Name: Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 학습하세요 니일틸라피아 장에서 고품질 단일세포 현탁액을 준비하는 효율적인 효소 소화 방법을 통해 수산양식 어류의 단일세포 시퀀싱 연구를 지원하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을.

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저자는 중국 하이난성 자연과학재단(NO. 320QN211)과 중국 광둥성 수생동물 질병 통제 및 건강한 문화 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(NO. PBEA2021ZD01)의 지원에 감사를 표합니다.

이 연구 동안 모든 동물 프로토콜은 하이난 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: HNUAUCC-2022-00063; 승인일: 2022-03-03). 이 실험에 사용된 장비 및 소모품 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 현재 프로토콜에 대한 요약은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생선 준비
<ol><li>신뢰할 수 있는 출처에서 평균 체중 100g의 6개월 된 나일 틸라피아를 구하십시오. 질병의 징후가없는 물고기를 선택하십시오.</li>
	<li>다음 단계로 진행하기 전에 24 시간 동안 물고기에게 먹이를주지 마십시오. 참고: 물고기 단식은 장 내용물의 양을 줄이고 장 분절의 준비를 용이하게 합니다.</li>
	<li>몸 표면의 느슨하게 결합 된 박테리아를 씻어 내기 위해 잘 통기된 멸균 된 물로 15 분 동안 생선을 헹굽니다.</li>
	<li>모든 움직임이 멈출 때까지 약 10분 동안 300mg/L 트리카인 메탄설포네이트(MS-222)로 물고기를 안락사시킵니다.</li>
</ol>2. 시약 준비
<ol><li>0.08% BSA-둘베코 인산염 완충 식염수(BSA-DPBS, 세포 헹굼 및 재현탁용)를 준비합니다. 0.08g의 BSA(0.8% w/v)를 1x DPBS 100mL에 녹입니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음 위에서 미리 식히십시오. 참고: BSA를 첨가하면 세포 응집을 최소화하는 데 도움이 됩니다. BSA 비율은 세포 응집 조건에 따라 0.04%에서 1%로 증가할 수 있습니다.</li>
	<li>효소 세포 해리 시약을 준비합니다.<ol><li>콜라게나제/디스파아제를 1x PBS로 1mg/mL(0.1U/mL 콜라게나제 및 0.8U/mL 디스파제)의 최종 농도로 희석합니다. DPBS가 아닌 PBS가 사용되는지 확인합니다. 참고: PBS는 효소가 제대로 기능하는 데 필요한 칼슘 이온을 제공합니다. DPBS는 Ca 2+/Mg2+가 없으므로 이 단계에서 사용해서는 안 됩니다. 또한 콜라게나제 유형 I은 현재 프로토콜에서 사용됩니다.</li>
		<li>멸균된 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 희석액을 여과합니다.</li>
		<li>95% 부피의 콜라게나제/디스파아제 용액과 5% 부피의 소 태아 혈청(FBS)으로 구성된 세포 해리 시약을 준비합니다. 알림: 해리 시약은 사용할 때마다 신선하게 만들어야 합니다. 5% FBS를 사용하면 소화 중에 세포 생존력을 유지하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>트리판 블루 용액을 준비합니다.<ol><li>4 °C 냉장고에서 트리판 블루 용액을 꺼내 침전을 방지하기 위해 사용하기 전에 몇 분 동안 15-20 °C에 보관하십시오.</li>
		<li>멸균된 0.22μm 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 장비 준비
<ol><li>사용하기 전에 냉장 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하십시오.</li>
	<li>멸균 RNase가 없는 1.5mL 원심분리기 튜브, 50mL 원뿔형 튜브, 광구경 유리 피펫 및 팁, 멤브레인 필터, 세포 스트레이너, 모든 저머무름 튜브 및 팁을 구합니다.</li>
	<li>집게, 가위, 메스를 포함한 유리 피펫 및 해부 도구를 오토클레이브하고 RNase 제거 용액으로 전처리하여 단일 세포 RNA-seq에 대한 RNase의 부작용을 방지합니다.</li>
</ol>4. 조직 해부 및 세포 해리
<ol><li>안락사 된 물고기를 얼음 위에 올려 놓아 해부하십시오. 무균 적으로, 장의 중간 부분의 3-4cm를 모으고 가능한 한 많은 지방과 장간막을 소비하십시오. 장 표면에 부착 된 지방과 집게로 탄력 있고 가단성 있는 맑은 점막 층을 조심스럽게 제거하십시오. 참고: 지방과 장간막은 장의 외부 표면에 부착되어 있습니다.</li>
	<li>해리 프로토콜에 대한 부작용을 방지하기 위해 가능한 한 많은 지방을 제거하십시오. 주사기를 사용하여 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS로 조각을 여러 번 부드럽게 헹구어 장 내용물과 점액을 씻어냅니다. 거친 취급을 피하십시오.</li>
	<li>장의 일부를 작은 조각으로 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 1mL로 채워진 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1mL로 교체합니다. 유리 피펫을 사용하여 부드러운 흡인으로 조직 조각을 재현탁하십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 효소 해리 시약 1mL(콜라게나제/디스파제 용액 950μL 및 FBS 50μL)를 37°C 수조에서 30-60분 동안 사용하여 조직 조각을 분해합니다.<ol><li>또한 샘플이 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 준비된 경우 해리 시약에 5μL의 RNase 억제제(원액의 경우 40U/μL)를 추가합니다. 참고: 콜라게나제/디스파아제 혼합물의 최종 농도는 1U/mL의 콜라게나제와 0.1U/mL의 디스파아제를 포함하여 0.8mg/mL입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>5-30분 수조 동안 60분 간격으로 튜브를 수동으로 뒤집습니다. 참고: 정확한 배양 시간은 사용하는 조직에 따라 다릅니다. 벌크 조직이 보이지 않을 때까지 현미경으로 해리 진행 상황을 확인하십시오. 세포 현탁액 10μL를 피펫으로 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 검사합니다. 세포가 완전히 해리되지 않으면 소화 시간을 늘리십시오.</li>
	<li>튜브를 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시키고 넓은 구멍 팁을 사용하여 효소 세포 해리 시약을 부드럽게 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1mL를 넣고 1분 동안 광구경 유리 피펫을 사용하여 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.<ol><li>이 단계를 두 번 반복합니다. 알림: 피펫팅은 세포 파괴를 방지하기 위해 광시야 및 저보유 팁을 사용하여 주의해서 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>0.08% BSA-DPBS로 40μm 셀 스트레이너를 미리 적시고 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 추가 200μL DPBS로 두드리고 헹구고 튜브 바닥에 현탁액을 수집합니다.</li>
	<li>현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 5 μL의 DNase I (1 U/μL)를 첨가하고, 15-20 °C에서 15 분 동안 배양한다. 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 제거하고 400μL의 얼음처럼 차가운 DPBS(Ca 2+/Mg2+ 유리)에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 혼합하기 위해 넓은 구멍 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.</li>
</ol>5. 염색 및 현미경 검사
<ol><li>염색을 위해 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액과 1:1 비율로 혼합합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>혼합물 5-10 μL를 혈구계에 넣고 현미경으로 검사합니다. 참고: 생존 세포는 염색되지 않은 세포질을 갖는 반면, 죽은 세포는 파란색 세포질을 갖습니다(그림 2).</li>
	<li>현미경으로 세 가지 다른 분야에서 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 계산합니다. 세포 생존율 백분율을 계산하려면 생존 가능한 세포의 수를 필드의 총 세포 수로 나눕니다. 참고: 세포 생존율은 85% 이상이어야 하며 세포 농도는 1 x 105-1 x 107/mL 이상이어야 합니다. 세포 현탁액 배경은 덩어리, 파편 또는 불순물 없이 깨끗해야 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 제조를 설명합니다. 해리하기 전에 장에서 지방과 장간막을 제거하는 것이 필요하며, 특히 지방이 많은 육식성 생선 내장의 경우 더욱 그렇습니다. 장 내용물을 씻어 내기 위해 딱딱하게 긁는 대신 주사기를 사용하면 세포의 기계적 손상을 줄일 수 있습니다. 세포 생존율을 보장하기 위해서는 조직 해부 및 헹굼 단계를 위해 온도를 20°C 이하로 유지하는 것도 필수적입니다. 세척 용액을 얼음 상에서 냉각시키고, 원심분리기 온도를 미리 4°C로 조정한다. 가장 중요한 것은 연구 조직에 대한 온화하고 효율적인 세포 해리 효소를 선택해야 한다는 것입니다. 이전 연구에 따르면 콜라게나제/디스파아제 혼합물은 나일 틸라피아 장에 최적입니다. 이 효소 조합은 트립신, 디스파스 또는 콜라게나제 단독보다 틸라피아 장에 더 온화하고 효과적입니다. 추가적으로, 5% FBS는 소화 동안 세포 생존율을 유지하기 위해 해리 시약에 포함되었다39. 정확한 배양 시...

세포는 유기체의 기본 단위입니다. 벌크 조직 연구와 비교했을 때, 단일 세포 수준 연구는 세포 이질성을 반영하고 더 높은 분해능 정보를 제공할 수 있습니다1. 최근 몇 년 동안 연구자들은 포유류, 제브라피쉬 및 기타 모델 유기체의 단일 세포 수준에서 게놈, 전사체, 후성유전체 또는 다중 오믹 연구를 위한 단일 세포 시퀀싱 기술을 적용했으며 큰 돌파구를 보고했습니다 2,3,4,5,6,7 . 대부분의 연구가 모델 유기체에 초점을 맞추었지만, 경제적인 어종에서 단일 세포 시퀀싱을 위한 참조 프로토콜이나 상업적 해리 키트가 거의 없기 때문에 양식 연구에서 단일 세포 시퀀싱의 적용이 제한됩니다. 따라서 높은 세포 생존율과 핵산 무결성을 가진 고품질 단일 세포 현탁액을 생산하는 조직 해리 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.
손상을 최소화하면서 충분한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합으로 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적입니다. 조직 해리에 가장 효과적인 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 포유류에서 콜라게나제, 디스파스, 트립신, 파파인, 엘라스타제, 히알루로니다제, 리베라제, 아쿠타제 및 트립LE 8,9를 포함한 여러 효소가 포유류 고형 조직을 위한 단일 세포 현탁액을 제조하는 데 사용되었습니다. 기계적 파괴와 결합된 트립신 소화는 일반적으로 어류의 세포 배양을 위해 조직을 해리하는 데 사용되어 왔다10,11,12,13,14. 트립신은 또한 쥐의 장(15)과 제브라피쉬 아가미 조직(16)에서 조직 해리를 위해 소화 칵테일에 사용되거나 첨가되었다. 그러나 여러 가지 이유로 트립신은 단일 세포 시퀀싱에 가장 적합한 옵션이 아닙니다. 트립신 단독은 일반적으로 조직 해리에 효과적이지 않습니다. 또한, 트립신은 DNA 가닥 파괴 17,18 및 RNA 분해19를 유도한다.
파파인은 세포 사이의 긴밀한 접합부를 구성하는 단백질을 분해합니다. 포유류의 신경 및 평활근 세포에서 파파인은 다른 프로테아제보다 더 효율적이고 덜 파괴적이다20,21. 그러나 트립신과 마찬가지로 파파인은 효소 소화 과정에서 발생하는 세포 용해로 인해 유리 DNA에 의한 세포 응집을 일으킨다9. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해하는데, 엘라스틴은 피부, 폐, 인대, 힘줄, 혈관 조직에서 전형적으로 발견된다22. 폐 조직을 해리하기 위해 콜라게나제(collagenase), 디스파스(dispase) 또는 트립신(trypsin)과 함께 자주 사용된다8. 히알루로니다아제는 히알루로난의 글리코시드 결합을 절단하여 다양한 결합 조직과 피부에서 세포외 기질의 소화에 기여합니다 9,23.
일반적으로 콜라게나제와 디스파제는 세포외 기질 분해에 좋은 옵션입니다. 그들은 인간, 마우스 및 제브라 피쉬 내장24,25,26,27의 해리에 사용되었습니다. 콜라게나제는 콜라겐에서 펩타이드 결합을 파괴하고, 세포외 기질의 소화를 촉진하며, 세포를 현탁액으로 방출하므로, 콜라게나제는 간 28,29, 비장30, 췌장31 및 장25를 포함하여 인간 및 마우스 고형 조직 해리에 자주 사용된다 . Dispaase는 비극성 아미노산 잔기의 N-말단 펩타이드 결합을 가수분해하는 프로테아제이며 콜라게나제보다 온화합니다. 그것은 세포-세포 접합에 영향을 미치지 않고 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐 및 더 적은 정도로 유형 I 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분을 절단합니다. Dispase는 장25,32, 뇌33, 간 34 등과 같은 조직 해리를 위해 별도로 또는 다른 효소와 함께 사용됩니다. 또한, 리베라제(liberase), 아쿠타제(accutase), 트립레(trypLE)를 포함한 시판되는 소화 칵테일은 특히 피부, 간, 신장에 대한 고형 조직 해리를 위한 좋은 대안이다 8,9.
나일 틸라피아 (Oreochromis niloticus)는 Perciformes 주문의 Cichlidae 계통에 속한다. 열대 및 아열대 지역에서 가장 많이 양식된 민물고기 종 중 하나로 2022년 연간 생산량이 450만 톤입니다35. 주석이 잘 달린 게놈을 가진 가장 잘 연구된 양식 어종 중 하나입니다. 나일 틸라피아는 짧은 생성 시간, 사육 용이성 및 광범위한 사육 환경에 대한 적응성으로 인해 양식 어종에 대한 이상적인 연구 모델입니다. 장은 영양 소화 및 흡수, 신진 대사 및 점막 면역의 기관이기 때문에 큰 연구 관심을 받고 있습니다. 장은 미생물 개체군의 서식지이며 필수 면역 조직입니다36. 대식세포, B 세포, 과립구 및 T 세포를 포함한 수많은 면역 세포 유형의 존재로 인해 면역학적으로 활성입니다.
현재 연구에서 우리는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 조직 특이적 효소의 특성과 예비 연구에 따르면 콜라게나제/디스파아제는 틸라피아 장 조직을 해리하는 데 적합합니다. 단세포 현탁액을 제조할 때 고려해야 할 마지막 효소 유형은 DNase-I이며, 이는 세포사멸 경로를 시작하지 않고 효소 소화 동안 죽은 세포 용해를 통해 방출된 유리 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지하고9 살아있는 세포 수율을 증가시킨다36. 또한 소 혈청 알부민(BSA)을 세척 완충액에 첨가하여 세포 응집을 줄이고 세포 생존율을 향상시킵니다. 몇몇 시약 회사는 BSA를 효소 안정제로 설명합니다. PBS(phosphate-buffered saline)에 0.04%-1% BSA를 첨가하여 부작용 없이 단일 세포 시퀀싱 현탁액을 제조하기 위한 세척 용액을 개발하는 데 사용되었습니다38. 낮은 비율의 BSA를 첨가하면 세포 생존율을 유지하고 세포 용해로 인한 세포의 유리 DNA 유도 응집을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 양식 어종의 장에서 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.22-&뮤; m 멸균 필터</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SLGV033RB</td><td>효소 용액을 여과하고 살균하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>40-&뮤; m Cell Strainer</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>F8200</td><td>Cell Strainer는 소화되지 않은 조직 조각을 제거하기 위해 적용됩니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>SRE0098</td><td>분말; 0.04 g BSA를 100 mL 1&times로 묽게 하십시오; 0.04% BSA-DPBS 세척 bffer를 준비하는 DPBS. 2 - 8 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>PBS로 최종 농도 1mg/mL로 희석합니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 / 디스 페이스</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td><td>PBS로 최종 농도 1mg / mL로 희석합니다.</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td>을 <td>PBS로 1mg/mL의 최종 농도로 희석합니다.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNase I는 세포 응집을 줄이는 데 도움이 됩니다.</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600438</td><td>PBS로 최종 농도 0.5mg/mL로 희석합니다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>혈청, digetstion 용액에 5 % 부피로 사용.</td></tr><tr><td>반전&nbsp; 현미경</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>세포 생존력을 검사하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>PBS로 최종 농도 0.25mg/mL로 희석합니다.</td></tr><tr><td>나일강틸피아(Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift 양식 기술 유한 회사</td><td>NA</td><td>질병 징후가 없는 건강한 물고기 (평균 체중: 100 g).&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Refrigerated Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>조직과 세포를 방사하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>Inhibit RNase activity</td></tr><tr><td>고체상 RNase-Be-Gone 시약</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>해부 가위 및 유리 피펫과 같은 도구에서 RNase를 제거하는 데 사용됩니다. 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>트리카인 메탄설포네이트 (MS-222)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521</td><td>물고기 안락사용.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>죽은 세포를 염색하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607001</td><td>PBS로 최종 농도 1mg/mL로 희석합니다.</td></tr></tbody></table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

나일 틸라피아는 전 세계적으로 가장 일반적으로 양식되는 민물고기 종 중 하나이며 양식 어류 연구에 널리 사용되는 연구 모델입니다. 고품질 단일 세포 현탁액의 준비는 단일 세포 RNA 또는 게놈 시퀀싱과 같은 단일 세포 수준 연구에 필수적입니다. 그러나 양식 어종, 특히 틸라피아의 장에 대해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 효과적인 해리 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 그러므로, 최소한의 손상으로 충분한 생존 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합을 선택함으로써 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적이다. 이 연구는 콜라게나제/디스파스의 효소 조합을 사용하여 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 보여줍니다. 이 조합은 소화 후 세포 응집을 감소시키기 위해 소 혈청 알부민 및 DNase를 활용하여 해리에 매우 효과적입니다. 세포 출력은 90%의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 어종의 내장으로부터 단세포 현탁액을 제조하기 위해 수정될 수 있다. 이 연구는 효율적인 참조 프로토콜을 제공하고 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액 준비에 대한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.

이 프로토콜은 단일 세포 시퀀싱을 위한 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 설명합니다(그림 1). 이 연구는 콜라게나제/디스파아제 혼합물이 좋은 해리 효과를 가지며 장 조직에 경미하다는 것을 보여줍니다. 최적의 소화 효소의 선택은 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 필수적입니다. 예비 연구에서는 일반적으로 사용되는 여러 효소의 해리 효율을 비교하고 그 결과를 표 1에 나열했습니다. 콜라게나제/디스파아제 혼합물은 콜라게나제, 디스파스 또는 트립신 단독 및 리베라제, 트립신/엘라스타제, 콜라게나제/엘라스타제, 콜라게나제/트립신을 포함한 여러 다른 효소 혼합물보다 훨씬 더 나은 해리 효과를 갖는 것으로 확인되었습니다. 또한, 콜라게나제/디스파아제는 실험이 끝날 때 가장 생존 가능한 세포를 생성했습니다.
배양 시간 동안, 해리의 진행을 현미경으로 확인하였다. 30분 후에는 벌크 조직...

여기에서 우리는 단일 세포 시퀀싱을 위한 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 보여줍니다.

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

이 프로토콜은 양식 어종에서 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 신뢰할 수 있는 참조를 제공합니다. 이 기술은 매우 효율적이며 대부분의 실험실 조건에서 구현할 수 있습니다. 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.6개월 된 나일 틸라피아 물고기를 잘 통기된 멸균수에서 15분 동안 헹구어 표면에서 느슨하게 결합된 박테리아를 씻어내는 것으로 시작합니다. 효소 세포 해리 시약을 제조하기 위해, PBS 중의 콜라게나제 디파아제를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도로 희석한다. 준비된 효소 용액의 95% 부피와 FBS의 5% 부피를 혼합합니다.그런 다음 사용하기 전에 원심 분리기를 섭씨 4도까지 미리 냉각하십시오. 조직 해부를 위해 안락사 된 물고기를 얼음 위에 놓고 내장 중간 부분의 3-4 센티미터를 수집합니다. 집게를 사용하여 지방과 장간막을 절제하십시오.장 표면에 붙어있는 지방과 탄력 있고 가단성 있는 맑은 점막을 제거합니다. 주사기를 사용하여 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS로 장 조각을 부드럽게 헹구어 장 내용물과 점액을 씻어냅니다. 여러 번 세척한 후 조각을 작은 조각으로 해부하고 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.혼합물을 섭씨 4도에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그리고 상청액을 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS로 교체합니다. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 흡인하여 조직 조각을 재현탁합니다.조각을 한 번 더 세척 한 후, 상청액을 제거하고 준비된 효소 해리 시약 1 밀리리터를 첨가한다. 또한 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 5마이크로리터의 RNA 억제제를 해리 시약과 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도의 강화 수조에 놓고 30-60분의 배양 시간 동안 5분마다 튜브를 수동으로 뒤집습니다.튜브가 회전되면 광경 팁을 사용하여 효소 세포 해리 시약을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1밀리리터를 넣고 세포 파괴를 방지하기 위해 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 세포를 한 번 더 원심 주입하고 재현탁한 후 0.08% BSA-DPBS로 미리 적신 40마이크로미터 셀 스트레이너를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 놓습니다.스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 스트레이너를 두드린 다음 200마이크로리터 DPBS로 헹구고 튜브 바닥에 서스펜션을 모으십시오. 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 5 마이크로 리터의 DNA를 첨가하고 섭씨 15도에서 20 분 동안 현탁액을 배양한다.원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DPBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 넓은 구멍 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 혼합하고 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 염색을 위해 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액에 동일한 비율로 혼합하고 실온에서 3분 동안 배양합니다.그런 다음 유리 슬라이드에 혼합물 10 마이크로 리터를 첨가하십시오. 현미경으로 생존 세포와 죽은 세포를 세 가지 필드로 계산하고 세포 생존율을 계산합니다.tage. 일반적으로 사용되는 몇 가지 효소의 해리 효율을 비교했습니다.콜라게나제 디스파아제 혼합물은 콜라게나제 디스파제 또는 트립신 단독 및 기타 여러 효소 혼합물보다 더 나은 해리 효과를 갖는 것으로 확인되었습니다. 현미경 검사 결과 장 세포는 생존력이 높고 단일 세포로 분산되어 있는 것으로 나타났습니다. 대부분의 세포는 생존 가능했지만 일부는 투과된 세포막 때문에 염색되어 죽었습니다.사용되는 PBS의 유형에주의하십시오. 효소 분해 용액은 효소가 효과적으로 기능하기 위해 칼슘/마그네슘 이온이 필요하기 때문에 칼슘/마그네슘이 없는 PBS와 함께 사용할 수 없습니다. 이 절차는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하여 양식 어종의 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

여기에서 우리는 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 시퀀싱을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 단일 핵 분석(ATAC-seq)과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 수명이 짧은 척추동물 모델 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

성인 아프리카 청록색 Killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

이 프로토콜은 인간 장 오가노이드 기술과 단일 세포 전사체 분석을 결합하여 이전에 탐구되지 않은 장 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

인간 장 오가노이드를 사용하여 단세포 전사 수준에서 소장 상피를 이해합니다.

scRNA-seq의 요구를 충족하는 마우스 뇌 피질 주리세포를 얻기 위해, CD13⁺/CD31⁻ 선택을 기반으로 한 비판적으로 최적화된 FACS 프로토콜을 제시합니다. 주요 개선점은 세포 생존력과 RNA 무결성을 크게 향상시켜 신뢰할 수 있는 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다.

FACS를 이용한 쥐 피질 조직에서 주리세포 분리 단세포 시퀀싱

학습하세요 니일틸라피아 장에서 고품질 단일세포 현탁액을 준비하는 효율적인 효소 소화 방법을 통해 수산양식 어류의 단일세포 시퀀싱 연구를 지원하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을.

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

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