Name: 열충격 단백질 90 억제제 발견을 위한 말라카이트 그린 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 말라카이트 그린 분석법을 이용하여 Hsp90 ATPase 활성을 측정하고 무기 인산을 검출하는 방법을. 이 고속 스크리닝 기술은 암 치료 표적 단백질의 저해제 발견에 필수적인 도구입니다.

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본 연구는 한국연구재단(NRF)의 박사후 연구원인 한국연구연구원(KRF) 프로그램의 지원을 받아 과학기술정보통신부(NRF-2019H1D3A1A01102952)의 지원을 받았다. 저자들은 이 프로젝트에 재정 지원을 해준 KIST 교내 보조금과 해양수산부 보조금 번호 2MRB130에 감사드립니다.

1. 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석
<ol><li>분석 완충액의 제조<ol><li>표 1에 제시된 조성 및 제제에 따라 분석 완충액을 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>인산염 표준물질의 제조<ol><li>말라카이트 그린 분석 포스페이트 분석 키트(4°C에서 보관)에 제공된 1 mM 포스페이트 표준물을 사용한다.</li>
		<li>960 μL의 초순수에 40 μL의 1 mM 인산염 표준물질을 피펫으로 피펫하여 40 μM 인산염 용액(premix solution)을 얻었다. 제조업체의 지침에 따라 초순수로 프리믹스 용액을 첨가하여 0에서 40 μM까지 인산염의 연속 희석액을 형성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>효모 Hsp90의 제조<ol><li>글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 효모 Hsp90을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.</li>
		<li>측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 블랭크와 양성 대조군 사이의 말라카이트 그린 시약 첨가 후 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1.0 미만인지 확인하십시오. 여기서, 블랭크(Hsp90 없음)와 양성대조군(Hsp90 포함)의 흡광도 차이는 0.510으로 나타났다.</li>
	</ol></li>
	<li>ATP의 제조<ol><li>ATP 1mg을 초순수 453.39μL가 들어 있는 바이알에 옮겨 4mM의 원액을 얻습니다. 무수 ATP(분자량[m.w.] = 551.14)를 기준으로 중량 계산을 수행합니다. ATP는 시간이 지남에 따라 자발적으로 가수분해될 수 있으므로 신선하게 준비하십시오.</li>
		<li>4 μL의 ATP 저장 용액을 각 웰에 첨가하여 0.2 mM의 최종 웰 농도 (최종 총 분석 웰 부피 80 μL)를 수득하였다. 모든 반응이 동시에 시작되도록 멀티채널 피펫을 사용하여 ATP를 반응의 마지막 성분으로 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>겔다나마이신(GA)의 제조<ol><li>1 mg을 178.37 μL의 DMSO (m.w. = 560.64)에 용해시켜 GA의 10 mM 스톡을 준비한다. 원액을 사용하여 연속 희석하여 DMSO 중 4mM, 0.8mM, 0.16mM, 0.032mM, 0.0064mM 및 0.00128mM 용액을 준비합니다.</li>
		<li>이들 저장 용액 2μL를 각 웰에 첨가하여 각각 0.1mM, 0.02mM, 0.004mM, 0.0008mM, 0.00016mM 및 0.000032mM의 최종 웰 농도를 얻습니다.</li>
		<li>표 2 및 표 3에 기재된 바와 같이 웰을 준비하고, 웰은 블랭크 (완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 (완충액 + 물 + DMSO 중 Hsp90)을 함유한다. GA(완충액 중 Hsp90 + 물 + GA)를 함유한 웰은 양성 대조군 역할을 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>웰 플레이트 준비 및 첨가 순서<ol><li>표 2에 제시된 레이아웃으로 96웰 플레이트를 준비합니다. 620nm에서 흡광도를 나타내는 화합물의 경우 이 파장에서 흡광도를 기록하기 위한 별도의 웰을 준비합니다. GA는 분석에 사용된 농도에 대해 620nm에서 흡광도를 나타내지 않으므로 GA에 대해 별도의 웰을 준비하지 마십시오.</li>
		<li>표 3에 제시된 바와 같이 각 성분의 총 부피로 각 성분을 준비하십시오.</li>
		<li>각 웰에 초순수를 추가하여 분석 웰을 설정합니다. 그런 다음 필요한 양의 분석 완충액과 복합 용액(예: GA 용액)을 추가합니다.</li>
		<li>그런 다음 Hsp90을 적절한 웰에 넣고 실온에서 플레이트 셰이커에서 플레이트를 2분 동안 흔듭니다.</li>
		<li>다중 채널 피펫을 사용하여 4 μL의 ATP 용액을 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 플레이트 셰이커(200rpm)에서 2분 동안 흔듭니다. 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>말라카이트 그린 시약의 준비 및 첨가<ol><li>말라카이트 그린 시약은 시약 A(3M HCl 중 몰리브덴산암모늄)와 B(말라카이트 그린 및 폴리비닐 알코올)로 구성됩니다. 사용하기 전에 시약을 실온에 두십시오. 시약 A와 B를 100:1 비율(1,000 μL:10 μL)로 혼합합니다. 불안정하고 3시간 후에 분해되기 시작하므로 사용하기 전에 3시간 이내에 준비하십시오.</li>
		<li>1.6.5 단계의 3 시간 후, 다중 채널 피펫을 사용하여 ATP와 동일한 순서로 첨가 된 말라카이트 그린 시약 20 μL를 첨가하여 반응을 중지합니다.</li>
		<li>상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더에서 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 말라카이트 그린 분석법에 의한 Hsp90 억제제의 고처리량 스크리닝
참고: 고처리량 스크리닝을 위한 프로토콜은 실험실 규모의 방법론과 유사합니다. 각 경우의 최종 웰 부피는 80μL입니다. 그러나, 시약의 첨가 순서에는 약간의 차이가 있다. 실험실 규모 기반 방법에는 5 단계의 용액 첨가 (물 34 μL, 완충액 32 μL, DMSO 중 화합물 2 μL, Hsp90 8 μL, 마지막으로 ATP 용액 4 μL)가 있습니다. 대조적으로, HTS의 경우 3 단계의 첨가가 있습니다 (효모 Hsp90을 함유 한 완충 용액 40 μL, 화합물을 함유 한 물 18 μL에 DMSO 2 μL, 마지막으로 물에 용해 된 ATP 20 μL). HTS 설정에서 정확하게 피펫팅할 수 있는 용액의 최소량은 20 μL입니다. 따라서 실험실 스케일과 HTS 스케일 간의 피펫팅 차이가 관찰됩니다.
<ol><li>분석 완충액(pH 7.4)의 제조<ol><li>HTS에서 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석과 동일한 완충액을 사용합니다(표 1).</li>
	</ol></li>
	<li>효모 Hsp90의 제조<ol><li>글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 단백질을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.</li>
		<li>각 웰에 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하면 측정 가능한 ATPase 활성을 얻을 수 있습니다.</li>
		<li>단백질(8 μL)을 각 웰의 완충액(32 μL)에 희석한다. 각 웰의 최종 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 40 μL입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>0.8 mM ATP의 제조<ol><li>ATP 1mg을 증류수 2,267μL에 용해시켜 0.8mM 용액을 얻습니다. 각 웰의 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 20 μL입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>겔다나마이신(GA)/시험 화합물의 제조<ol><li>단계 1.5에서와 같이 DMSO에서 0.8 mM GA 스톡을 준비한다. GA 스톡 10μL를 물 90μL로 희석하여 최종 농도 80μM을 제공합니다.</li>
		<li>적절한 분석 웰(최종 총 분석 웰 부피 = 80μL)에 80μM의 GA 용액 20μL를 사용하여 최종 웰 농도 20μM을 제공합니다. 이것은 양성 대조군 역할을 합니다.</li>
		<li>테스트 화합물의 경우 평가를 위해 원하는 농도에 따라 DMSO에서 용액을 준비합니다.</li>
		<li>블랭크(완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 웰(완충액 + 물 + DMSO의 Hsp90)에 추가하기 위해 물 90μL에 10μL의 DMSO를 준비합니다. 100 μM 최종 웰 농도에서 유사한 방식으로 시험 화합물을 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 플레이트 설계 및 첨가 순서<ol><li>4개의 메인 플레이트, 1개의 복합 플레이트 및 시약 스톡이 포함된 4개의 첨가 플레이트를 사용하여 분석을 설정합니다(그림 2 및 표 4).</li>
		<li>또한, 플레이트 A, 90 μL의 분석 완충액을 각 웰에 첨가하고; 플레이트 B에 추가하여, 각 웰에 Hsp90을 갖는 90 μL의 완충액을 첨가하고; 플레이트 C 및 D에 추가하여, 각각 90 μL의 ATP 및 90 μL의 말라카이트 그린 시약을 각 웰에 첨가한다 (표 5 및 표 6).</li>
		<li>첨가 플레이트 A와 플레이트 B에서 자동 멀티채널 분주 시스템을 사용하여 각 웰에서 각각 메인 플레이트 1과 2, 3과 4로 40μL의 용액을 옮깁니다. 여기서는 Biomek(R) FXP 실험실 자동화 워크스테이션을 사용했습니다(그림 2 및 표 6).</li>
		<li>복합 플레이트의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.</li>
		<li>첨가 플레이트 C(ATP)의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>1.7단계에 따라 말라카이트 그린 시약을 준비합니다. 3시간 후, 말라카이트 그린 시약 20μL을 첨가 플레이트 D에서 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4의 웰로 옮깁니다(그림 2).</li>
		<li>상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더로 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.

Hsp90은 새로운 항암제 분자 발견의 중요한 표적입니다. 1994 년에 약물 성이 확립 된 이래10, 18 개의 분자가 임상 시험에 도달했습니다. 현재 7 개의 분자가 단독으로 또는22 개의 조합으로 다양한 임상 시험 단계에 있습니다. 이러한 모든 소분자는 N-말단 ATP 결합 억제제입니다. 샤페론을 억제하는 다른 수단(C-말단 억제제, 중간 도메인 억제제)은 N-말단 억제제만큼 빠르게 진행되지 않았습니다. 따라서 N-말단 ATP 결합 억제제 화합물은 여전히 임상적으로 시장성이 있는 분자로의 진행을 약속합니다. 또한 2022년 6월에 승인된 유일한 Hsp90 억제제(일본 GIST 치료용 Pimitespib)는 N-말단 ATP 결합 분자9입니다. 그러나 현재까지 단일 분자는 세계의 다른 지역에서 시장성있는 단계에 도달하지 못했습니다23,24...

열충격 단백질 90(Hsp90)은 암의 발병 및 진행을 담당하는 단백질의 안정성을 유지하는 분자 샤페론입니다. 또한, 항종양제에 대한 내성 발달을 담당하는 단백질도 Hsp90의 고객이다1. Hsp90은 전체 단백질의 2% 미만을 구성할 수 있는 정상 세포와 비교하여 모든 암세포 유형(세포 단백질의 >90%)에서 유비쿼터스로 과발현됩니다. 더욱이, 암세포의 Hsp90은 공동 샤페론과 복합체에 존재하는 반면, 정상 세포에서는 주로 자유롭고 복합체가 없는 상태로 존재합니다 2,3. 최근 몇 년 동안, 몇몇 Hsp90 억제제는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 세놀리틱 효과를 갖는 것으로 입증되었으며, 여기서 마우스의 수명을 크게 향상시켰습니다 4,5,6. 앞서 언급한 모든 발견은 Hsp90 억제제가 부작용이 적고 내성 발생 가능성이 감소하면서 여러 암 유형에 효과적일 수 있다는 사실을 입증합니다. Hsp90의 샤페로닝 기능은 Hsp90의 N-말단 도메인에서 ATP를 결합하고 이를 ADP와 유리 인산염7로 가수분해함으로써 달성됩니다. Hsp90의 ATP 결합 포켓에 경쟁적으로 결합하는 작은 분자는 단백질의 샤페로닝 효과를 성공적으로 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 현재까지, 이것은 Hsp90 억제를 위한 최선의 전략으로 남아 있으며, 이는 이러한 억제제가 임상 시험에 도달했다는 사실에 의해 뒷받침된다8. 그 중 하나인 Pimitespib은 2022년 6월 일본에서 위장관 기질 종양(GIST) 치료제로 승인되었습니다9. 이는 샤페론의 약물성이 1994년에 확립된 이후 승인된 최초의 Hsp90 억제제이다10.
말라카이트 그린 분석법은 무기 인산염의 검출을 위한 간단하고, 민감하며, 빠르고, 저렴한 절차로, 원하는 표적에 대한 화합물의 자동화 및 고처리량 스크리닝(HTS)에 적합하다11. 이 분석은 HTS 12,13,14,15,16,17뿐만 아니라 소규모 실험실 규모 설정에서 Hsp90 억제제의 스크리닝에 성공적으로 사용되었습니다. 이 분석은 Hsp90의 ATPase 활성으로 인해 형성된 유리 무기 인산염을 결정하는 비색법을 사용합니다. 이 정량화의 기초는 유리 인산염과 몰리브덴 사이에 인산염 분해 화합물이 형성되는 것이며, 이는 이후 말라카이트 그린과 반응하여 녹색을 생성합니다(그림 1). 이 빠른 색 형성은 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 600-660 nm18,19 사이에서 측정됩니다.
본 프로토콜에서, 효모 Hsp90을 이용한 말라카이트 그린 분석을 수행하는 절차 및 샤페론에 대한 억제제의 후속 확인이 기재되어 있다. Hsp90의 약물성이 처음으로 확립된 천연물 분자인 겔다나마이신(geldanamycin, GA)은 진정한 억제제로 간주되었다10. HTS는 테스트를 위해 많은 수의 분자를 사용할 수 있기 때문에 현재 약물 발견 프로그램의 필수적인 부분이 되었습니다. 이 기술은 Covid-19 감염 치료를 위한 약물의 용도 변경이 시급하기 때문에 지난 2년 동안 더 중요해졌습니다20,21. 따라서, 말라카이트 그린 분석법을 채택하여 효모 Hsp90 단백질에 대한 분자의 HTS에 대한 상세한 개요가 제시된다.

<table><tbody><tr><td>물 속의 1M 염화 마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>물 중 1M 염화 칼륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>SPL Life Sciences</td><td>해당</td><td></td>없음</tr><tr><td>아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX 연구소 자동화 워크스테이션</td><td>Beckman Coulter</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>화합물 3-96</td><td>해당 없음</td> 해당 <td>없음</td><td>히스티딘 태그 효모 Hsp90은 영국 서식스 대학교 생명과학부 Chrisostomos Prodromou 박사로부터 얻었고, 단백질은 KIST 강릉 천연물연구소에서 발현하였다. 특허 침해 문제로 인해 자세한 내용을 공개할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>겔다나마이신, 99%(HPLC), 분말</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>말라카이트 그린 인산염 분석&nbsp; 분석 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>다중 검출 마이크로플레이트 리더 Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>해당 사항</td><td></td>없음</tr><tr><td>Synergy HT 다중 플레이트 리더</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Hsp90</td><td>Not</td><td>applicable</td> 해당되지 않음 <td>영국 University of Sussex의 생명과학대학 및 단백질은 KIST 강릉 천연물연구소에서 발현되었다. 기본 식별 번호: P02829</td></tr></tbody></table>

열충격 단백질 90 억제제 발견을 위한 말라카이트 그린 분석

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

열충격 단백질 90(Hsp90)은 여러 발암성 단백질에 대한 샤페로닝 효과로 인해 유망한 항암 표적입니다. Hsp90의 활성은 아데노신 삼인산(ATP)을 아데노신 이인산(ADP) 및 유리 인산염으로 가수분해하는 능력에 따라 다릅니다. Hsp90의 ATPase 활성은 보호자 기능과 관련이 있습니다. ATP는 Hsp90의 N-말단 도메인에 결합하고, 그 결합을 방해하는 것이 Hsp90 기능을 억제하는 가장 성공적인 전략인 것으로 밝혀졌습니다. ATPase 활성은 ATP 가수 분해에 의해 형성된 유리 인산염의 양을 결정하는 비색 말라카이트 그린 분석에 의해 측정 될 수있다. 여기서, 말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트를 사용하여 효모 Hsp90의 ATPase 활성을 결정하는 절차가 설명된다. 또한, 겔다나마이신을 진정한 억제제로 복용하여 Hsp90 억제제를 발견하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 효모 Hsp90에 대한 억제제 분자의 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 이 분석 프로토콜의 적용에 대해 논의합니다.

분석의 결과는 유리 인산 이온 농도에 의한 흡광도 측면에서 해석됩니다. 620 nm에서 효모 Hsp90에 의한 ATP 가수 분해로 인한 유리 인산염에 의한 흡광도는 100 % ATPase 활성 또는 0 % 단백질 억제로 간주됩니다. 단백질의 억제는 ATP 가수 분해 (유리 인산염 감소)의 중단으로 이어진다. 이는 620nm에서 감소된 흡광도 측면에서 반영됩니다.
실험실 규모의 말라카이트 그린 분석 결과 인산염 표준물질에 대한 표준물질 그래프는 도 3에 묘사되어 있다. Hsp90의 활성은 ATP를 ADP 및 무기 인산염 (Pi)으로 가수 분해하는 능력으로 측정됩니다. 유리 인산염 농도가 높을수록 말라카이트 그린과의 복합체 형성이 증가하여 620nm에서 감지할 수 있는 강렬한 녹색이 생성됩니다(그림 4).
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말라카이트 그린 분석 프로토콜은 열충격 단백질 90(Hsp90) 억제 인자 및 ATP 의존성 효소에 대한 기타 억제제 화합물을 발견하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다.

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

이 프로토콜은 단백질에 의한 ATP 가수분해로 인한 유리 인산염을 측정하여 ATPase 단백질에 대한 활성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 말라카이트 그린 분석은 무기 인산염 검출을 위한 간단하고 민감하며 빠르고 저렴한 절차입니다. 표적에 대한 화합물의 자동화 및 고처리량 스크리닝에 적합합니다.이 기술은 중요한 항암 표적인 Hsp90 단백질에 대한 억제제의 신속한 발견에 중요한 역할을 할 것입니다. 먼저, 40 마이크로리터의 1밀리몰 인산염 표준물을 960 마이크로리터의 초순수에 피펫팅하여 40 마이크로몰 인산염 용액을 얻는다. 제조업체의 지침에 따라 이 용액을 추가하여 0-40-마이크로몰에서 인산염의 연속 희석을 형성합니다.다음으로, 측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 마이크로 리터의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 말라카이트 그린 시약을 블랭크와 양성 대조군에 첨가하고, 첨가 후 블랭크와 양성 대조군 사이의 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1 미만인지 확인한다. ATP를 준비하려면 1 밀리그램의 ATP를 453.39 마이크로 리터의 초순수가 들어있는 바이알에 옮겨 4 밀리몰 원액을 얻습니다.ATP는 시간이 지남에 따라 자발적으로 가수 분해 될 수 있으므로 신선하게 준비하십시오. 4 마이크로리터의 ATP 저장 용액을 각 웰에 첨가하여 0.2-밀리몰의 최종 웰 농도를 제공합니다. 모든 반응이 동시에 시작되도록 다중 채널 피펫을 사용하여 ATP를 반응의 마지막 성분으로 추가합니다.다음에, 1 밀리그램을 178.37 마이크로리터의 DMSO에 용해시켜 겔다나마이신의 10-밀리몰 스톡을 제조한다. 원액을 사용하여 연속 희석하여 DMSO에서 4 밀리몰, 0.8 밀리몰, 0.16 밀리몰, 0.032 밀리몰, 0.0064 밀리몰 및 0.00128 밀리몰 용액을 준비합니다. 0.1 밀리몰, 0.02 밀리몰, 0.04 밀리몰, 0.0008 밀리몰, 0.00016 밀리몰 및 0.000032 밀리몰의 최종 웰 농도를 얻기 위해 이러한 저장 용액 2 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하십시오.그런 다음 블랭크 및 음성 대조군이 포함된 웰과 함께 웰을 준비합니다. geldanamycin을 함유 한 우물은 양성 대조군으로 작용합니다. 96-웰 플레이트를 준비하고, 이 파장에서 흡광도를 기록하기 위해 620 나노미터에서 흡광도를 나타내는 화합물에 대해 별도의 웰을 준비한다.겔다나마이신은 이 분석에 사용된 농도에 대해 620나노미터에서 흡광도

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은...

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

이 비디오에서는 증폭된 발광 근접 균질 분석(bead-based proximity assay)을 시연합니다. 이 제품은 균일한 크기의 수용체 및 공여체 비드를 사용하며, 단백질 상호 작용을 억제하는 잠재적인 소분자를 스크리닝하기 위해 상호 작용하는 경향이 있는 두 개의 단백질로 고정되어 있습니다.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

SAMHD1은 인체 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 디옥시뉴클레오시드 삼인산삼인산삼인산가수분해효소입니다. 여기에서는 SAMHD1 기질, 활성제 및 억제제로서 소분자 및 뉴클레오티드 유사체를 평가할 수 있는 384웰 마이크로플레이트 형식으로 배포된 다목적 효소 결합 SAMHD1 활성 분석을 제시합니다.

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

학습하세요 말라카이트 그린 분석법을 이용하여 Hsp90 ATPase 활성을 측정하고 무기 인산을 검출하는 방법을. 이 고속 스크리닝 기술은 암 치료 표적 단백질의 저해제 발견에 필수적인 도구입니다.

열충격 단백질 90 억제제 발견을 위한 말라카이트 그린 분석

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