Name: Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 Tol2 트랜스제네시스 시스템을 활용한 제브라피시(Danio rerio) 트랜스제닉 생성 방법을. 모듈식 게이트웨이 기반 클로닉으로 FASD 연구 및 발달생물학에서 유전자 기능을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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이 기사에 제시된 연구는 국립 보건원/국립 알코올 남용 연구소(NIH/NIAAA) R00AA023560에서 CBL에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

이 절차에 사용된 모든 제브라피쉬 배아는 확립된 IACUC 프로토콜12에 따라 사육 및 사육되었습니다. 이 프로토콜은 루이빌 대학교의 승인을 받았습니다.
참고: 야생형 제브라피쉬 균주인 AB와 bmp4st72;smad5b1100 이중 돌연변이 계통이 이 연구에 사용되었습니다. 이 과정에서 사용된 모든 물은 멸균 역삼투압수였다. 컨포칼 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 촬영되었습니다. 내배엽 측정은 ImageJ의 측정 도구를 사용하여 이루어졌습니다. 모든 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
1. 솔루션과 미디어 만들기
<ol><li>박테리아 배지: 제조업체의 지침에 따라 LB 국물 또는 한천을 녹이고 오토클레이브합니다. 배지를 100mm 페트리 접시에 붓기 전에 암피실린(50μg/mL), 카나마이신(50μg/mL) 또는 암피실린/클로람페니콜 조합(각각 50μg/mL 및 30μg/mL)을 추가합니다.</li>
	<li>20x 배아 배지 스톡을 만들기 위해, 다음을 1 L의 물에 용해시킨다: 17.5 g의 NaCl, 0.75 g의 KCl, 2.9 g의 CaCl2, 0.41 g의 K2HPO4, 0.142 g의 Na2HPO4 및 4.9 g의 MgSO4·7H2O.0.22 μm 진공 여과 시스템을 사용하여 원액을 필터 멸균하고, 4 °C에서 보관하십시오. 알림: 형성되는 흰색 침전물을 무시하십시오. 이것은 미디어에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>19 L의 물에 1.2 g의 NaHCO3를 용해시키고, 1 L의 20x 배아 배지 스톡을 첨가하여 작업 배아 배지 용액을 생성하고, 이 용액을 28°C에서 유지한다.</li>
	<li>2 % 페놀 레드 용액의 경우 페놀 레드 나트륨 염 20mg을 RNase가없는 물 1mL에 녹여 실온에서 보관합니다.</li>
</ol>2. 배아 사출 금형
<ol><li>아가로스 주입판을 만들기 위해, 끓을 때까지 가열하여 배아 배지를 최종 농도 3%로 용해시킨다.</li>
	<li>50mL의 아가로스를 100mm 페트리 접시에 붓고, 아가로스가 여전히 액체인 동안, 몰드 아래에 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 아가로스에 사출 몰드를 부드럽게 놓습니다.</li>
	<li>아가로스 플레이트를 식히십시오. 아가로스가 고체가 되면, 사출 몰드를 제거하고, 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>3. 주입 피펫
<ol><li>솔레노이드가 2.5로 설정되고 발열체가 14.6으로 설정된 수직 피펫 풀러를 사용하여 필라멘트가 포함된 1.0mm(OD) 모세관을 바늘로 당깁니다. 알림: 가열된 풀러는 모세혈관을 두 개의 바늘로 깨끗하고 고르게 당기면 작동하지만 일관된 주사 결과를 얻으려면 제브라피쉬 배아를 주사한 후 1주일 이내에 주사 바늘을 당겨야 합니다.<ol><li>풀러에 모세관을 놓고 클램프를 조이고 양쪽 끝을 조인 다음 발열체를 작동시킵니다.</li>
		<li>모세관을 당겨 두 개의 주사 바늘을 만듭니다.</li>
		<li>풀러에서 모세관을 제거하고 바늘 홀더 역할을 하는 모델링 점토 스트립이 있는 빈 페트리 접시에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 트랜스포이즈아제 mRNA 제제
<ol><li>0.5mL 미세원심분리기 튜브에서 10μL의 트랜스포이즈아제 플라스미드(150ng/μL), 1.5μL의 제한 엔도뉴클레아제 반응 완충액, 0.3μL의 NotI 엔도뉴클레아제를 조합하여 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 트랜스포이즈아제를 포함하는 Tol2Kit 플라스미드를 선형화합니다.</li>
	<li>RNase가 없는 물로 최대 20μL의 반응을 채운 다음 37°C에서 밤새 혼합하고 분해합니다.</li>
	<li>1 μL의 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL의 5 MNH4OAc, 및 80 μL의 100% EtOH를 분해 반응에 첨가하여 트랜스포사제 분해를 중지한 다음, -20 °C에서 밤새 혼합하고 냉각시킨다.</li>
	<li>용액을 4°C에서 20분 동안 14,000x g 로 원심분리한 다음, 상층액을 흡인하고 RNase가 없는 물에 DNA 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>먼저 RNase가 없는 워터 블랭크 2μL를 실행한 다음 선형화된 플라스미드 2μL를 실행하여 형광측정기를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위의 선형 플라스미드 농도를 결정합니다. 참고: 플라스미드 농도는 일반적으로 100-200ng/μL 범위입니다</li>
	<li>0.5mL 미세원심분리기 튜브에서 10μL의 2x NTP/CAP, 2μL의 10x 반응 완충액, 0.1-1μg의 선형 DNA 주형 및 2μL의 SP6 효소 혼합물과 같은 성분을 순서대로 조합하여 SP6 mRNA 생산을 설정합니다.</li>
	<li>RNase가 없는 물로 최대 20μL의 반응을 채운 다음 37°C에서 2시간 동안 혼합하고 배양합니다.</li>
	<li>2시간 동안 배양한 후 1μL의 DNase를 넣고 잘 섞은 다음 37°C에서 추가로 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>SP6 반응을 중지하려면 30μL의 LiCl 침전 용액을 반응 튜브에 추가한 다음 혼합하고 -20°C에서 밤새 냉각합니다.</li>
	<li>용액을 4°C에서 20분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하여 mRNA를 펠릿화한 다음, 상청액을 흡인하고 mRNA 펠릿을 80% EtOH 1mL(RNase가 없는 물로 희석됨)로 세척합니다.</li>
	<li>용액을 4°C에서 20분 동안 14,000 x g 로 원심분리하여 mRNA를 펠릿화한 다음, 상청액을 흡인한다. 펠릿을 공기 중에서 건조시키십시오.</li>
	<li>RNase가 없는 물 20μL에 mRNA 펠릿을 재현탁하고, 4.5단계(최소 100ng/μL이어야 함)에 설명된 대로 형광계를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위의 mRNA 농도를 결정하고, 일회용으로 튜브당 mRNA 100ng을 분취하고, -80°C에서 보관합니다. 참고: mRNA가 분해되지 않도록 하기 위해 2μL의 mRNA를 DNA 전기영동 겔에서 신속하게 실행하여 1,950bps에서 단일 밴드를 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 형질전환을 위한 진입 벡터를 생성하기 위한 다중 사이트 게이트웨이 복제
참고: 이 프로토콜은 Kwan et al.10에서 수정되었으며, LR 반응은 half-LR 반응으로 작성되었으며 총 부피는 5μL입니다. 새로운 진입 요소를 생성하기 위해, 5', 중간, 및 3' 공여체 벡터를 사용하는 BP 반응이10,13을 사용될 필요가 있다.
<ol><li>반응을 수행하기 위해 p5E, pME 및 p3E의 각각 10fmol과 대상 벡터(pDest)의 20fmol을 수집합니다. 참고: 다중 부위 LR 재조합은 5' 진입 벡터(p5E), 중간 진입 벡터(pME), 3' 진입 벡터(p3E) 및 목적지 벡터(pDest)의 4가지 다른 플라스미드 벡터를 사용하여 제브라피쉬 배아에 주입할 준비가 된 Tol2 반복이 측면에 있는 고유한 형질전환 구조를 생성합니다.<ol><li>플라스미드 공급원으로부터 염기쌍에서 4개의 벡터 모두의 크기를 확인한다(표 1, Tol2Kit Wiki페이지 14 또는 Addgene11; 재료 표 참조). 참고: 새로운 벡터의 경우 상용 시퀀싱 회사를 통한 전체 플라스미드 시퀀싱을 통해 정확한 플라스미드 크기(bps)를 제공할 수 있습니다.</li>
		<li>4.5단계에서 설명한 대로 형광측정기를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위로 4개 벡터의 농도를 모두 측정합니다.</li>
		<li>DNA의 무게를 660g/mol로 사용하고 플라스미드 크기(bps)를 사용하여 10fmol(진입 벡터) 또는 20fmol(대상 벡터)에 도달하는 데 필요한 플라스미드의 총 나노그램(ng)을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 콜로라도 대학교(University of Colorado, Anschutz Medical Campus)의 Mosimann 연구실은 LR 반응에 필요한 플라스미드의 양(ng)과 벡터의 부피(μL)를 계산하기 위해 무료로 사용할 수 있는 스프레드시트를 생성했습니다15.</li>
	</ol></li>
	<li>이하에 기술된 구축물 sox17:EGFPCAAX를 생성하기 위해, 하기 벡터를 사용한다: 크기16에서 6,918 bp인 제브라피쉬 sox17 프로모터를 함유하는 p5E 벡터; 크기가10인 프레닐화 EGFP를 포함하는 pME 벡터; 크기가10인 SV40 후기 poly A 신호 서열을 포함하는 p3E 벡터; 그리고 pDest는 크기 5,883에서10bp입니다.</li>
	<li>5.1.2단계에서 측정된 플라스미드 농도와 각 벡터(단계 5.1.3)에 대한 나노그램(ng) 단위의 양을 사용하여 10fmol(진입 벡터) 또는 20fmol(대상 벡터)에 도달하는 데 필요한 각 플라스미드의 총 마이크로리터(μL)를 계산한 다음 5μL half-LR 반응에 사용하기 위해 이를 2로 나눕니다(아래 나열된 모든 값은 표 2에 나열됨). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>10fmol의 p5E-sox17을 생성하려면 45.66ng(농도 140.3ng/μL)를 사용하고 멸균수로 4배 희석하여 0.65μL를 얻습니다.</li>
		<li>10fmol의 pME-EGFPCAAX를 생성하려면 22.08ng(213.5ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 10배 희석하여 0.52μL를 얻습니다.</li>
		<li>10fmol의 p3E-poly A를 생성하려면 15.73ng(276.1ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 20배 희석하여 0.57μL를 얻습니다.</li>
		<li>대상 벡터 20fmol의 경우 77.66ng의 pDest(307.3ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 5배 희석하여 1.63μL를 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>5μL half-LR 반응을 설정하려면 5.3단계에서 측정된 p5E, pME, p3E 및 pDest의 부피를 0.5mL 미세 원심분리기 튜브에 결합한 다음 멸균수를 추가하여 총 반응 부피 4μL에 도달합니다.</li>
	<li>LR 효소 혼합물을 각각 1분 동안 2회 격렬하게 소용돌이쳐 적절한 혼합을 확인한 다음 반응에 1μL를 추가하고 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>25°C에서 하룻밤(16+ 시간)에 배양합니다.</li>
	<li>0.5μL의 프로테이나제 K(2μg/μL)를 첨가하여 LR 반응을 중지하고 37°C에서 10분 동안 배양한 다음 실온으로 냉각합니다.</li>
	<li>플라스미드를 첨가하고 세포를 25-30분 동안 얼음 위에 두어 3-4μL의 플라스미드를 해동되고 화학적으로 유능한 세포로 변환합니다.</li>
	<li>세포가 얼음 위에 앉아있는 동안 두 개의 LB- 암피실린 한천 플레이트를 실온으로 따뜻하게합니다.</li>
	<li>42°C 수조에서 정확히 30초 동안 셀을 열 충격합니다.</li>
	<li>열 충격 후 250μL의 항생제가 없는 풍부한 액체 배지를 세포에 추가하고 37°C에서 1.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다.</li>
	<li>하나의 암피실린 플레이트에 박테리아 300μL를 뿌리고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음날 아침, 콜로니를 투명 및 불투명의 두 가지 표현형의 존재에 대해 스크리닝하고, 투명한 콜로니(Kwan et al.10에 설명된 대로)를 한 번에 하나씩 선택하고, 액체 배양물을 접종한 다음, 37°C에서 밤새 진탕합니다. 참고: 투명 콜로니에는 거의 항상 올바른 LR 콜로니가 포함됩니다(&gt;85%).</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 각 액체 배양에 대해 플라스미드 준비를 수행하고 각 플라스미드를 진단적으로 분해하여 형질전환 구조체의 적절한 크기를 확인하며, 이는 LR 게이트웨이 반응이 제대로 작동했음을 나타냅니다.</li>
	<li>0.5-1 μL의 플라스미드를 사용하여 단계 5.4-5.12에 기술된 바와 같이 표준 박테리아 형질전환 프로토콜을 사용하여 올바른 형질전환 구축물을 재형질전환하고, 단지 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>콜로니를 다시 줄무늬로 만들고 각각이 단계 5.14에서와 같이 LR 형질전환 구조를 갖는지 확인합니다.</li>
	<li>4.5단계에 설명된 대로 플라스미드 농도를 결정합니다(배아 주입에는 최소 150ng/μL이 필요함).</li>
</ol>6. 배아에 이식유전자 주입
<ol><li>일회용 트랜스포이즈제 mRNA 샘플 및 Tol2 형질전환 구조체를 얼음 위에서 해동하고 아가로스 주입 플레이트를 실온으로 사전 경고합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 플라스미드 150ng, 전이효소 mRNA 100ng, 2% 페놀 레드(0.3μL)를 혼합합니다. 그런 다음 RNA가 없는 물을 추가하여 부피를 3μL로 만듭니다.</li>
	<li>이식 피펫을 사용하여 하나의 세포 단계 배아를 한천을 완전히 덮는 EM으로 채워진 주입 플레이트(2단계에서 설명됨)로 옮긴 다음 주입 플레이트의 슬롯당 약 50-75개의 배아를 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물을 모세관 주사 바늘의 열린 끝에 추가하고 모세관 바늘을 주입 장비 전기자에 놓고 주입 장비를 켭니다. 참고: 주입 장비는 공기와 같은 압축 가스를 사용하여 활성화될 때 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 원하는 부피(6.5단계에서 설명)를 배아로 펄스합니다.</li>
	<li>모세관 바늘을 주입판의 EM으로 내리고 집게를 사용하여 팁을 부수어 주입 장비에서 소량의 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물만 펌핑할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 작은 3nL 볼루스를 배아의 세포체에 주입합니다. 참고: 3nL 볼루스는 이론적으로 7개의 볼루스가 배아의 정중선에 균등하게 맞을 수 있는 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 부피입니다.</li>
	<li>배아 주입이 끝나면 배아를 슬롯에서 부드럽게 꺼내 주입 플레이트에서 제거하고 신선한 EM(약 40mL)이 담긴 100mm 페트리 접시에 옮겨 피펫팅한 다음 28.5°C에서 배양하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다.</li>
</ol>7. 형질전환 삽입을 위한 배아 스크리닝
<ol><li>형광 단백질의 발현을 위해 형광 이식유전자가 발현되어야 하는 적절한 발달 단계를 선택하고 형광 해부 현미경으로 형광의 존재 여부를 스크리닝합니다. 참고: 이 배아는 발현이 모자이크이며 형질전환 구조의 게놈 삽입을 보여줍니다.</li>
	<li>별개의 표적 벡터에 함유되어 있는 αcyrstallin의 수정체 특이적 프로모터에 의해 구동되는 유전자 cmlc2 또는 mCherry에 대한 심장 특이적 프로모터에 의해 구동되는 GFP와 같은 형광 트랜스제닉 마커 (단계 7.1에 기재된 바와 같음)를 스크리닝하여 비-형광 도입 유전자를 스크리닝한다.</li>
	<li>형질전환 삽입에 양성인 배아가 성체 제브라피쉬 단계로 완전히 발달하도록 합니다.</li>
	<li>잠재적인 형질전환 어류가 번식기에 도달하면 야생형 제브라피쉬로 번식시켜 생식계열 전파 및 형질전환 유전자 발현성 모두에 대해 개별적으로 선별합니다.</li>
	<li>배아가 정상적으로 발달하고 가장 강력하고 적절한 이식유전자 발현을 제공하는 성인은 향후 작업 및 분석을 위해 고유한 형질전환 제브라피쉬 계통으로 유지됩니다. 참고: 형질전환 구조체의 게놈 삽입을 스크리닝하는 대체 접근 방식으로, 야생형 DNA가 아닌 형질전환 구조체만 증폭하는 PCR 프라이머를 설계합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Zebrafish는 에탄올 노출이 발달 및 질병 상태에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다 7,8. 제브라피쉬는 반투명하고, 외부 수정되고, 유전적으로 다루기 쉬운 배아를 대량으로 생산하며, 이를 통해 여러 환경적 맥락에서 여러 이식유전자 표지 조직 및 세포 유형을 동시에 생생하게 이미징할 수 있다19,20. 이러한 강점은 인간과의 강력한 발달 유전 보존과 결합되어 제브라피쉬를 에탄올 7,8의 영향을 이미징하기 위한 강력한 모델 시스템으로 만듭니다. 여기에서 우리는 형질전환 구조물을 생성 및 주입하고 향후 에탄올 연구를 위해 형질전환 제브라피쉬 계통을 설정하기 위한 모듈식 접근 방식에 대한 프로토콜을 설명했습니다....

태아기 에탄올 노출은 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)라고 하는 구조적 결함 및 인지 장애의 연속체를 유발합니다.1,2,3,4. 여러 요인 간의 복잡한 관계는 인간에서 FASD의 병인을 연구하고 이해하는 것을 어렵게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 동물 모델이 사용되었습니다. 이 모델에서 사용할 수 있는 생물학적 및 실험적 도구는 에탄올 기형 유발성의 기계론적 기초에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 것으로 입증되었으며, 이러한 모델 시스템의 결과는 인간 에탄올 연구에서 발견된 것과 현저하게 일치했습니다 5,6. 이 중 제브라피쉬는 에탄올 기형 형성을 연구하는 강력한 모델로 부상했습니다.7,8, 부분적으로는 외부 수정, 높은 번식력, 유전적 다루기 쉬움 및 반투명 배아로 인해 발생합니다. 이러한 강점이 결합되어 제브라피쉬는 형질전환 제브라피쉬 계통을 사용한 FASD의 실시간 라이브 이미징 연구에 이상적입니다.
형질전환 제브라피쉬는 배아 발달의 여러 측면을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다9. 그러나 형질전환 구조체 및 후속 형질전환 계통을 만드는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 표준 이식유전자는 이식유전자를 구동하기 위한 활성 프로모터 요소와 폴리 A 신호 또는 "꼬리"를 필요로 하며, 모두 일반적인 벡터 유지를 위해 안정적인 박테리아 벡터에서 필요합니다. 다성분 형질전환 구축물의 전통적인 생성은 여러 시간이 소요되는 서브클로닝 단계(sub-cloning steps)를 필요로 한다(10). Gibson 어셈블리와 같은 PCR 기반 접근 방식은 하위 복제와 관련된 일부 문제를 우회할 수 있습니다. 그러나, 독특한 프라이머는 모든 독특한 형질전환 구축물10의 생성을 위해 설계되고 시험되어야 한다. 이식유전자 구성 외에도 게놈 통합, 생식계열 전달 및 적절한 이식유전자 통합을 위한 스크리닝도 어려웠습니다. 여기서는 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템(Tol2Kit)을 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다(10,11). 이 모듈식 시스템은 다중 사이트 게이트웨이 클로닝을 사용하여 계속 확장되는 "진입" 및 "대상" 벡터 라이브러리에서 여러 형질전환 구조를 신속하게 생성합니다. 통합된 Tol2 전치 가능한 요소는 형질전환 속도를 크게 증가시켜 여러 형질전환 유전자의 신속한 구성 및 게놈 통합을 가능하게 합니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 내배엽 형질전환 제브라피쉬 계통의 생성이 FASD의 기초가 되는 조직 특이적 구조적 결함을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 궁극적으로, 이 프로토콜에서 우리는 모듈식 설정과 형질전환 구조의 구성이 제브라피쉬 기반 FASD 연구에 크게 도움이 될 것임을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2 도구 상자</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>공기</td><td></td><td></td> 대학에서 <td>직접 제공</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID 모세관</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>형광 해부 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab 기증자 플라스미드 준비</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>저EEO/다목적/분자 생물학 등급 Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus</td><td>Enzyme Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 (헵타하이드레이트)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 0.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 팁 10 &mu; 엘&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 1000 &mu; 엘&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 200 &mu; 엘&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 계산 워크시트</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 나트륨 염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L 마이크로 피펫</td><td></td><td>Gilson FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨(이염기성)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>압력 인젝터</td><td>응용 과학 기기</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 Miniprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 (이염기성)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 &micro; M 진공 여과 시스템&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki 페이지</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chemically Competent E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>수직 피펫터 풀러</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>제브라피시 미세 사출 금형</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 태아기 에탄올 노출로 인해 발생하는 매우 다양한 구조적 결함 및 인지 장애가 특징입니다. FASD의 복잡한 병리로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 발달 결함에 대한 현재의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Zebrafish는 제브라피쉬와 인간 사이의 유전학 및 발달 모두의 높은 수준의 보존으로 인해 에탄올로 인한 발달 결함을 조사하는 강력한 모델임이 입증되었습니다. 모델 시스템으로서 제브라피쉬는 유전적으로 다루기 쉽고 반투명한 많은 수의 외부 수정 배아를 포함하여 발달 연구에 이상적인 많은 특성을 가지고 있습니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 시기와 투여량을 정확하게 제어할 수 있습니다. 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 중요한 유전 도구 중 하나는 형질전환입니다. 그러나 형질전환 구조체를 생성하고 형질전환 계통을 설정하는 것은 복잡하고 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 연구자들은 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템을 구축했습니다. 이 모듈식 시스템은 완전한 Tol2 트랜스포존 기반 형질전환 구조의 빠른 조립을 위해 다중 사이트 게이트웨이 클로닝 접근 방식을 사용합니다. 여기에서는 유연한 Tol2 시스템 도구 상자와 제브라피쉬 형질전환을 위한 준비가 된 형질전환 구조를 생성하고 에탄올 연구에서의 사용을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

형질전환 구축물을 생성하기 위해, 본 발명자들은 Tol2 형질전환 시스템을 사용하였다. 유전자 프로모터/인핸서 요소를 보유하는 p5E, 프로모터/인핸서 요소에 의해 발현되는 유전자를 보유하는 pME 및 최소한 polyA 테일을 보유하는 p3E를 포함한 3개의 진입 벡터를 사용하여 다중 사이트 게이트웨이 LR 클로닝을 통해 형질전환 구축물을 생성했습니다. 대상 벡터인 pDest는 제브라피쉬 배아에서 형질전환 구조체의 게놈 삽입을 위한 Tol2 반복을 제공하며 박테리아 성장에 필요한 모든 필수 유전 정보를 포함합니다(그림 1A). 이 원고의 목적을 위해 우리는 sox17:EGFPCAAX 형질전환 구조체를 만들고 주입했습니다. 내배엽 마커의 프로모터인 sox17은 제브라피쉬의 발달 중인 내배엽에서 막 표지 EGFP를 구동하는 데 사용되었습니다. 비형광단 단백질을 발현하는 형질전환 구조체의 경우, cmlc2:EGFP 와...

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

형질전환 제브라피쉬는 배아 발달에 대한 우리의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Tol2 시스템은 연구자들이 FASD 연구를 위해 여러 형질전환 제브라피쉬를 빠르고 체계적으로 생성할 수 있도록 하는 다목적 도구입니다. 모듈식 설계와 새로운 키트 구성 요소 생성의 용이성으로 인해 Tol2 시스템은 키트의 구성 요소를 재설계할 필요 없이 새로운 형질전환체를 생성할 수 있는 다목적 도구입니다.이 기술을 처음으로 수행하는 연구자들에게 드리는 조언은 형질전환 구조물의 생성 및 주입의 정밀도를 훈련하기 위해 여러 차례 시운전을 하라는 것입니다. 먼저, 500 마이크로리터 마이크로원심분리기 튜브에서 10 마이크로리터의 트랜스포사제 플라스미드, 1.5 마이크로리터의 제한 엔도뉴클레아제 반응 완충액 및 0.3 마이크로리터의 엔도뉴클레아제를 조합하여 트랜스포사제를 함유하는 Tol2 키트 플라스미드를 노우트 원 제한 엔도뉴클레아제로 선형화합니다. RNAse가 없는 물로 최대 20마이크로리터의 반응을 채웁니다.섭씨 37도에서 밤새 섞고 소화하십시오. 다음날, 0.5 몰 EDTA 1 마이크로 리터, 5 몰 암모늄 아세테이트 2 마이크로 리터 및 100 % 에탄올 80 마이크로 리터를 반응 혼합물에 첨가하여 소화를 중지시킨다. 밤새 섭씨 영하 20도에서 섞고 식히십시오.다음날, RNAse가 없는 물에 DNA 펠릿을 재현탁하기 전에 상층액을 원심분리하고 흡인합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 샘플을 실행하여 형광계에서 마이크로리터당 나노그램 단위의 선형 플라스미드 농도를 결정합니다. 500 마이크로리터 튜브에서 2 마이크로리터의 SP6 효소 혼합물에 10 마이크로리터의 2X NTP/CAP, 2 마이크로리터의 10X 반응 완충액, 0.1 내지 1 마이크로그램의 선형 DNA 주형을 결합하여 SP6 mRNA 생산을 설정합니다.RNAse가 없는 물로 최대 20마이크로리터의 반응을 채우고 섭씨 37도에서 배양하기 전에 혼합합니다. 2 시간 후, 1 마이크로 리터의 DNAse를 첨가하고, 잘 섞고, 추가로 15 분 동안 배양한다. 30 마이크로리터의 염화리튬 침전 용액을 첨가하여 반응을 중지시킨다.밤새 섭씨 영하 20도에서 섞고 식히십시오. 다음날, 용액을 원심분리하여 mRNA를 펠릿화하고 상청액을 흡인하기 전에 펠릿을 1밀리리터의 80% 에탄올로 세척합니다. 펠릿을 자연 건조하고 20마이크로리터의 RNAse가 없는 물에 재현탁합니다.형광측정기를 사용하여 mRNA 농도를 측정한 다음 튜브당 mRNA 100나노그램을 일회용으로 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 반응을 수행하기 위해 P5E, PME 및 P3E의 각각 10 펨토몰과 대상 벡터 PDEST의 20 펨토몰을 수집합니다. 플라스미드 소스에서 4개의 벡터와 염기쌍의 크기를 모두 식별합니다.DNA의 무게를 몰당 660g으로 사용하고 플라스미드 크기 및 염기쌍을 사용하여 4개 벡터 모두의 농도를 결정한 후 진입 벡터의 경우 10펨토몰 또는 대상 벡터의 경우 20펨토몰에 도달하는 데 필요한 플라스미드의 총 나노그램을 계산합니다. 다음으로, 원고에 설명된 구성 요소를 사용하여 구조 sox17:EGFP-CAAX를 생성합니다. 플라스미드 농도를 사용하여 10 펨토몰 또는 20 펨토몰에 도달하는 데 필요한 각 플라스미드의 총 마이크로리터를 계산한 다음 이를 2로 나누어 5마이크로리터 반 LR 반응에 사용합니다.P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A)의 10펨토몰 및 대상 벡터의 20펨토몰을 생성합니다. 500마이크로리터 튜브에서 P5E, PME, P3E 및 PDEST의 부피를 결합하여 5마이크로리터 절반 LR 반응을 설정합니다. 그런 다음 멸균 수를 넣어 부피를 4 마이크로 리터로 만듭니다.반응물에 1마이크로리터를 추가하기 전에 LR 효소 혼합물을 각각 1분 동안 두 번 소용돌이하고 섭씨 25도에서 배양하기 전에 완전히 혼합합니다. 다음날, 0.5 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 K.Incubate를 섭씨 37도에서 10 분 동안 첨가 한 다음 실온으로 냉각하여 LR 반응을 중지하십시오. 다음으로, 플라스미드를 첨가하고 세포를 25 내지 30분 동안 얼음 위에 방치함으로써 플라스미드 3 내지 4 마이크로리터를 해동된 화학적으로 유능한 세포로 변형시킨다.그런 다음 섭씨 42도의 수조에서 30초 동안 세포를 열 충격합니다. 열 충격 후 250마이크로리터의 항생제가 없는 풍부한 액체 배지를 세포에 넣고 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 하나의 암피실린 Luria-Bertani 플레이트에 300 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 뿌리고 밤새 배양합니다.다음 날, 두 가지 표현형이 있는지 콜로니를 스크리닝합니다: 투명 및 불투명. 투명한 콜로니를 한 번에 하나씩 골라 액체 배양액을 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 흔든다. 플라스미드 150 나노그램, 트랜스포이즈아제 mRNA 100 나노그램, 2% 페놀 레드를 얼음 위에 올려 놓습니다.그런 다음 RNA가 없는 물을 추가하여 부피를 3마이크로리터로 만듭니다. 이식 피펫을 사용하여 한 세포 단계 배아를 EM으로 채워진 주입 플레이트에 이식하고 한천을 완전히 덮은 다음 주입 플레이트의 슬롯 당 약 50-75 개의 배아를 부드럽게 누릅니다. mRNA 플라스미드 페놀 레드 혼합물을 모세관 주사 바늘의 열린 끝에 추가합니다.모세관 바늘을 사출 장비 전기자에 놓고 사출 장비를 켭니다. 바늘을 주입판으로 내리고 집게를 사용하여 팁을 부수어 주입 장비에서 소량의 혼합물만 펌핑할 수 있도록 합니다. mRNA 플라스미드 페놀 레드 혼합물의 3나노리터 볼루스를 배아의 세포체에 주입합니다.완료되면 주입 플레이트에서 배아를 슬롯에서 부드럽게 꺼내 제거하고 신선한 EM이 있는 100mm 페트리 접시에 피펫팅하여 옮깁니다. 섭씨 28.5도에서 배양하십시오. 형광 이식유전자 발현을 위한 적절한 발달 단계를 선택하고 형광 해부 현미경으로 스크리닝합니다. 유전자 Cmlc2에 대한 심장 특이적 프로모터에 의해 구동되는 GFP와 같은 형광 형질전환 마커를 스크리닝하여 비형광 이식유전자를 스크리닝합니다.형질전환 삽입에 양성인 배아가 성체로 발달하여 번식기에 도달하면 야생형 제브라피쉬로 번식하여 생식계열 전파 및 형질전환 유전자 발현성을 개별적으로 선별합니다. LR 재조합의 형질전환으로부터 얻어진 박테리아 콜로니의 예가 도시되어 있다. 투명한 콜로니는 85% 이상 정확한 LR 재조합 산물을 함유한 반면, 불투명한 콜로니는 올바른 재조합 산물을 포함하지 않았습니다.LR 재조합 산물의 형질전환으로부터 3개의 콜로니의 진단적 소화는 단일 불투명 콜로니가 어떠한 플라스미드도 함유하지 않은 반면, 2개의 투명 콜로니는 9, 544 염기쌍에서 단일 밴드를 함유하는 것으로 나타났다. 1, 950 염기쌍에서의 트랜스포이즈아제 mRNA가 여기에 제시되어 있다. 모자이크 내배엽 EGFP-CAAX 발현은 주입된 배아의 75%에서 관찰되었다.발달 중인 심장에서 EGFP의 형질전환 마커인 Cmlc2의 발현은 수정 후 24시간에 관찰되었다. 성체 제브라피쉬는 sox17:EGFP-CAAX의 생식계열 전달을 가지고 있었고 내배엽은 EGFP-CAAX로 완전히 표지된 형광 배아를 생성했습니다. 내배엽의 전후부 길이 및 각 파우치의 등-복부 길이 1 내지 5 둘 다를 대조군 및 에탄올 처리된 야생형 BMP 돌연변이 배아에서 측정하였다.내배엽의 전체 길이는 유전자형이나 치료에 영향을 받지 않았습니다. 그러나, 파우치 1 및 3은 처리되지 않은 야생형 배아와 에탄올 처리된 야생형 배아 사이에서 파우치 길이에서 유의한 증가를 보였지만, 처리되지 않은 BMP 돌연변이체와 에탄올 처리된 BMP 돌연변이체 사이에서는 길이가 유의하게 감소하였다. 파우치 2는 각각 처리되지 않은 야생형 및 BMP 돌연변이 그룹과 에탄올 처리된 군에서 파우치 크기의 현저한 증가를 보였다.이 절차를 시도할 때 Tol2 시스템의 피펫팅 및 희석과 배아 주입 중 세포체에 부딪히는 것을 정밀하게 하는 것이 중요합니다.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 발달 규제 유전자의 잠재적인 확장기 요소를 찾아서 모자이크 zebrafish의 transgenesis 통해 기능을 평가하기 위해 방법을 보여줍니다.

향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

이 비디오에서는 형광 전압 지시자를 인코딩하는 전이효소 mRNA 및 Tol2 전이 구축물을 포함하는 Tol2 전이 시스템의 동시 주입 후 형광 전압 지시 단백질을 구성적으로 발현하는 안정적인 제브라피시 형질전환 라인을 생성하는 절차를 보여줍니다.

Tol2 Transposon-Mediated Zebrafish Transgenesis: 수정된 제브라피시 배아에 Tol2 시스템을 동시 주입한 후 형질전환 제브라피시를 생성하는 절차

이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

번식 및 생체 내 연구에 적합한 제브라피시 시설이 쉽고 저렴한 방식으로 지어졌습니다. 유지 보수가 최소화됩니다. 이 시설은 학생 참여 및 독립적인 연구에 이상적입니다.

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

이 연구의 목표는 제브라피시에서 모자이크 형질전환 전략을 사용하여 종양 시작 및 생체 내 진행에서 여러 종양 유전자의 상대적 기여도를 빠르고 효율적으로 평가하는 방법을 보여주는 것입니다.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

배우세요 Tol2 트랜스제네시스 시스템을 활용한 제브라피시(Danio rerio) 트랜스제닉 생성 방법을. 모듈식 게이트웨이 기반 클로닉으로 FASD 연구 및 발달생물학에서 유전자 기능을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

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