Name: 원발성 월경통이 있는 쥐에서 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 사용한 원시 및 처리된 Cyperi Rhizoma 샘플 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 UPLC-MS/MS를 사용하여 원발성 월경통 쥐 모델에서 원시 및 식초 처리된 Cyperi Rhizoma 샘플의 대사체 프로파일을 비교 분석하는 방법을. 이 기법은 한약의 효능 평가에 활용됩니다.

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이 작업은 충칭시 보건 및 가족 계획위원회 한의학 과학 기술 프로젝트 (프로젝트 번호 : ZY201802297), 충칭 자연 과학 재단 일반 프로젝트 (프로젝트 번호 : cstc2019jcyj-msxmX065), 충칭 현대 산악 지역 특성 고효율 농업 기술 시스템 혁신 팀 빌딩 계획 2022 [10] 및 충칭시 보건위원회 중국 재료의 핵심 분야 건설 프로젝트의 지원을 받았습니다. 메디카 프로세싱.

모든 동물 관련 실험은 충칭 중의학연구소 실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다. 8-10주령이고 체중이 200g± 20g인 24마리의 암컷 Sprague Dawley 쥐(SD)를 이 실험에 사용했습니다.
1. 추출의 제조
<ol><li>계산<ol><li>CR 또는 CRV 추출물을 6마리의 Sprague-Dawley 쥐(10g/[kg∙day])의 처리군에 3일 동안 투여할 계획입니다. 1g/mL의 CR 또는 CRV 추출물 농도를 사용하십시오(추출물 1mL는 허브 1g에서 얻음). 참고: CR의 복용량은 6-10g입니다. 본 연구에서는 최대 용량 10g을 투약량으로 사용하였다. 성인의 평균 체중이 60kg이므로 성인 복용량은 0.1667g/kg입니다. 체중 변환 알고리즘(24)에 따르면, 인간과 래트 사이의 용량 변환 계수가 6.3이므로, 래트에 대한 용량은 1.05g/kg이다. 쥐의 경우 약물 용량을 10배 증가시켜 10.5g/kg으로 늘렸습니다. 투여량은 계산 및 실제 실험의 편의를 위해 10g/kg으로 설정하였다. 예를 들어, 계산에 의해, 총 36g의 CR 또는 CRV가 필요한 경우, 한약재는 적어도 두 번 준비되어야한다. 따라서, 200 g의 CR이 필요하였고, 100 g의 CR을 CR로 사용하였고, 100 g의 CR을 CRV로 가공하였다.</li>
		<li>방정식 (1)을 사용하여 쥐당 적용될 CR 또는 CRV의 부피를 계산합니다. V = 10g/(kg∙day) × 200g/(1g/mL) = 2mL (1)</li>
	</ol></li>
	<li>CRV 처리<ol><li>CR 100g과 식초 20g(아세트산 >5.5g/100mL)을 완전히 섞고 12시간 동안 배양합니다. 알림: 12시간 후 식초로 CR의 내부를 적시도록 CR과 식초를 혼합하고 잘 저어준 다음 내부가 촉촉해질 때까지 다시 저어줍니다.</li>
		<li>혼합물을 110-120°C에서 10분 동안 철 팬에서 볶습니다. 그런 다음 혼합물을 꺼내 실온에서 식히십시오. 알림: CR이 타는 것을 방지하려면 가열하면서 계속 저어주어야 합니다. 처리된 CRV가 너무 습한 경우 60°C에서 건조할 수 있습니다. CR의 표면이 세피아일 때, 볶음은 멈출 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>추출<ol><li>CR 추출물<ol><li>CR에 순수한 물의 10배(CR 양)를 넣고 2시간 동안 담근다. 몸을 담글 때 약재가 액체 수준보다 낮은지 확인하십시오. 알림: CR은 추출 전에 반으로 자르기만 하면 됩니다. 담그는 목적은 활성 성분을 보다 효과적으로 추출하는 것입니다. 몸을 담그는 과정은 필수적입니다.</li>
			<li>물과 약의 혼합물을 센 불에서 끓이다가 약한 불에서 20분간 끓인다. 여과포(100메쉬)로 여과하고, 여과액을 수집한다. 알림: 달일 때 끓이기 전에 고열을 사용하고 끓임을 유지하기 위해 약한 열을 사용했습니다.</li>
			<li>1.3.1.2 단계를 한 번 반복하고 여과액을 결합합니다.</li>
			<li>회전 증발기로 추출물을 1g/mL로 농축합니다(원래 약 기준, 농도 온도는 60°C 미만이어야 함). 참고: CR의 활성 성분은 휘발성이므로 농도 온도는 60°C를 넘지 않아야 합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>CRV 추출물<ol><li>CR 추출 방법과 동일한 단계(1.3.1.1-1.3.1.3)를 수행합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>테스트용 CR 추출물<ol><li>CR 추출물 500 μL와 메탄올 500 μL를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣고 30초 동안 와동하여 혼합한다. 알림: 메탄올과 물의 혼합물은 활성 성분을 더 잘 추출합니다. 테스트를 위해 추출을 직접 필터링해서는 안 됩니다.</li>
			<li>각 샘플을 4°C에서 1,6502 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 걸러낸 다음 테스트를 위해 샘플 바이알로 옮깁니다. 참고: 메탄올과 추출물 혼합물의 고속 원심분리 후 상층액을 여과 없이 측정을 위해 샘플 병으로 직접 옮길 수 있습니다. 원심분리 과정에서 발생하는 열로 인해, 극저온 원심분리기를 사용하는 것이 바람직하다.</li>
		</ol></li>
		<li>테스트용 CRV 추출물<ol><li>1.3.3.1-1.3.3.2단계를 수행하여 테스트할 CRV 추출을 준비합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 동물
<ol><li>계산<ol><li>에스트라디올 벤조에이트 50mg을 취하여 올리브 오일 50mL에 첨가하여 1mg/mL 용액을 제조합니다. 옥시토신 50mg을 취하여 생리식염수 50mL에 넣어 1mg/mL 용액을 만든다. 참고: 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신의 복강내 주사량은 10mg/(kg∙day)입니다. 에스트라디올 벤조에이트는 올리브 오일에 용해되고 옥시토신은 생리식염수에 용해됩니다. 에스트라디올 벤조에이트는 올리브 오일에 용해되기 쉽지 않으며 용해를 가속화하기 위해 초음파로 치료할 수 있습니다. 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신 용액은 모두 매일 준비해야 합니다.</li>
		<li>쥐당 적용할 에스트라디올 벤조에이트 용액의 부피를 계산합니다(즉, V = 10mg/[kg∙day] × 200g/[1g/mL] = 2mL). 쥐당 적용할 옥시토신 용액의 부피를 계산합니다(즉, V = 10mg/[kg∙day] × 200g/[1g/mL] = 2mL).</li>
	</ol></li>
	<li>동물 그룹화 및 관리 참고: 관리25,26에 10일이 할당되었습니다. 치료하는 동안 쥐는 표준 차우와 물에 무제한으로 접근할 수 있었습니다. 옥시토신 투여 후 30분 이내에 각 쥐의 몸부림치는 활동을 추적했습니다. PD 쥐 모델은 자궁 수축, 한쪽 사지 회전, 뒷다리 확장, 속이 빈 몸통 및 복부 수축을 포함하는 모델 쥐의 비틀림 반응에 의해 입증된 바와 같이 성공적으로 개발되었다26.<ol><li>24마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐(SD 쥐, 8-10주령, 체중 200g± 20g)를 무작위 대조, 모델, CR 및 CRV의 4개 그룹으로 할당하고 7일 동안 먹이십시오.</li>
		<li>동물 관리<ol><li>모델, CR 및 CRV 그룹의 쥐에게 매일 2mL의 에스트라디올 벤조에이트 용액을 복강 주사합니다. 대조군의 랫트에게 생리식염수 2mL를 복강주사한다.</li>
			<li>8일째부터 2.2.2.1단계를 완료합니다. 그런 다음 CRV 그룹의 쥐에게 CRV 추출물 2mL, CR 그룹의 쥐에게 CR 추출물 2mL, 대조군 및 모델 그룹의 쥐에게 생리 식염수 2mL를 위내 투여합니다.</li>
			<li>10일째에 2.2.2.2단계를 완료합니다. 그 후, 모델, CR 및 CRV 그룹의 랫트에게 2 mL의 옥시토신 용액을, 대조군의 래트에게 2 mL의 생리식염수를 복강 주사한다.</li>
		</ol></li>
		<li>옥시토신 주사 후 30분 이내에 쥐의 몸부림 시간을 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 채취<ol><li>복부 대동맥 혈액 샘플을 수집하고 자궁을 신속하고 완전하게 절제하고 자궁벽에 부착 된 결합 조직과 지방을 조심스럽게 분리합니다. 참고: 혈액은 최종 투여 후 1시간 이내에 거의 수집되었습니다.</li>
		<li>미세 원심 분리기 튜브를 사용하여 자궁 조직을 보존하고 액체 질소로 옮깁니다. 조직 샘플을 -80°C에서 보관한다.</li>
		<li>혈액 샘플을 4,125 × g에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 혈청 함유 상층액을 제거하고, 4°C에서 10분 동안 16,502 × g 에서 원심분리하였다. 혈청을 원심분리한 다음 -80°C의 튜브에 보관하여 보관합니다. 알림: 혈액 샘플은 재처리를 위해 실온에서 1시간 동안 방치해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 처리<ol><li>혈청 샘플<ol><li>메탄올 400μL와 혈청 200μL를 미세원심분리기 튜브에 넣고 30초 동안 소용돌이치며 혼합합니다. 각 샘플을 4°C에서 16,502 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 수집 및 여과 후 상청액으로 샘플 병을 채웁니다. 각 샘플의 모든 상층액을 동일한 부피로 혼합하여 테스트를 위한 품질 관리 샘플을 준비합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>자궁 조직 샘플<ol><li>동측 분절에서 자궁 조직 100mg을 취하여 9 배의 생리 식염수로 갈아줍니다. 균질액을 4,125 × g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집한다. 테스트를 위해 4 °C의 냉장고에 상등액을 넣거나 같은 날 테스트하지 않을 경우 -80 °C에 두십시오.</li>
			<li>생리식염수, 티슈, 강구를 2mL 미세원심분리관에 넣고 미세원심분리관을 액체질소에 3-5초 동안 넣은 후 티슈를 티슈 그라인더에 넣어 분쇄한다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>샘플 테스트<ol><li>효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 래트 샘플의 자궁 조직 내 PGF2α 및 PGE2 함량을 측정합니다. 참고: PGE2 함량을 측정하기 위해 쥐PGE2 ELISA 키트를 사용하였고, PGF 2α 수준을 측정하기 위해 쥐 PGF2α ELISA 키트를 사용하였다. 자세한 단계는 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. 키트의 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.</li>
		<li>UPLC-MS/MS를 사용하여 혈청 샘플, CR 추출물 및 CRV 추출물을 평가합니다.<ol><li>UPLC의 경우 C18 컬럼(2.6μm, 2.1mm x 100mm)과 0.1% 포름산을 함유한 이동상 A와 아세토니트릴을 함유한 이동상 B를 사용하는 이원 그래디언트 분석법을 사용합니다. 용출 구배를 다음과 같이 설정하십시오: 0분에서 1분, 15% B; 1 분 내지 8.5 분, 15 % 내지 85 % B; 8.5 분에서 11.5 분까지, 85 % B; 11.5 분에서 11.6 분까지, 99 %에서 1 % B까지; 11.6 분에서 15 분까지, 15 % B. 유속을 0.35mL/분으로, 주입량을 2μL로 설정합니다.</li>
			<li>MS의 경우 온도를 600°C로, 커튼 가스(CUR) 유량을 0.17MPa로, 외장 및 보조 가스 유량을 모두 0.38MPa로 설정합니다. 양이온 모드와 음이온 모드의 이온 스프레이 전압을 각각 5.5kV 및 -4.5kV로 설정하고, DP(Declustering Potential) 전압을 80V 또는 -80V로, 충돌 에너지(CE)를 40eV 또는 -25eV로, 충돌 에너지 중첩(CES)을 35eV ± 15eV로 설정합니다.</li>
			<li>UPLC-MS/MS를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 테스트를 수행합니다. 50-1,000 m/z의 질량 범위에서 MS를 수행합니다.</li>
			<li>검출 모드의 정보 종속 수집, 다중 질량 결함 필터 및 동적 배경 추론과 함께 일치하는 워크스테이션 프로그램을 사용하여 UPLC-MS/MS 결과를 얻을 수 있습니다. 풀링된 혈청의 품질 관리 샘플을 사용하여 UPLC-MS/MS 장비의 반복성과 안정성을 테스트하여 기존 접근 방식을 검증합니다. 연구 표본의 앞에, 4개의 연속적인 달리기를 위한 품질 관리 표본을 주사하고, 그 후에 매 5개의 혈청 표본 후에 그(것)들을 주사하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. 데이터 처리
<ol><li>데이터 준비<ol><li>변환 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 mzXML 형식으로 변환합니다. 각 샘플의 총 이온 전류(TIC) 데이터를 정규화합니다. 참고: XCMS에 구축된 내부 R 기반 애플리케이션(www.lims2.com)을 사용하여 통합, 정렬, 추출 및 피크 검출을 위한 정보를 분석했습니다(27).</li>
		<li>독점적인 MS2 데이터베이스(www.lims2.com)를 사용하여 대사산물 주석을 수행합니다. 주석 임계값을 0.328로 설정합니다. 참고: 내인성 대사산물은 각 그룹에서 확인되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>주성분 분석 및 직교 부분 최소 제곱 판별 분석<ol><li>해석 소프트웨어를 사용하여 주성분 분석(PCA) 및 모델링을 수행할 수 있습니다. 대사 산물의 표준화된 데이터를 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 그런 다음 자동 맞춤 을 사용하여 해석 모델을 작성합니다. 마지막으로 score 를 사용하여 PCA의 점수 산점도를 구합니다. 참고: 각 그룹의 클러스터링은 PCA의 점수 산점도로 얻었습니다. PCA는 주로 개입 없이 차원 축소를 통해 샘플을 그룹화하는 비지도 분석 모드입니다.</li>
		<li>분석 소프트웨어를 사용하여 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 수행할 수 있습니다.<ol><li>CR 및 CRV 그룹의 대사 산물에 대한 표준화된 데이터를 분석 소프트웨어로 가져옵니다.</li>
			<li>CR 그룹의 데이터를 생성된 CR 그룹으로 가져오고, CRV 그룹의 데이터를 생성된 CRV 그룹으로 가져옵니다. 참고: OPLS-DA는 지도 분석 모드이며 샘플을 그룹화해야 합니다.</li>
			<li>그런 다음 자동 맞춤 을 사용하여 분석 모델을 빌드하고 score 를 사용하여 OPLS-DA의 점수 산점도를 가져옵니다. 마지막으로, VIP를 사용하여 OPLS-DA의 프로젝션( VIP ) 값에서 변수 유의성을 확보하십시오. 참고: CR 및 CRV 그룹의 대사 산물의 투영(VIP) 값의 변수 유의성은 OPLS-DA를 통해 얻었습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>잠재적 차등 대사 산물의 식별<ol><li>3.2.2.3단계에서 VIP 값이 1보다 큰 대사 산물을 선별합니다.</li>
		<li>통계 소프트웨어를 사용하여 스튜던트 t-검정에 의해 3.3.1단계에서 선별된 대사산물의 P 값을 계산합니다. 참고: CR 및 CRV 그룹에서 잠재적 차등 대사산물의 유의미한 차이는 Student's t-test에 의해 결정되었습니다. 잠재적 차등 대사산물은 스튜던트 t-검정 p-값이 0.05<이고 투영에서 변수 유의성(VIP)이 1보다 큰 대사산물이었습니다. 표현은 화산 플롯을 사용하여 수행되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>차등 대사산물의 동정<ol><li>3.3단계에서 잠재적인 차등 대사산물을 선별합니다. 3.1.2단계의 결과를 사용하여 이러한 차등 대사산물을 식별합니다. 참고: 소수의 잠재적 차등 대사산물이 확인되었고, 이들은 후보 차등 대사산물이 되었습니다.</li>
		<li>KEGG 데이터베이스에서 일치시킬 차등 대사 산물을 선별합니다. 히트맵을 그려 CR 및 CRV 그룹의 차등 대사 산물의 변화를 보여줍니다. 참고: 소수의 후보 차등 대사산물이 일치하여 차등 대사산물이 되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>잠재적인 대사 경로 검사<ol><li>다양한 대사 산물을 Metaboanalyst(www.metaboanalyst.ca) 데이터베이스에 업로드합니다.</li>
		<li>경로 분석을 사용하여 잠재적인 대사 경로를 얻습니다. 참고: 잠재적인 대사 경로는 CR 및 CRV 그룹에서 얻었습니다. P 값과 영향 값은 중요한 경로를 선택하는 데 있어 두 가지 매우 중요한 지표였습니다. P 값이 영향 값보다 더 중요했습니다. 유의성은 0.05< P 값으로 정의되었습니다. 더 큰 영향 값은 더 나은 상관 관계와 관련이 있습니다.</li>
		<li>다양한 대사 산물을 KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) 데이터베이스에 업로드하여 잠재적인 대사 경로를 분석합니다. 참고: 대사 경로의 기능과 PD 사이의 관계도 고려해야 합니다. 중요한 대사 경로가 얻어졌습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈액에 흡수 된 성분의 식별<ol><li>사내 MS2 데이터베이스(www.lims2.com), 인간 대사체 데이터베이스(HMDB), Massbank 및 Chemspider 데이터베이스를 사용하여 CR 및 CRV 추출물의 화학 성분을 식별합니다.</li>
		<li>CR 및 CRV 그룹에서 혈액으로 흡수된 성분을 결정하고 CR과 CRV 그룹 간의 구성 요소를 비교합니다. 참고: 혈액에 흡수된 성분은 CR 또는 CRV 그룹에서 검출되어야 하지만 대조군에서는 검출될 수 없습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>통계 분석<ol><li>일변량 분석(UVA)과 분산 분석(ANOVA) 및 스튜던트 t-검정을 포함한 다변량 통계 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다. 참고: 실험 정보는 통계 소프트웨어를 사용하여 평균 ± 표준 편차(±SD)로 표시되었습니다. P < 0.01은 매우 유의한 차이로 간주되었고, P < 0.05는 유의한 차이28을 나타냈다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

TCM의 다양하고 다양한 특성으로 인해 이러한 허브는 때때로 임상 실습에서 효과가 없으며 이는 TCM의 부적절한 가공 및 달임 때문일 수 있습니다. TCM의 메커니즘은 현대 과학 기술29,30의 사용으로 더욱 분명 해지고 있습니다. 이 연구는 CR과 CRV 모두 PD 모델 쥐에서 치료 효과가 있고 CRV의 치료 효과가 더 중요하다는 것을 보여줍니다. CRV의 작용 메커니즘은 식초 가공이 혈액에 흡수되는 CR 성분에 영향을 미칠 수 있고 리놀레산 대사 및 불포화 지방산의 생합성과 관련될 수 있다는 사실과 관련될 수 있습니다. 그림 10은 통증 완화에서 CRV 작용의 잠재적 경로를 보여줍니다.
<img alt="Figure 10" class="xfig...

원발성 월경통(PD)은 임상 산부인과에서 가장 흔한 상태입니다. 생식 기관의 골반 병리 없이 월경 전이나 월경 중 요통, 부기, 복통 또는 불편함이 특징입니다1. 유병률에 대한 보고서에 따르면 학생의 85.7%가 PD2를 앓고 있습니다. 저용량 경구 피임약이 표준 치료법이지만 심부 정맥 혈전증과 같은 부작용이 점점 더 주목을 받고 있다3. 경구 피임약 사용자 중 심부 정맥 혈전증의 유병률은 여성 1,000명당 >1명이며, 위험은 처음 6-12개월과 40세 이상 사용자 사이에서 가장 높다4.
중국 전통 의학(TCM)에서 오랫동안 사용된 Cyperi rhizoma(CR)는 Cyperaceae 계통의 Cyperus rotundus L.의 말린 뿌리줄기에서 파생됩니다. CR은 월경 장애를 조절하고 우울증과 통증을 완화합니다5. CR은 산부인과에서 널리 사용되며 여성의 질병을 치료하는 일반 의학으로 간주됩니다6. 식초로 처리된 CR(CRV)은 일반적으로 임상적으로 사용됩니다. CR과 비교하여 CRV는 월경 및 통증 완화에 대한 강화된 조절을 보여줍니다. 현대 연구에 따르면 CR은 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 프로스타글란딘 (PG)의 후속 합성을 억제하여 항 염증 효과를 얻습니다. 한편, CR은 부작용 없이 진통 효과를 나타내므로7 CR은 월경통 환자에게 좋은 선택이 된다. 그러나 CRV에 의한 월경 조절 및 통증 완화 제공의 기본 메커니즘은 불분명합니다. CR 연구는 주로 항염증제, 항우울제 및 진통 효과와 같은 활성 화학 성분 및 약리학적 활성의 변화에 중점을 두었습니다 8,9,10,11,12.
TCM의 성분은 복잡하지만 혈액에 흡수되어 특정 혈중 농도에 도달해야 효과가 있다13. TCM의 활성 성분을 스크리닝하는 범위는 혈액 내 성분 결정 전략을 활용하여 좁힐 수 있습니다. 시험관 내에서 화학 성분을 연구할 때 실명을 피할 수 있고, 개별 성분14을 연구할 때 일방성을 피할 수 있다. 혈액 내 CR과 CRV의 조성을 비교함으로써 처리된 CR의 활성 성분 변화를 효과적이고 빠르게 감지할 수 있습니다. 약물 효능은 약물이 신체에 영향을 미치는 과정입니다. 약물의 작용 메커니즘과 관련이있을 수있는 신체의 대사 반응으로 인한 약물 성분의 변화는 대사 학으로 결정할 수 있습니다. 대사노학(Metabonomics)은 중국 전통 의학의 전반적인 효능을 결정하는 것과 일치하는 전체적이고 역동적인 대사 반응을 측정하는 것을 목표로 한다15. 또한, 대사산물은 유전자 발현의 최종 산물이며, 이는 표현형과 가장 밀접한 관련이 있다16. 따라서, 대사노학은 PD의 치료에서 CR과 CRV 사이의 대사 경로의 차이를 탐색하는 데 적합할 수 있다. 액체 크로마토그래피-고분해능 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 비표적 대사체학은 높은 처리량, 높은 감도 및 고분해능을 특징으로 하며 다양한 소분자 성분을 측정하는 데 사용할 수 있다17,18 . 이 방법은 혈액에 흡수 된 내인성 대사 산물과 외인성 성분을 동시에 결정할 수 있습니다. 대사노학은 TCM19, 약물 독성학 20, 건강 관리 21, 스포츠22, 식품 23 및 기타 분야에 대한 연구에서 널리 사용되었습니다.
본 연구에서는 CRV의 진통 효과 기전을 밝히기 위해 LC-MS/MS 기반 비표적 대사체학을 사용하여 CR 처리된 월경통 모델 쥐와 CRV 처리된 월경통 모델 쥐 사이에서 혈액에 흡수된 외인성 성분과 내인성 대사산물의 차이를 측정했습니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그</td><td>197164</td><td></td></tr><tr><td>BECKMAN COULTER Microfuge 20</td><td>Beckman&nbsp; 쿨터, Inc.</td><td></td><td></td>MRZ15K047</tr><tr><td>에스트라디올 벤조에이</td>트 <td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>C10042616</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td><td>177799</td><td></td></tr><tr><td>LC 30A system</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td><td>228-45162-46</td><td></td></tr><tr><td>올리브 오일</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd</td><td>H25A11P111909</td><td></td></tr><tr><td>옥시토신 합성</td><td>Zhejiang 펩타이드 생물학 Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>2019092001</tr><tr><td>쥐 PGF2&alpha; ELISA 키트</td><td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td><td>202101</td><td></td></tr><tr><td>Rat PGFE2 ELISA kit</td><td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td><td>EDL202006217</td><td></td></tr><tr><td>SPF Sprague-Dawley rats</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td><td>인증 번호 SCXK (Hunan) 2019-0004</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Austria</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>Triple TOF 4600 system</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td><td>BK20641402</td><td></td></tr><tr><td>water</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td><td>152720</td><td></td></tr></tbody></table>

원발성 월경통이 있는 쥐에서 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 사용한 원시 및 처리된 cyperi rhizoma 샘플 분석

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR)는 산부인과에서 널리 사용되며 중국의 여성 질병 치료를위한 일반 의약품입니다. 식초로 처리한 후 CR의 진통 효과가 향상되기 때문에 식초로 처리한 CR(CRV)은 일반적으로 임상적으로 사용됩니다. 그러나, 식초 가공에 의해 진통 효과가 향상되는 메커니즘은 불분명하다. 이 연구에서는 초고압 액체 크로마토그래피탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS) 기술을 사용하여 월경통이 있는 CR 처리 쥐와 CRV 처리 쥐 사이의 외인성 성분 및 대사 산물의 혈중 농도 변화를 조사했습니다. 그 결과 이 쥐의 혈액에서 15가지 성분과 2가지 대사 산물의 수준이 다른 것으로 나타났습니다. 그 중에서도 CRV 그룹의 (-)-myrtenol 및 [(1R, 2S, 3R, 4R) -3- 하이드 록시 -1,4,7,7- 테트라 메틸 사이클로 [2.2.1] 헵트 -2- 일] 아세트산의 수준은 CR 그룹보다 상당히 높았다. CRV는 전염증, 혈소판 응집 및 혈관 수축 활성이 있는 2 시리즈 프로스타노이드 및 4 시리즈 류코트리엔의 수준을 감소시키고 아라키돈산 및 리놀레산 대사와 불포화 지방산의 생합성을 조절하여 진통 효과를 제공했습니다. 이 연구는 식초 가공이 CR의 진통 효과를 향상시키고 CRV의 작용 메커니즘에 대한 우리의 이해에 기여한다는 것을 보여주었습니다.

월경통 모델 실험 분석 대조군에서는 30분 이내에 몸부림치는 반응이 없었는데, 이는 이 쥐들에게 통증을 유발하기 위해 옥시토신과 에스트라디올 벤조에이트를 복강 주사하지 않았기 때문입니다. 모델, CR 및 CRV 그룹의 쥐는 옥시토신 주사 후 상당한 몸부림 반응을 보였다. 이러한 결과는 월경통을 유발하는 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신 조합의 효능을 입증합니다. 모델과 대조군 간의 PGF 2α, PGE 2 및 PGF2α/PGE2 수준의 차이는 유의했으며(P &lt; 0.001, P &lt; 0.05), 모델의 효능을 입증했습니다(그림 1).
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여기에서는 원발성 월경통이 있는 쥐에서 초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS)을 사용하여 원시 및 가공된 Cyperi rhizoma(CR) 샘플의 비교 분석을 제시합니다. 대사 산물 및 샘플 성분의 혈중 농도 변화는 CR로 처리 된 쥐와 식초로 처리 된 CR (CRV) 사이에서 조사되었습니다.

원발성 월경통이 있는 쥐에서 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 사용한 원시 및 처리된 Cyperi Rhizoma 샘플 분석

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

대사학은 전반적이고 역동적인 대사 반응을 측정하며 중국 전통 의학의 전반적인 효능을 결정하는 것과 일치합니다. 신체의 대사 반응으로 인한 약물 성분의 변화는 대사학을 통해 결정될 수 있습니다. TCM의 활성 성분을 스크리닝하는 범위는 이 기술을 활용하여 좁힐 수 있습니다.일방성은 개별 구성 요소를 연구함으로써 피할 수 있습니다. 이 방법은 동시에 혈액 내로 흡수되는 내인성 대사 산물과 외인성 성분을 결정할 수 있습니다. 대사노학은 TCM, 약물 독성학, 건강 관리, 스포츠, 식품 및 기타 분야에 대한 연구에 널리 사용되었습니다.시작하려면 3일 동안 6마리의 Sprague Dawley 쥐 그룹을 치료하기 위해 식초로 처리한 Cyperi rhizoma(CR) 또는 Cyperi rhizoma(CR)의 추출물을 결정합니다. 이 방정식을 사용하여 쥐당 적용할 CR 또는 CRV의 부피를 계산합니다. CRV를 처리하려면 100 밀리리터 당 5.5 그램 이상의 아세트산을 함유 한 100 그램의 CR과 20 그램의 식초를 완전히 혼합하고 12 시간 동안 배양하십시오.배양 후, 혼합물을 철 팬에서 섭씨 110 내지 120도에서 10 분 동안 볶는다. 그런 다음 혼합물을 제거하고 실온에서 식히십시오. CR 추출물을 준비하려면 CR을 취한 CR 양의 10배인 순수한 물로 2시간 동안 담가 약재가 액체 수준보다 낮은지 확인합니다.다음으로 물과 약의 혼합물을 고열로 끓여서 약한 불에서 20 분 동안 끓입니다. 그런 다음 100메쉬 여과포로 내용물을 걸러내고 여과액을 수집합니다. 이어서, 수집된 여과액을 회전 증발기로 추출물에 넣고 밀리리터당 1그램이 되도록 농축한다.CRV 추출물을 제조하기 위해, CR 추출에 대해 입증된 바와 같이 침지, 끓임 및 농축하는 단계를 수행한다. CR 및 CRV 추출물을 시험하기 위해, 500 마이크로리터의 추출물을 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 500 마이크로리터의 메탄올로 피펫팅하고, 혼합하기 위해 30초 동안 와동시킨다. 섭씨 4도에서 16, 500g에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 테스트를 위해 샘플 바이알로 옮깁니다. 샘플을 테스트한 후 주성분 분석(PCA)을 수행하고 해석 소프트웨어를 사용하여 모델링을 수행합니다. 대사 산물의 표준화된 데이터를 소프트웨어로 가져온 다음 Autofit을 사용하여 분석 모델을 구축합니다.마지막으로 점수를 사용하여 PCA의 점수 산점도를 구합니다. 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 수행하려면 대사 산물과 CR 및 CRV 그룹에 대한 표준화된 데이터를 소프트웨어로 가져옵니다. 그런 다음 CR 및 CRV 데이터를 생성된 해당 그룹으로 가져옵니다.그런 다음 자동 맞춤을 사용하여 분석 모델을 빌드하고 점수를 사용하여 OPLS-DA의 점수 산점도를 확보하십시오. 마지막으로, VIP를 사용하여 OPLS-DA의 프로젝션 또는 VIP 값에서 변수 유의성을 확보하십시오. 잠재적으로 차등적인 대사 산물을 식별하려면 VIP 값이 1보다 큰 대사 산물을 선별합니다.그런 다음 통계 소프트웨어를 사용하여 학생의 T-검정으로 선별된 대사산물의 P-값을 계산합니다. 다음으로, 차등 대사 산물을 식별하기 위해 주석이 달린 대사 산물을 사용하고 KEGG 데이터베이스에서 일치시킬 차등 대사 산물을 선별합니다. 히트 맵을 그려 CR 및 CRV 그룹의 차등 대사 산물의 변화를 보여줍니다.잠재적인 대사 경로를 검사하려면 MetaboAnalyst 데이터베이스로 이동하십시오. 경로 분석을 사용하여 다양한 대사 산물을 업로드하여 잠재적인 대사 경로를 얻습니다. 다양한 대사산물을 KEGG 데이터베이스에 업로드하여 잠재적인 대사 경로를 분석합니다.분석된 월경통 모델 실험은 프로스타글란딘 수치에 상당한 차이를 보였다. 모델 CR 및 CRV 그룹의 쥐는 옥시토신 주사 후 상당한 몸부림 반응을 보였다. PCA 분석 결과는 모델 그룹과 비교하여 CR 및 CRV의 클러스터가 양이온 및 음이온 모드 모두에서 유의하게 분리되었음을 입증했습니다.OPLS-DA는 대사 차이를 스크리닝하는 데 사용되었으며 산점도 결과는 CR과 CRV 그룹이 분리되었음을 보여주었습니다. 대사 변이를 확인하기 위해 단변량 통계 분석이 수행되었습니다. 화산 플롯이 표시되며, 각 점은 다른 대사 산물에 해당합니다.양성 모드에서 63 개의 대사 산물에서 유의 한 변화가 관찰되었고 음성 모드에서 30 개의 대사 산물에서 유의 한 변화가 관찰되었다. KEGG 및 HDMB 데이터베이스를 사용하여 차등 대사 산물을 결정하고 정확하게 일치하는 화합물을 나열했습니다. CR과 CRV 그룹 사이의 차등 대사 산물의 정량적 값을 계산하고 클러스터링했습니다.색상 패치는 각 대사 산물이 다른 대사 산물에 비해 어떻게 표현되는지를 나타냅니다. CR 그룹과 비교하여 CRV 그룹의 4개 차동 대사 산물 수준은 증가한 반면 양이온 모드에서는 11개의 대사 산물이 감소했습니다. 음이온 모드의 경우 4개의 차등 대사산물이 증가하고 7개의 대사산물이 감소했습니다.KEGG 경로 분석 결과, 차등 대사산물은 양성 및 음성 모드에서 9가지 경로와 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 차등 대사 산물이 많을수록 결과가 더 좋아지므로 충분한 대사 경로를 연결할 수 있고 선별된 주요 대사 경로가 더 정확해집니다.

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