Name: Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 형광 모니터링 방법을. 팔미트산 장벽을 활용한 이 기술은 노화 연구와 유전자 발현 추적에 필수적인 도구입니다.

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이 작업은 GLS에 대한 NIH R35GM133588, LE에 대한 NIHT32GM008659 교육 보조금, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금의 지원을 받았습니다.

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없다고 말합니다.

여기에서는 원래 인간 백혈구 항원 조직 유형 분석을 위해 개발된 마이크로트레이를 적용하여 C. elegans 연구의 표준인 한천 기반 NGM과 맥락적으로 유사한 고체 배지 환경에서 시간이 지남에 따라 단일 예쁜꼬마선충의 분리 및 특성화를 허용하는 새로운 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 식이 제한, 외인성 약물 치료, 화학적 또는 환경적 스트레스 요인에 대한 도전 및 RNAi를 포함한 다양한 개입과 호환됩니다. 또한 개별 동물에서 생체 내 형광 바이오마커의 종단 모니터링을 가능하게 합니다. 개체군 내에서 개별 동물을 추적할 수 있는 능력은 행동, 병인, 스트레스 상태에 대한 반응 및 건강 감소를 포함하여 뚜렷한 시간적 구성 요소를 가진 표현형에 대해 개체군 내에서 개인 내 가변성을 평가할 수 있도록 합니다. 또한 인구 내에서 다양한 초기 생애 특성이 수명 및 건강을 포함한 후기 생애 결과와 연결될 수 있습니다. 다른 단일 웜 이미징 기술과 유사하게, 이 마이크로트레이 기...

예쁜꼬마선충은 유전학, 세포생물학, 분자생물학 연구를 위한 강력한 모델 유기체로, 실험실에서 쉽게 배양할 수 있고, 생성 시간과 수명이 짧으며, 포유류와 높은 수준의 단백질 상동성을 공유하고, 형광 단백질과 염료를 생체 내에서 시각화할 수 있는 투명한 신체 구조를 가지고 있기 때문입니다1. 예쁜꼬마선충을 발달 생물학 및 노화를 포함한 다양한 분야에서 주요 모델 시스템으로 오랫동안 사용해 온 결과, 이들의 성장과 발달이 잘 이해되고 게놈이 완전히 시퀀싱되었으며, 게놈 차원의 RNAi 공급 라이브러리와 수천 개의 돌연변이 및 형질전환 균주를 포함한 강력한 유전 도구가 만들어졌습니다. 역사적으로 예쁜꼬마선충은 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 개체군으로 재배되며 표현형은 직접 관찰 또는 이미징 및 다운스트림 분석을 통해 수동으로 평가됩니다. 형광 현미경은 염료 또는 개별 예쁜꼬마선충 에서 형질전환적으로 발현된 형광 태그를 사용하여 다양한 분자 표현형을 캡처하는 데 사용됩니다.형광 이미징은 일반적으로 침습적이고 종종 치명적일 수 있는 얇은 아가로스 패드가 포함된 슬라이드에 동물을 고정하거나 마비시키는 것을 포함합니다. 또한 levamisole 또는 sodium azide와 같은 화학 물질의 사용이 포함되며, 이는 잠재적으로 관심있는 분자 과정을 방해 할 수 있습니다 2,3. 이러한 접근 방식을 사용하면 광범위한 표현형에 걸쳐 단면, 개체군 수준 데이터를 수집할 수 있지만 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적할 수는 없습니다.
최근 몇 년 동안 분리된 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 몇 가지 접근 방식이 등장하여 연구자들이 새로운 이미징 기술을 활용하여 시간이 지남에 따라 동물의 생리학적 및 분자적 표현형의 동적 변화를 포착할 수 있게 되었습니다. 예쁜꼬마선충 배양 접근법의 한 범주는 WormFarm4, Nemalife 칩5 및 Chronis et al.6의 '거동' 칩을 포함한 미세 유체 장치입니다 7,8,9. 이와 관련된 액체 기반 배양 방법은 다중 웰 플레이트를 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 벌레 또는 작은 개체군을 특성화합니다10,11. 미세 유체 및 마이크로플레이트 시스템은 단일 동물에 대한 예쁜꼬마선충의 표현형 반응에 대한 우수한 정량적 측정을 제공하지만 배양 환경에는 주요 한계가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 대한 과거 연구의 대다수, 특히 노화 분야는 고체 한천 기반 배지에서 완료되었습니다. 액체 배양은 예쁜꼬마선충이 지속적으로 헤엄치게 하고 기본 생물학을 바꿀 수 있는 뚜렷한 환경적 맥락을 나타냅니다. 예를 들어, 액체 배지에서 배양된 동물은 한천 기반 고체 NGM12,13에서 배양된 동물에 비해 지방 함량과 유전자 발현(특히 스트레스 반응에 관여하는 유전자의 경우)을 크게 변화시켰습니다. 단일 동물 이미징 방법의 또 다른 범주에는 페트리 플레이트의 그룹 배양에서 고체 NGM에서 배양된 벌레가 경험하는 표준 환경을 보다 밀접하게 모방하기 위해 고체 배지에서 개별 동물을 분리하는 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치가 포함됩니다. WorMotel은 고체 배지에서 개별 동물을 배양하도록 설계된 240웰 PDMS 장치입니다. 각 웰은 한천 대신 저융점 아가로스를 사용하여 변형된 NGM으로 채워지고 박테리아 식품으로 시딩되어 페트리 플레이트를 사용하는 가장 일반적인 배양 시스템과 유사한 견고한 배지 환경을 만듭니다. 우물 벽은 둥글기 때문에 우물 내의 위치에 관계없이 각 동물을 이미지화할 수 있습니다(다중 웰 플레이트의 벽 근처에 있는 동물로 인한 시각적 가려짐 방지). 각 우물을 둘러싸고 있는 좁은 해자에 있는 황산구리는 동물을 우물에 가두기 위한 억지력으로 사용된다(14,15). 이 접근법의 한계는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 또는 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질(예: 파라콰트)을 포함하여 혐오스러운 환경 조건이 존재할 때 벌레가 도망가는 것을 방지하는 데 효과적이지 않다는 것입니다.
고체 배지를 사용하는 두 번째 시스템은 웜 코랄(Worm Corral)로, 하이드로겔을 사용하여 슬라이드 상의 각 웜에 대해 작은 밀폐 환경을 생성하여, 개별적으로 격리된 동물(16)의 장기 모니터링을 가능하게 한다. 주요 제한 사항은 동물을 알처럼 환경에 밀봉해야 하므로 번식을 방지하기 위해 멸균 동물을 사용해야 하고 약물 치료를 단일 적용으로 제한해야 한다는 것입니다. 다중 용량 약물 시험은 WorMotel에서 웜을 장치로 옮기기 전에 여러 차례의 노출을 수행하거나 실험 중에 웰에 추가 약물을 국소 적으로 추가하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 후자의 경우 기존 웰에 추가 약물을 첨가한 후 실제 노출 선량을 정확하게 정량화하기 어렵고 약물이 얼마나 빨리 분해되는지에 따라 달라집니다. WorMotel과 Worm Corral은 모두 명시야 또는 암시야 이미징에 탁월하여 활동 및 동물 생리학(예: 성장 및 발달)과 관련된 정보를 캡처합니다. 이러한 시스템은 형광을 모니터링하는 데 사용할 수 있지만, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 다른 단일 웜 이미징 기술을 만드는 데 사용되는 PDMS는 특히 예쁜꼬마선충 연구에 사용되는 가장 일반적인 형광단인 GFP의 방출 범위에서 일관된 형광 시각화 및 정량화를 방해하는 불규칙한 형광 아티팩트를 생성하는 미세 기포를 형성하고, 미립자를 포집하고, 기타 작은 이상을 포착하는 경향이 있습니다. 현재까지, 예쁜꼬마선충 개별 동물의 종방향 방식의 생형광 이미징은 주로 미세유체 장치17에 의존한다.
여기에서 우리는 혐오 개입과 직접 형광 이미징 모두와 호환되는 고체 배지에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 맞춤형 성형 PDMS 칩이 원래 미세 세포 독성 분석용으로 개발된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이(일반적으로 Terasaki 트레이라고도 함)로 대체된다는 점을 제외하면 다른 단일 웜 이미징 기술과 개념이 유사합니다18. 이 마이크로트레이는 고체 배지로 채우고 박테리아 식품으로 씨를 뿌릴 수 있는 웰을 특징으로 하며, 표준 고체 NGM 배양 방법론에 따라 동물이 경험하는 환경을 밀접하게 모방합니다. 각 우물은 황산구리가 아닌 팔미트산의 혐오스러운 장벽으로 둘러싸여 있습니다. 팔미트산은 일반적으로 벌레가 식이 제한이나 화학적 스트레스 요인에 노출되는 것과 같은 혐오스러운 환경에 도전하는 실험에서 페트리 플레이트의 표준 그룹 배양을 사용하여 벌레가 고체 배지에서 도망치는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 또한 마이크로트레이는 최소한으로 일관된 형광 배경을 생성하여 배양 환경에서 직접 동물의 형광 이미징을 가능하게 합니다. 이 새로운 단일 동물 고체 한천 기반 배양 시스템은 일생 동안 개별 동물을 추적하고 성장, 발달, 활동 및 수명을 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 직접 형광 현미경과도 호환됩니다. 벌레는 마비나 고정 없이 이미지화할 수 있기 때문에 배양 배지에 남아 있는 개별 동물에서 생체 내 형광 바이오마커를 종단으로 정량화할 수 있어 각 동물의 수명 동안 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 이러한 배양 시스템은 또한 수명 및 다른 건강 지표를 추적하기 위한 현세대 자동화 시스템과도 호환된다(14,19). 우리는 이 마이크로트레이 기반 시스템에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하고, 잠재적인 함정 및 문제 해결에 대해 논의하고, 다른 시스템, 특히 업데이트되고 최적화된 WorMotel 프로토콜15와 관련된 장점과 한계에 대해 논의합니다.
각 단일 웜 배양 환경은 맞춤형 3D 인쇄 어댑터를 사용하여 표준 단일 웰 트레이 내부에 장착된 마이크로 트레이로 구성됩니다(그림 1A). 우물은 저융점 아가로스 선충 성장 배지(lmNGM)로 채워지고, 농축된 박테리아를 먹이로 씨를 뿌리고, 벌레가 도망가는 것을 방지하기 위해 팔미트산 코팅으로 둘러싸여 있습니다(그림 1B). 마이크로트레이와 단일 웰 플레이트의 벽 사이의 공간은 습도를 유지하기 위해 포화 물 결정으로 채워집니다(그림 1B). 결로를 방지하기 위해 트레이 뚜껑에 세제 코팅이 되어 있습니다. 단일 웜이 각 웰에 추가되고 단일 웰 트레이는 파라필름으로 밀봉되어 수분을 유지하고 산소 교환이 가능합니다. 최대 6개의 마이크로트레이를 한 명의 숙련된 연구원이 병렬로 합리적으로 준비할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3D 프린팅 테라사키 인서트</td><td>맞춤형 인쇄 회사</td><td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL</td><td>FDM 인쇄, 노즐 크기 0.6mm, 표준 PLA 플러스 필라멘트</td></tr><tr><td>AirClean 시스템 AC624LF 수직 층류 흄 후드</td><td>사용 Fisher Scientific</td><td>36-100-4376</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>Thermo Scientific</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 </td><td>Acros organics</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>N2</td><td>Wildtype strain</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Goldbio</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>101380</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>C. elegans</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Millipore</td><td>ex0276-4</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>FUdR&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>F10705-1.0</td><td></td></tr><tr><td>수분 공급 물 결정체&nbsp;</td><td>M2 Polymer Technologies</td><td>Type S</td><td>Type S 초흡수성 폴리머</td></tr><tr><td>이소프로필&szlig;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>GoldBio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>작업 와이프</td></tr><tr><td>LB 국물, Lennox</td><td>BD Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Leica K5 sCMOS 흑백 카메라</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA 형광 실체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>Research Products International</td><td>A20070-250.0</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M-8900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher 생물 시약</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray 단일 웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>264728</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>N1538</td><td></td></tr><tr><td>팔미트산</td><td>Acros 유기물</td><td>129700010</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>Coastwide Professional</td><td>365374</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>UV crosslinker</td></tr><tr><td>Terasaki 트레이 (람다)</td><td>하나의 람다</td><td>151431</td><td></td></tr><tr><td>Thermolyne Dri-bath</td><td>Thermolyne</td><td>DB28125</td><td></td></tr><tr><td>Tween&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr></tbody></table>

longitudinal fluorescence monitoring and averseive interventions를 위한 고체 배지에서 개별 caenorhabditis elegans 의 장기 배양

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans 는 노화 생물학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충 노화 연구의 표준 관행은 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 벌레 그룹을 배양하여 생존 및 기타 생리학적 표현형에 대한 개체군 수준 데이터를 효율적으로 수집하고 형광 바이오마커 정량화를 위해 하위 집단을 주기적으로 샘플링할 수 있도록 하는 것입니다. 이 접근법의 한계는 (1) 시간이 지남에 따라 개별 벌레를 추적하여 관심 표현형에 대한 연령 궤적을 개발하고 (2) 배양 환경의 맥락에서 형광 바이오마커를 직접 모니터링할 수 없다는 것입니다. 대체 배양 접근법은 액체 배양 또는 미세 유체 공학을 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 동물을 모니터링하며, 경우에 따라 형광 정량화를 포함하여 배양 환경이 고체 NGM과 문맥상 구별된다는 단점이 있습니다. WorMotel은 고체 NGM에서 분리된 웜을 배양하기 위한 이전에 설명한 미세 조립식 다중 웰 장치입니다. 각 벌레는 C. elegans의 접촉 방수제인 황산구리로 채워진 해자로 둘러싸인 고체 NGM을 포함하는 우물에 유지되어 개별 동물의 세로 모니터링이 가능합니다. 우리는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 및 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질을 포함하여 노화 연구에서 흔히 볼 수 있는 혐오적인 개입을 받을 때 벌레가 도망가는 것을 방지하기에 불충분하다는 것을 발견했습니다. 멀티웰 장치는 또한 형광 이미징에서 높은 배경 아티팩트를 생성하는 폴리디메틸실록산으로 성형됩니다. 이 프로토콜은 원래 인간 백혈구 항원(HLA) 유형 지정을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 고체 NGM에서 분리된 회충을 배양하는 새로운 접근 방식을 설명하여 수명 전반에 걸쳐 생존, 생리학적 표현형 및 형광을 측정할 수 있습니다. 팔미트산 장벽은 혐오스러운 조건에서도 벌레가 도망가는 것을 방지합니다. 각 플레이트는 최대 96마리의 동물을 배양할 수 있으며 식이 제한, RNAi 및 화학 첨가물을 포함한 다양한 조건에 쉽게 적응할 수 있으며 수명 및 활동 데이터 수집을 위한 자동화 시스템과 호환됩니다.

여기에 설명된 마이크로트레이 기반 단일 벌레 배양 환경은 수명 및 건강 기간, 활동 및 움직임, 체형 및 크롤링 기하학, 시간 경과에 따른 개별 동물에서 형질전환적으로 발현된 형광 바이오마커의 발현을 포함한 다양한 표현형을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로트레이 배양 시스템은 수동 스코어링 또는 이미지 수집 및 다운스트림 이미징 분석을 통한 수명 분석과 호환됩니다. 페트리 플레이트(21) 상의 표준 배양과 마찬가지로, 웜은 자극(예를 들어, 플레이트를 두드리거나 청색광에 노출)에 따른 움직임에 기초하여 수동으로 죽거나 살아 있는 것으로 스코어링될 수 있다. 이미지 기반 수명 분석의 경우 자극이 적용된 후 촬영된 이미지 간의 프레임 간 차이를 비교하여 각 웜이 움직임을 멈추는 시점을 결정합니다. 이는 자동화된 이미지 수집 및 분석 시스템과 호환되며 각 시점에서 개별 동물의 활동 수준 형태로 추가 데이터를 제공합니다. 이 정보는 수명 (운동 중단)뿐만 아니라 건강 기간 (활동 ...

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

다른 고체 배양 방법이 존재하지만, 이것은 하나의 시스템에서 개별 동물의 생명과 건강 기간에 대한 자동화된 종단 추적과 형광 바이오마커의 종단 이미징을 가능하게 하는 최초의 고체 배양 시스템입니다. 이 프로토콜은 고체 NGM에 대한 표준 C.elegans 실험과 유사한 결과를 제공하며 혐오 개입 및 직접 라이브 형광 이미징 모두와 호환됩니다. 이 시스템은 노화 연구, 특히 환경 스트레스 요인에 장기간 노출되고 장기간에 걸친 유전자 및 단백질 역학 관찰과 관련하여 매우 중요합니다.오염을 피하고 유정 전체에서 일관된 건조를 얻는 것은 모두 어려운 일입니다. 우리는 이러한 문제를 최소화하기 위해 작성된 프로토콜에서 핵심 사항을 강조했습니다. 시작하려면 박격포와 유봉에 500 밀리그램의 고체 팔 미트 산을 갈아서 부순다.50 밀리리터의 원추형 바이알에 15 밀리리터의 TWEEN 20과 결합하고 소용돌이에 의해 혼합하여 결정을 용해시킵니다. 17.5 밀리리터의 100 % 에탄올을 첨가하고 용액을 소용돌이 치면 가능한 한 많은 팔 미트 산이 용해됩니다. 그런 다음 17.5 밀리리터의 초순수를 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다.팔미트산이 완전히 용해될 때까지 섭씨 80도의 비드 수조에서 용액을 부드럽게 가열합니다. 비드 수조를 섭씨 80도까지 재가열합니다. 사용 직전에 마이크로트레이당 팔미트산 작업 용액 1밀리리터를 별도의 멸균 용기에 분취하고 가열하기 전에 팔미트산 용액 1밀리리터당 니스타틴 4마이크로리터를 추가합니다.이제 마이크로트레이 내부와 외부에 에탄올을 포화 상태로 뿌리고 여분의 에탄올을 털어냅니다. 마이크로트레이를 멸균하려면 플레이트와 뚜껑을 UV 가교제에 별도로 놓습니다. 20 분 후 접시와 뚜껑을 뒤집습니다.다음으로, 팔미트산 작동 용액이 담긴 15밀리리터 원추형 바이알을 비드 배스에 넣고 사용하기 전에 눈에 보이는 결정이 완전히 용해되도록 합니다. Microtray를 뚜껑이 닫힌 상태에서 비드 수조를 둘러싼 선반에 놓고 2분 동안 예열합니다. 마이크로트레이 뚜껑을 제거하고 마이크로트레이 후면 벽에 200마이크로리터의 팔미트산 작업 용액을 천천히 추가합니다.뚜껑을 다시 끼우고 마이크로트레이를 비드 수조에 2-3분 동안 그대로 두어 팔미트산 용액이 마이크로트레이 바닥에 가라앉도록 합니다. 마이크로트레이를 180도 회전하고 앞에서 설명한 대로 팔미트산 용액을 추가합니다. 원고에 설명된 구성 요소를 추가하여 lmNGM을 준비합니다.그런 다음 벤치에 놓인 각 마이크로트레이에 20마이크로리터의 lmNGM을 피펫팅합니다. 오염을 최소화하기 위해 피펫을 리필할 때 마이크로트레이를 덮어야 합니다. 마이크로트레이 웰에 박테리아 식품을 파종하기 위해, 3, 500 G에서 20분 동안 밤새 성장한 배양물을 원심분리한다.상청액을 제거하고 85 밀리몰 염화나트륨 용액으로 10 배 농도로 박테리아 배양을 재현탁합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 10배 농축 박테리아 배양액을 각 웰의 lmNGM 표면에 조심스럽게 피펫합니다. 박테리아 배양액이 우물 옆을 지나 팔미트산으로 흘러 들어가면 벌레가 우물을 떠나도록 유인할 수 있으므로 피하십시오.멸균 3D 프린팅 인서트를 멸균 단일 웰 플레이트에 넣습니다. 마이크로트레이를 단일 웰 플레이트의 3D 프린팅 어댑터에 넣습니다. Microtray의 외부 웰과 단일 웰 플레이트의 내부 벽 사이의 3D 프린팅 인서트 위에 물 결정을 자유롭게 분배합니다.웜이 즉시 추가되지 않으면 다음날 사용할 수 있도록 마이크로트레이를 밀봉하십시오. 트레이 뚜껑을 닫고 Parafilm 한 조각을 사용하여 4면을 모두 감싸 마이크로트레이를 밀봉합니다. Parafilm으로 밀봉 단계를 세 번 더 반복합니다.원하는 수명 단계에 도달하면 우물당 하나의 벌레를 추가합니다. 단일 웰 플레이트의 뚜껑에 40마이크로리터의 세제 용액을 넣고 작업 물티슈를 사용하여 뚜껑을 고르게 코팅합니다. 추가 작업용 물티슈를 사용하여 뚜껑을 통한 시야가 왜곡되지 않을 때까지 세제 용액을 펴십시오.Parafilm의 첫 번째 조각을 약간 늘려 트레이의 양면을 덮습니다. 작업 물티슈로 트레이 상단을 닦고 damp 70% 에탄올로 지문을 제거합니다. 접시의 측면이나 상단을 부드럽게 두드리거나 접시에 밝은 파란색 빛을 비추고 각 동물을 관찰하여 수명을 측정합니다.동물이 몇 초 안에 움직이지 않으면 죽은 점수를 매깁니다. 모든 웜이 죽을 때까지 1-3일마다 이 작업을 반복합니다. 단일 웰에서 형광 이미징을 수행합니다.황산구리와 디티오트레이톨에 노출되면 벌레의 수명과 건강 기간이 크게 감소했습니다. 대조적으로, 황산구리는 건강에 좋은 삶을 보내는 삶의 비율을 감소시켰지만 디티오트레이톨은 그렇지 않았습니다. 황산구리는 모든 연령대에서 디티오트레이톨보다 인구 내 개인의 평균 활동을 더 많이 감소시켰습니다.수명 활동 곡선 하에서 개별 동물 영역의 개체군 평균은 황산구리 또는 디티오트레이톨에 의해 실질적으로 손상됩니다. 10일까지 개별 동물의 누적 활성도는 디티오트레이톨 투여 동물의 수명과 상관관계가 있지만, 처리되지 않은 대조군 또는 황산구리 투여 유발 동물의 수명과 상관관계가 있습니다. KYNU-1 발현의 급격한 증가는 성인기 3일에서 8일 사이에 관찰되며, 그 이후에는 나이가 들면서 점진적으로 감소합니다.성인기 14일째까지 누적된 KYNU-1 mScarlet 발현은 동물의 수명과 상관관계가 있습니다. KYNU-1 발현은 일생 동안 역동적이기 때문에 다양한 연령대의 KYNU-1 발현을 개별 동물의 전체 생존과 비교했습니다. 단일 시점에서 KYNU-1 발현은 생존과 유의미한 상관관계가 없었습니다.이 절차를 시도할 때 가장 중요한 단계는 팔미트산을 첨가하고, 한천을 피펫팅하고, 벌레를 도입하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 NGM 분석과 직접 비교할 수 있는 방식으로 개별 벌레의 형광 바이오마커뿐만 아니라 수명과 건강 기간의 종단 추적이 가능합니다.

long-term-culture-individual-caenorhabditis-elegans-on-solid-media

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

학습하세요 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 형광 모니터링 방법을. 팔미트산 장벽을 활용한 이 기술은 노화 연구와 유전자 발현 추적에 필수적인 도구입니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

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