골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

유체 흐름 전단 응력은 골세포의 메카노 자극제로 가정됩니다. 직접 측정은 선택 사항이 아니기 때문에 골세포의 컨포칼 이미지 파생 모델은 골세포 수지상막에 대한 유체 흐름 전단 응력을 평가하기 위해 전산 유체 역학 분석을 수행하는 데 유용한 도구입니다. 우리 연구실에서 수행된 작업 중 일부는 유체 흐름, 전단 응력 및 응력이 높은 골세포 수지상 구조의 위치를 수치적으로 결정하기 위해 수지상 돌기의 비틀림 및 밀도를 포함한 실제 골세포 틈새 형태학이 뼈 및 틈새-이관 네트워크와 함께 사용되는 분야의 최근 발전과 일치합니다.

현재 기술에는 최종 요소 분석, 전산 유체 역학, 유체 구조 상호 작용, 정확한 3D 모델을 위한 X-Ray 또는 컨포칼 현미경을 포함한 이미지 기반 모델링, 제어 하중 조건에서 변형률과 같은 뼈 반응을 측정하여 모델을 검증하는 기계 테스트 시스템과 같은 다양한 컴퓨터 모델링이 포함됩니다. 우리의 연구 결과는 노화나 뼈 질환으로 인한 수상돌기의 손실이 뼈가 신체 활동에 덜 반응하게 되는 요인임을 나타냅니다. 우리는 골세포(osteocyte)가 수상돌기인 높은 유체 흐름 전단 응력 영역을 통해 기계적 부하를 감지한다고 예측했습니다.

그리고 유체 흐름 전단 응력은 틈새 형태, 특히 표면적과 같은 상관 관계가 있습니다. 이 프로토콜이 수립됨에 따라 우리는 현재 두 가지 연령과 성별의 생쥐 뼈의 골세포 수상돌기에서 유체 흐름 전단 응력을 연구하기 위한 NIH 프로젝트를 진행하고 있습니다. 이 연구는 노화와 성별 차이가 하중으로 인한 뼈의 메카노 전달에 어떤 영향을 미치는지 결정하는 데 도움이 될 것입니다.

먼저 마우스에서 채취한 대퇴골을 인산염 완충 식염수에 4%의 파라포름알데히드를 넣고 섭씨 4도에서 24시간 동안 부드럽게 흔들어 고정합니다. 다음날, 뼈와 인산염 완충 식염수를 헹구고 빠르게 중합되는 아크릴에 빠르게 삽입하십시오. 세 번째 트로챈터 위의 두꺼운 300마이크로미터 가로 슬라이스를 자릅니다.

사포를 사용하여 뼈 부분을 90-100 마이크로 미터의 최종 두께로 연마합니다. 그런 다음 연마된 부분을 70%95% 및 100% 에탄올로 각각 5분 동안 헹굽니다. 100% 에탄올에 C를 1% 넣어 어두운 곳에서 적당히 흔들어 4시간 동안 얼룩지게 합니다.

다음으로, 100% 에탄올로 섹션을 철저히 세척하십시오. 그리고 유리 슬라이드의 장착 미디어 한 방울에 넣기 전에 밤새 자연 건조하십시오. 시편에 커버 슬립을 장착합니다.

컨포칼 현미경에서 여기(excitation)를 위해 488나노미터 레이저를 설정하고 496-596나노미터의 방출 수집 창을 설정합니다. 먼저 5x 대물렌즈를 사용하여 전체 뼈 부분의 저배율 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 20x 대물렌즈를 사용하여 3개의 관심 영역의 이미지를 캡처합니다.

1.7의 디지털 줌과 0.126마이크로미터의 스텝 크기를 갖춘 100x 1.44 개구수 오일 대물렌즈를 사용하여 1024 x 1024 픽셀 및 0.089 마이크로미터 픽셀 해상도에서 400 Z 평면의 상세한 Z 스택을 수집합니다. 마우스 골세포의 컴퓨터 모델링을 위해 수집된 마우스 대퇴골의 Z 스택 이미지를 TIFF 형식으로 가져온 후 ImageJ 소프트웨어를 열고 섹션 메뉴에서 임계값을 조정하여 마스크에 포함할 픽셀 강도 제한을 변경합니다. 자르기 마스크 작업을 사용하여 canaliculi를 관심 영역으로 사용하여 하나의 틈새를 자릅니다.

한 변의 길이가 21, 14 및 19 마이크로미터인 가상의 더 큰 큐브에 틈새를 넣습니다. 영역 성장 작업을 수행하여 연결된 픽셀 영역을 선택하여 균일한 lacunar-canalicular network 또는 LCN을 생성합니다. 다음으로, 계산된 부품 연산을 사용하여 lacunar-canalicular mask를 객체로 변환합니다.

골세포와 수지상막을 구축하기 위해 평활화 작업을 사용하여 LCN 부피를 줄입니다. 그런 다음 개체를 내보냅니다. LCN과 골세포 수지상막의 두 표면을 하나의 표면으로 결합합니다.

이제 remesh 작업을 사용하여 lacunar canalicular space의 체적 모델을 만듭니다. 모델을 STL 파일로 내보내고 객체 배율을 마이크로미터로 조정합니다. 3차원 이미지 기반 처리 소프트웨어에서 마우스 lacunar-canalicular space의 체적 모델을 선택하여 고유한 골세포 모델을 구축합니다.

더 낮은 임계값을 선택하여 이미지의 광도를 줄이고 canaliculi가 더 적은 틈새를 얻습니다. 다음으로, 다양한 lacunar-canalicular 공간 두께 또는 dendrite canalicular diameters를 가진 osteocyte 모델을 개발합니다. 각각 래핑 또는 평활화 작업을 사용하여 더 크거나 더 작은 골세포 모델을 구축합니다.

시뮬레이션 소프트웨어에서 유체 흐름을 생성하려면 개발된 컨포칼 이미지 기반 형상을 CFX 소프트웨어로 가져옵니다. 단위 치수를 나노미터로 설정합니다. 다음으로, 빼기를 클릭하여 lacunar canicular space의 단일 몸체를 얻습니다.

생성된 패싯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 면을 병합하지 않고 깎인면에서 솔리드 도메인으로 변환합니다. 메쉬를 클릭하고 요소 크기가 0.06마이크로미터인 선형 사면체 요소를 선택합니다. 메쉬 수렴 스터디로 메쉬를 미세 조정합니다.

이제 표면을 선택하고 가상 큐브의 위쪽에 있는 이관을 유체 유입구로 선택합니다. 상자를 사용하여 다른 5개 면의 이관을 유체 배출구로 선택합니다. 그런 다음 메쉬를 내보냅니다.

다른 유체 흐름을 만든 후 fluent mesh를 CFX의 설정 섹션으로 가져옵니다. 경계 삽입 옵션을 사용하여 면에 대한 입구와 출구의 두 경계 조건을 정의합니다. 입구와 출구에 각각 300의 유체 입구 압력과 0파스칼을 가합니다.

나머지 표면은 미끄럼 방지 상태의 벽으로 처리합니다. 재료 라이브러리에서 간질 층류를 물로 처리합니다. heat transfer, combustion, thermal radiation sections (열 전달, 연소 및 열 복사 섹션)을 none(없음)으로 설정합니다.

LCN에서 터뷸런스를 유체 특성으로 선택합니다. 그런 다음 배정 밀도를 사용하여 소프트웨어를 실행하고 제출 유형으로 직접 시작합니다. CFD 소프트웨어의 결과 섹션에 새 윤곽선을 삽입합니다.

영역에서 변수로 osteocyte dendritic membranes의 wall shearing을 선택하여 유체 흐름 전단 응력 또는 FFSS 윤곽을 생성합니다. 다음으로, 입구에서 시작하여 lacunar-canalicular domain 내부에 속도 유선 윤곽을 삽입합니다. 젊은 골세포 모델에서 골세포 및 수지상막의 평균 FFSS는 0.42 파스칼이었으며, 이는 노화된 골세포 모델의 0.13 파스칼보다 유의하게 높았습니다.

FFSS는 모델 7과 모델 8에서 볼 수 있듯이 열공 이관 공간이 더 큰 골세포에서 증가했으며, 모델 8에서 모델 8이 가장 높은 FFSS를 보였습니다. 0.19 파스칼 및 0.13 파스칼의 가장 낮은 FFSS 값은 각각 가장 낮은 이관 밀도로 모델 2와 모델 4에서 관찰되었습니다. 모델 5와 6에서 볼 수 있듯이 증가된 수상돌기 직경에서 FFSS의 큰 변화는 관찰되지 않았습니다.