세포로 인식됩니다. 녹색 레이저 소스의 경우 460-550nm의 여기판 파장과 590nm의 방출판 파장을 사용합니다</li>
		<li>샘플을 이동하지 않고 다른 레이저 소스를 사용하십시오. 형광 현미경을 회전시키고 적색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 적색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 이 적색 레이저 소스로 동일한 배율로 동일한 필드의 이미지를 촬영하십시오. 청색과 적색 형광을 모두 방출하는 세포는 백혈구로 인식됩니다.</li>
		<li>위의 각 레이저 소스를 사용하여 얻은 이미지를 저장합니다. 다른 색상의 조명으로 같은 필드의 여러 이미지를 찍습니다.</li>
		<li>여기판 파장이 330-400nm이고 방출판 파장이 425nm인 자외선을 사용하십시오. 여기판 파장이 395-415nm이고 방출판 파장이 455nm인 보라색 빛을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>1.2.1단계와 같이 캡처 효율을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
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<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
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<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
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</ol>

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암의 예후와 조기진단은 암 치료에 중요한 영향을 미친다1. 미세 유체 칩을 사용한 CTC 분리는 침습 없이 액체 생검을 제공합니다. 그러나, CTC는 극히 드물고 혈액에서 이질적이다1, CTCs를 분리하는 것은 어렵다. CTC는 CTC가 유래한 원래의 종양 발생원과 유사한 성질을 가지고 있다. 따라서 CTC는 암 전이에서 중요한 역할을 한다1. 
제안된 프로토콜은 미세유체 칩을 사용한 CTC 분리의 완전한 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에는 CTC 격리와 관련된 모든 주요 절차가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜에는 꼼꼼하게 기록되고 다양한 패키지로 구성된 RBCL 분석, 희귀 종양 세포 획득, 최적 유속 측정, 포획 효율성, 임상 특성화 및 열거가 포함됩니다. 수술의 신중한 관리는 임상 환자 샘플 처리를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은...

순환 종양 세포(CTC)는 암 예후, 진단 및 항암 치료에 중요합니다. CTC는 드물고 이질적이기 때문에 CTC 열거는 매우 중요합니다. 희귀 CTC의 계수, 친화성 변형 및 임상 면역형광 염색은 높은 민감도로 필요한 요소를 제공하기 때문에 CTC 분리를 위한 강력한 기술입니다1. 실제 환자 혈액 2-3mL에는 CTC가 1-10개만 포함되어 있기 때문에 정상 혈액과 혼합된 희귀 종양 세포는 실제 환자 혈액과 거의 유사합니다. 중요한 실험 문제를 해결하기 위해 PBS에 도입되거나 정상 혈액과 혼합된 많은 수의 종양 세포를 사용하는 대신 희귀한 수의 종양 세포를 사용하면 적은 수의 혈액 세포를 얻을 수 있으며 이는 실험을 수행할 때 현실에 더 가깝습니다.
암은 세계 주요 사망 원인입니다2. CTC는 혈액 및 림프 순환계를 순환하는 원래 종양에서 배출되는 종양 세포이다3. CTC가 새로운 생존 가능한 환경으로 이동하면 두 번째 종양으로 성장합니다. 이를 전이(metastasis)라고 하며, 암 환자 사망의 90%를 차지한다4. CTC는 예후, 조기 진단 및 암의 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나, CTC는 환자 혈액에서 극히 드물고 이질적이다 5,6.
미세 유체 칩은 종양을 침범하지 않는 액체 생검을 제공합니다. 휴대가 간편하고 비용이 저렴하며 셀 매칭 스케일을 사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 미세 유체 칩을 사용한 CTC의 분리는 주로 두 가지 유형으로 분류됩니다 : 친화성 기반, 항원-항체 결합 7,8,9에 의존하며 CTC 분리의 독창적이고 가장 널리 사용되는 방법입니다. 종양 세포와 혈액 세포(10,11,12,13,14,15) 사이의 크기 및 변형 성 차이를 이용하는 물리적 기반 칩은 라벨이 없으며 작동하기 쉽습니다. 대체 기술에 비해 미세 유체 칩의 장점은 큰 타원 마이크로 필터의 물리적 기반 접근 방식이 높은 캡처 효율로 CTC를 확실하게 캡처한다는 것입니다. 그 이유는 타원 마이크로포스트가 라인 라인 간격의 슬림한 터널로 구성되어 있기 때문입니다. 라인 라인 갭은 마름모 마이크로 포스트와 같은 마이크로 포스트에 의해 형성된 전통적인 포인트 포인트 갭과 다릅니다. CTC의 웨이브 칩 기반 캡처는 물리적 특성 기반 분리와 친화성 기반 절연을 결합합니다. 웨이브 칩 기반 캡처에는 원형 마이크로포스트에 코팅된 anti-EpCAM 항체가 있는 30개의 웨이브 모양 어레이가 포함됩니다. CTC는 작은 갭에 의해 포착되고 큰 갭은 유속을 가속화하는 데 사용됩니다. 누락 된 CTC는 다음 어레이에서 작은 갭을 통과해야하며 칩(16) 내부에 통합 된 친화성 기반 격리에 의해 캡처됩니다.
이 프로토콜의 목표는 희귀 한 수의 종양 세포 계수와 미세 유체 칩을 사용한 CTC의 임상 분석을 입증하는 것입니다. 이 프로토콜은 CTC 분리 단계, 적은 수의 종양 세포를 얻는 방법, 작은 타원 필터, 큰 타원 필터 및 사다리꼴 필터의 임상적 물리적 분리, 친화성 변형 및 농축을 설명합니다17.

<table><tbody><tr><td>Calcein AM</td><td>BIOTIUM</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>보정 미세모세관 피펫</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P0799</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CK-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td>cytokeratin monoclonal antibody</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>GIBCO, 미국</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>분자 프로브, Solarbio Corp., 중국</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>잉 신뢰할 수 있는 생명 공학, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해(RBCL)</td><td>Solarbio, 베이징</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

순환 종양 세포(CTC)는 암 예후, 진단 및 항암 치료에 중요합니다. CTC 열거는 CTC가 드물고 이질적이기 때문에 환자 질병을 결정하는 데 중요합니다. CTC는 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환계로 들어가 잠재적으로 먼 부위에서 성장하여 종양을 전이시킵니다. CTC는 원발성 종양과 유사한 정보를 전달하기 때문에 CTC 분리 및 후속 특성화는 암을 모니터링하고 진단하는 데 중요할 수 있습니다. 희귀 CTC의 계수, 친화성 변형 및 임상 면역형광 염색은 필요한 요소에 높은 감도를 제공하기 때문에 CTC 분리를 위한 강력한 방법입니다. 미세유체 칩은 환자에게 통증이 없는 액체 생검 방법을 제공합니다. 이 작업에서 우리는 CTC 분리, 분석 및 조기 진단에 필요한 일련의 기능과 서비스를 통합하여 생체 분자 분석 및 암 치료를 용이하게 하는 다목적 CTC 분리 플랫폼인 임상 미세유체 칩에 대한 프로토콜 목록을 제시합니다. 이 프로그램에는 희귀 종양 세포 계수, 적혈구 용해를 포함하는 임상 환자 혈액 전처리, 미세 유체 칩에서 CTC의 현장 분리 및 인식이 포함됩니다. 이 프로그램을 통해 종양 세포 또는 CTC를 정확하게 열거할 수 있습니다. 또한 이 프로그램에는 CTC 분리와 다용도 미세유체 칩 및 칩의 현장 면역형광 식별, 생체 분자 분석을 통합하는 도구가 포함되어 있습니다.

전체 설정에는 주사기 펌프, 주사기 및 미세 유체 칩이 포함됩니다. 주사기의 세포 현탁액은 주사기 펌프에 연결되고 세포 현탁액은 미세 유체 칩에 도입되어 세포를 포획합니다. 사용된 모든 미세유체 칩에 대한 포획 효율은 약 90% 이상이었다. 웨이브 칩의 경우 다양한 간격을 가진 미세 구조를 설계했습니다. 작은 갭은 CTC를 포착하는 데 사용되며 큰 갭은 유속을 가속화하는 데 사용됩니다. 세포 현탁액은 큰 갭 영역에서 빠르게 흐릅니다. 누락된 CTC는 후속 어레이(16)의 작은 갭에 의해 캡처되는 경향이 있다. 타원 칩의 경우, 캡처를 향상시키기 위해 슬림한 터널을 형성하기 위해 점점 간격 대신 라인 라인 간격을 설계했습니다. 따라서, 높은 포획 효율이 달성되었다1. 생존력을 유지하기 위해 가장자리와 모서리를 피하도록 타원 구조를 설계했습니다. 사다리꼴 필터에는 사다리꼴 및 원형 마이크로포스트 장벽이 내장된 두 개의 원형 나선형 채널이 있습니다....

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

이 프로토콜은 적혈구 세포 계수 및 임상적 CTC 단리를 위한 방법을 기술하였다. 시작하기 위해, 종양 세포 MCF-7, MDA-MB-231 및 HeLa를 세포 배양 플라스크에서 10 내지 5 회 DMEM에서 1 회 10 내지 5 회 배양하고, 10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신으로 보충한다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 배양합니다.세포주가 95% 합류할 때까지 부착성 단층으로 성장하면 0.25% 트립신 용액으로 2분 동안 배양 접시에서 세포주를 분리합니다. 3 마이크로 리터의 Calcein AM을 첨가하여 종양 세포를 염색하고 접시를 30 분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 모든 세포를 트립신으로 소화하십시오.배양된 종양 세포를 세포 계수 챔버로 PBS에서 계수하고, PBS 1밀리리터당 100개의 종양 세포가 얻어질 때까지 희석한다. 다음에, 희석된 세포 현탁액을 다양한 유속의 주사기 펌프가 있는 주사기를 사용하여 미세유체 칩 내로 도입한다. 다양한 유량에 대한 포집 효율을 구하고 최적의 유량을 결정합니다.칩에 포획되고 출구에서 유출되는 종양 세포의 수를 세십시오. 주어진 공식을 사용하여 캡처 효율을 계산합니다. 이 절차를 반복하여 10에서 100까지 다양한 수의 종양 세포에 대한 포획 효율을 얻습니다.희귀 한 수의 종양 세포에 대해 미세 유체 칩을 테스트하고 검증합니다. 희석된 종양 세포를 흡인하기 위해 마이크로피펫 풀러로 만든 속이 빈 바늘을 사용하여 이 10개의 샘플 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 칩에 캡처한 후 각 샘플에 대한 종양 세포의 수를 감지하고 열거합니다.다음으로, 종양 세포를 Calcein AM으로 염색하고, 5 마이크로 리터의 PBS에서 100 개의 종양 세포를 열거한다. 이 세포를 1 밀리리터의 전체 정상 혈액 샘플에 스파이크합니다. 이 세포를 칩에 도입하고 녹색 면역 형광으로 칩에 포획 된 종양 세포의 수를 열거합니다.설명된 대로 생체 내 열거를 수행하고, 포획 후 포획 효율을 계산한다. 염색 없이 1개에서 10개의 종양 세포를 열거합니다. 이 세포들을 1 밀리리터의 전체 정상 혈액으로 스파이크하십시오.이들 샘플을 미세유체 칩에 도입하고, 종양 세포를 포획한다. 20 내지 30 마이크로리터의 PBS에 3 내지 5 마이크로리터의 형광 염료를 첨가하고, 이 용액을 주사기로 칩에 도입한다. 칩에 포획된 종양 세포의 수를 청색 및 녹색 면역형광법으로 열거하여 포획 효율을 결정합니다.다음으로, 상피 세포 부착 방지 분자의 친화성 기반 포획을 위해 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 4%3-메르캅토프로필 트리메톡시실란과 에탄올로 칩 표면을 수정합니다. 배양이 끝나면 칩을 에탄올로 세 번 씻으십시오. 그런 다음 100 마이크로 리터의 커플 링제 GMBS를 추가하고 30 분 동안 상호 작용하도록합니다.배양이 끝나면 주사기를 사용하여 1 밀리리터의 PBS로 칩을 3 회 세척합니다. 실온에서 30분 동안 밀리리터당 10마이크로그램의 뉴트라비딘 30 내지 40마이크로리터로 칩을 처리하여, 세포를 GMBS 상에 고정화시킨 다음, PBS로 플러시하여 과량의 아비딘을 제거한다. 칩을 3-마이크로리터의 항-비오티닐화 상피 세포 접착 분자 항체로 수정하고, 밤새 배양한다.모든 종양 세포는 어떠한 세포도 누락되지 않고 웨이브 칩의 어레이 주위에 포획되었으며, 이는 미세유체 칩의 높은 포획 효율을 나타낸다. Hoechst 및 Calcein AM으로 염색된 종양 세포가 여기에 표시됩니다. 작은 타원 마이크로 필터를 사용하여 캡처한 위암 환자의 CTC가 여기에 표시됩니다.또한 사다리꼴 마이크로 필터를 사용하여 캡처하고 청색 및 녹색 형광을 모두 방출하는 대장암 환자의 CTC가 표시됩니다. 큰 타원 마이크로필터를 사용하여 포획된 종양 세포에 대해 높은 포획 효율 및 생존력이 관찰되었습니다. 미세유체 칩에 포획된 결장직장 CTC의 임상 면역형광 분석은 CTC를 DAPI 양성, CK 양성, CD45 음성으로, WBC를 DAPI 양성, CK 음성, CD45 양성으로 인식했습니다.포획 후 큰 타원 칩 상에서 배양된 결장직장 종양 세포와 큰 타원 마이크로필터에 포획된 결장직장 종양 세포가 여기에 도시되어 있다. 앱타머로 변형하는 이 방법은 CTC 분리를 풍부하게 하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

배우세요 임상 미세유체 칩을 활용한 순환 종양 세포 분리 및 계수 방법을. MCF-7, MDA-MB-231, HeLa 세포주를 사용하여 혈액 샘플에서 CTC를 효율적으로 포착하고 면역형광 염색으로 신속하게 식별하는 기술을 익히세요.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

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