Name: 폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 역류 원심분리 시스템을 활용한 폐쇄형 자동화 인간 중간엽 줄기 세포 수확 방법을. 이 프로토콜은 약 98%의 세포 회수율과 99%의 생존율을 달성하며 cGMP 규정 준수를 지원합니다.

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저자는 싱가포르 A*STAR의 IAF-PP(Industry Alignment Fund Pre-Positioning) 자금(H18/01/a0/021 및 H18/AH/a0/001)의 지원에 감사드립니다.

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P.J., A.B., R.L. 및 J.N.은 Thermo Fisher Scientific의 직원입니다. A.L.과 S.O.는 이해 상충이 없습니다.

이 작업에서 우리는 역류 원심분리 기기를 사용하여 hMSC 해리를 닫고 반자동화하고 벤치에서 세척 및 수확하는 능력을 보여주었습니다. 전체 워크플로에서 중요한 단계 중 하나는 역류 원심분리 시스템 프로토콜 빌더에 정의된 사전 설정 프로토콜에 따라 튜빙이 연결되었는지 확인하는 것입니다. 설정 및 작동이 간단하며 키트 조립에서 세포 수확까지 10층 플라스크에서 약 2L의 배양을 처리하는 데 걸린 시간은 약 60분이었습니다. 이 워크플로우의 제한 단계 중 하나는 다층 플라스크에서 역류 원심분리 기기에 연결된 이송 백으로 유체를 이송하는 것입니다. 고유량 일회용 키트는 최대 165mL/분의 유속에서만 작동할 수 있으며, 예를 들어 40층 플라스크를 처리하는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 유체 이송 과정을 가속화하기 위해 외부 고유량 펌프를 사용하여 트립신 처리된 내용물을 먼저 이송 백으로 이송한 다음 역류 원심분리 시스템을 사용하여 이송 백에서 세포를 세척/농축 및 수확할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 4층에서 10층 다층 플라스크로 세포를 계대배양하는 데에도 적용할 수 있습니다. 더 상류에서, 역류 원심분리 시스템은 또한 해동된 hMSC의 세척과 종자 트레인을 시작하기 위해 다층 플라스크에 직접 수확 및 배지 제형을 최적화할 수 있습니다. 역류 원심분리 챔버에서 유동층을 형성하는 데 필요한 최소 셀 수는 약 3천만 개의 셀이며, 배치당 처리할 최대 권장 부피는 20L입니다.
현재, 생물 안전 캐비닛의 다층 플라스크에 맞춤형 튜브 어셈블리를 부착하고 구성 요소 부품의 오토클레이빙은 cGMP 설정에서 바람직하지 않습니다. 대안으로, 맞춤형 감마선 멸균 튜빙 어셈블리를 공급업체에 아웃소싱할 수 있습니다. 다층 플라스크를 제공하는 공급업체는 또한 0.2μm 필터를 포함하여 원하는 튜브 어셈블리로 플라스크를 사전 장착하고 전체 복장의 감마선 멸균을 할 수 있는 옵션을 제공합니다. 이렇게 하면 다층 플라스크와 부착된 튜브가 실제로 닫히게 되며, 이는 클래스 C 클린룸 설정의 벤치에서 프로세스를 완료할 수 있음을 의미합니다.
역류 원심분리 시스템을 활용한 이 공정은 다층 용기의 부착 기반 배양 세포에 국한되지 않으며 동적(교반 탱크 또는 파동 생물반응기) 및 정적(가스 투과성) 현탁액 기반 세포 확장 플랫폼에 적용할 수 있습니다. 특히, 3D 마이크로캐리어 배양에서 확장된 hMSC의 경우, 역류 원심분리 시스템에서 프로토콜을 최적화하여 마이크로캐리어에서 해리된 hMSC를 수확, 세척 및 공식화할 수 있습니다. 
전반적으로, 공정 견고성과 신뢰성이 향상된 번역 세포 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 폐쇄형 자동 세포 처리 플랫폼이 개발되었습니다. 이러한 시스템은 취급 단계의 수를 줄이고, 멸균 연결부에 의한 잠재적 오염을 방지하며, 노동력을 줄이고 클린룸 공간(21)의 효과적인 사용을 향상시킴으로써 제조 비용을 절감하기 때문에 필수적이다. 이에 따라, 치료법을 번역하기 위해 규제 승인을 받고자 하는 많은 세포치료제 개발자들은 공정 개발 단계(14,31,32)부터 공정을 종료하고 완전 자동화 또는 반자동화를 구현하는 것의 중요성을 인식하고 있다.
규제 친화적인 SFM XF 배지를 사용하고 21 CFR GMP Part 11 및 국제 품질 지침을 준수하는 보조 시약과 함께 이 반자동 공정은 임상 제조에 매우 적합합니다. 우리는 폐쇄 공정의 재현성과 WJ-MSC의 품질 유지를 보여주었습니다. 다층 플라스크에서 부착 기반 세포를 배양하는 효율성과 안전성을 개선하면 hMSC 치료 분야뿐만 아니라 세포주 은행 및 부착 바이러스 생산 회사에도 도움이 될 것입니다.

인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 임상적으로 관련된 세포 투여량을 생성하는데 중요한 치료 잠재력과 시험관 내에서 성장할 수 있는 높은 자가 재생 가능성을 감안할 때 조직 공학 및 세포 치료 모두에서 임상 적용을 위한 훌륭한 후보입니다 1,2,3. ClinicalTrials.gov 에 따르면, 현재 다양한 질병 상태에 대해 1,000건 이상의 임상 시험이 진행 중이다4. hMSC 사용에 대한 관심이 높아지고 있는 상황에서 가까운 장래에 더 많은 임상 시험과 시장 승인이 임박했습니다 5,6. 그러나 hMSC의 제조는 배치 간 변동성, 고위험 원료 사용, 제조에 여러 단위 작업이 포함되기 때문에 많은 개방형 및 수동 공정으로 인한 오염에 대한 우려, 높은 인건비, 확장 또는 확장 비용 및 규제 장애물 6,7,8,9,10, 11,12. 이러한 문제는 현재와 미래의 시장 접근에 중요한 장벽으로 남아 있습니다.
폐쇄형, 모듈식, 자동화된 제조 솔루션의 개발과 저위험 보조 시약을 사용하면 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 이는 또한 일관된 제품 품질을 보장하고, 인적 오류로 인한 배치 실패 가능성을 줄이고, 인건비를 줄이고, 디지털 배치 기록 보관 8,12,13,14와 같은 프로세스 표준화 및 규정 준수를 개선합니다. 자가 또는 동종 세포에 임상적으로 적합한 용량을 얻을 수 있으려면 폐쇄적이고 자동화된 방식으로 업스트림 세포 확장 및 다운스트림 처리를 포함하는 간소화된 제조가 중요합니다.
업스트림 hMSC 확장의 경우, 현재 사용되는 가장 일반적인 두 가지 제조 방법은 스케일 아웃 (2D 단층) 및 스케일 업 (3D 마이크로 캐리어 기반 서스펜션 시스템)입니다 15,16,17,18. hMSC 확장을 위해 가장 전통적이고 널리 채택된 방법은 낮은 생산 비용과 설정의 용이성으로 인한 2D 단층 기반 배양이다19.
배양 용기 내에 쌓인 평평한 표면 트레이로 구성된 다층 플라스크는 일반적으로 hMSC 생산을 확장하는 데 사용됩니다. 이들 시스템은 전형적으로 1층 내지 40층 배양 용기(20 )로 제공되며, 생물안전 캐비넷 내부에서 수동으로 처리된다. 세포 계대 및 수확 중 처리 단계에는 전체 용기를 피펫팅하거나 물리적으로 기울여 팽창 배지, 해리 시약 및 세척 완충액을 수동으로 분배하고 디캔팅하는 작업이 포함됩니다. 게다가, 여러 장치를 다루는 것은 크기와 무게로 인해 어렵고 시간이 많이 걸립니다.
그 후, 다층 플라스크로부터의 수확 후, 배지 교환을 위한 원심분리, 세포 세척 및 부피 감소는 전체 세포 제조 워크플로우에 걸쳐 필수적인 단계이다21. 기존의 탁상형 원심분리는 세포 현탁액을 생물 안전 캐비닛 내부의 캡이 있는 튜브 또는 병으로 옮기고, 세포를 회전시키고, 상층액을 수동으로 흡인하고, 완충액을 사용한 세포 재현탁 및 반복적인 세포 세척과 같은 여러 단계를 포함하는 대부분 개방적이고 수동적인 공정입니다. 이는 캡의 개폐로 인한 오염 위험과 수동 흡인/피펫팅 공정22 동안 세포 펠릿을 잃어버릴 가능성을 극적으로 증가시킨다. hMSC와 같은 부착 기반 세포에 대한 다층 배양 시스템을 처리하는 맥락에서 작업자는 원심분리기와 생물안전 캐비닛 사이를 반복적으로 왕복하고 동시에 무거운 장치를 취급하는 힘든 과정을 거쳐야 합니다. 이러한 수동 단계는 힘들고 인적 오류 및 오염 측면에서 위험을 내포하며 비용이 많이 드는 클래스 B 클린룸 환경에서 수행해야 합니다23. 또한 기존의 수동 원심분리 공정은 확장 가능하지 않으며 세포 전단 및 응력을 유발할 수 있습니다. 따라서, 세포 회수율, 생존율 및 잔류 불순물의 세척 효율을 극대화하는 것은 다른 주요 과제이다22. 세포 치료제의 상업적 cGMP 규모 제조에는 오염 위험을 줄이고, 일관된 제품 품질을 보장하고, 인건비 및 생산 비용을 절감하고, 공정 신뢰성을 높이기 위해 폐쇄형 모듈식 자동화 솔루션이 필요합니다24,25. 다층 플라스크는 멸균 가스 교환을 용이하게 하기 위해 포트 중 하나에 멸균 0.2μm 필터를 두고 커넥터를 통해 무균적으로 연결되거나 세포 수확을 위한 자동화된 셀 처리 기기에 직접 튜브로 용접된 두 번째 포트를 통해 폐쇄형 시스템으로 처리할 수 있습니다. 우리는 세포, 유전자 또는 조직 기반 제품의 제조를 위한 혁신적인 폐쇄형 역류 원심분리기를 평가하여 WJ-hMSC 계대배양 및 수확의 대부분의 단계를 닫고 자동화하기 위해 노력했습니다. 이 역류 원심분리 기는 또한 다양한 세포 유형 8,26,27,28에 대한 크기, 배지/완충액 교환, 농축 및 수확에 기반한 세포 분리와 같은 다양한 세포 처리 응용 분야를 수행할 수 있는 유연성을 가지고 있습니다. 이 기기는 튜브 용접 또는 무균 커넥터를 사용하여 백을 이송하여 멸균 연결하거나 선택한 확장 플랫폼에 직접 연결할 수 있는 폐쇄형 일회용 키트를 사용합니다.
이 연구에서는 일회용 역류 원심분리 키트와 다층 플라스크 사이에 폐쇄된 멸균 연결이 가능하도록 맞춤형 튜브 어셈블리를 설계했습니다. 우리는 단일 실행 내에서 완전히 폐쇄되고 반자동화된 방식으로 다층 플라스크에서 WJ-MSC를 효소적으로 분리, 세척 및 수확하도록 프로토콜을 최적화했습니다. 수확된 WJ-hMSC는 순도(표면 마커 분석) 및 효능(CFU-F, 삼계선 분화 및 사이토카인 분비 프로필)을 특성화하여 최종 제품이 로트 방출에 대한 중요 품질 특성(CQA)을 충족하는지 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td>2L PVC 전사 백</td><td>TerumoBCT</td><td>BB*B200TM</td><td></td></tr><tr><td>알시안 블루 솔루션, pH 2.5</td><td>머크</td><td>101647</td><td></td></tr><tr><td>알리자린-레드 염색 솔루션</td><td>머크</td><td>TMS-008-C</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 휴먼 CD73 항체</td><td>Biolegend</td><td>344015</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 IgG1, &kappa; Isotype Ctrl (FC) 항체</td><td>Biolegend</td><td>400121</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex MAGPIX 멀티플렉스 리더</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대향류 원심분리 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A47679</td><td>Gibco CTS Rotea 대향류 원심분리 시스템</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>CTS(L-알라닐-L-글루타민) GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>CTS Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>칼슘, 마그네슘</td></tr><tr><td>CTS 재조합 인간 비트로넥틴(VTN-N)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>CTS TrypLE Select Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285901</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 튜빙 어셈블리</td><td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td><td>N/A</td><td>감마선 멸균 3/32" 멸균 수컷 MPC(1/8" 미늘)가 장착되고 다른 쪽 끝이 밀봉된 ID PVC 라인. 한쪽 끝에는 멸균 Cell Factory 포트 커넥터가 있고 다른 쪽 끝에는 암 MPC(3/8" 미늘)가 장착된 짧은 C-Flex 라인을 오토클레이브합니다. 생물 안전 캐비닛에 PVC 및 C-Flex 라인 연결</td></tr><tr><td>Emflon II 캡슐(0.2um 필터)</td><td>Pall</td><td>KM5V002P2G100</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12662029</td><td>중간엽 줄기세포 검증, USDA 승인 영역</td></tr><tr><td>FGF 염기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>FITC 항인간 CD105 항체</td><td>Biolegend</td><td>323203</td><td></td></tr><tr><td>FITC 항-인간 CD45 항체</td><td>Biolegend</td><td>304005</td><td></td></tr><tr><td>FITC 항-인간 CD90 (Thy1) 항체</td><td>Biolegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse IgG1, &kappa; Isotype Ctrl (FC) 항체</td><td>Biolegend</td><td>400109</td><td></td></tr><tr><td>Hi-flow 일회용 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A46575</td><td>Gibco CTS Rotea Hi-flow 일회용 키트, 유속 30 &ndash; 165 mL/min</td></tr><tr><td>다층 시스템&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140360 (4-layer); 140410 (10-layers)</td><td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-3000</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td></td></tr><tr><td>Oil red O staining solution</td><td>Merck</td><td>102419</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr>PerCP 마우스 IgG1 <td>343519</td><td></td> <td>PerCP 항인간 CD34 항체</td><td>Biolegend</td></tr>, <tr><td>&kappa; Isotype Ctrl 항체</td><td>Biolegend</td><td>400147</td><td></td></tr><tr><td>ProcartaPlex 다중 면역 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>맞춤형 19-Plex 패널: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2, MIP-1&alpha;, MIP-1&beta;, MIP-3&alpha;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&alpha;, TGF&alpha;, TNF-alpha, VEGF-A&nbsp;</td></tr><tr><td>시료 포트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50111</td><td>2개의 PVC 라인이 부착된 감마 멸균 류어 시료 포트</td></tr><tr><td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 연골세포 분화</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ME20236L1</td>에는 <td>StemPro, MSC, SFM, 기초 매체 및 맞춤형 MSC, SF XF 보충제 (100x)</td></tr><tr><td>, StemPro, 골형성 차별화 키트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10072-01</td><td></td></tr>, <tr><td>T175 Nunc EasYFlask</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>159910</td><td></td></tr>, <tr><td>T75 Nunc, EasYFlask</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr>, <tr><td>TGF&beta; 1</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>PHG9204</td><td></td></tr><tr><td>WJ MSCs&nbsp;</td><td>프로모션셀</td><td>(#C12971; 독일)</td><td>인간 중간엽 줄기 세포</td></tr> <tr><td>&알파; MEM 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12571063</td><td>뉴클레오시드 포함</td></tr></tbody></table>

폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 현재 다양한 질병에 대한 유망한 세포 기반 치료 방식으로 연구되고 있으며 향후 몇 년 동안 임상 사용에 대한 더 많은 시장 승인이 예상됩니다. 이러한 전환을 촉진하려면 규모, 로트 간 재현성, 비용, 규정 준수 및 품질 관리의 병목 현상을 해결하는 것이 중요합니다. 이러한 문제는 프로세스를 종료하고 자동화된 제조 플랫폼을 채택하여 해결할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 역류 원심분리를 사용하여 다층 플라스크에서 Wharton's jelly(WJ) 유래 hMSC(WJ-hMSC)를 통과 및 수확하기 위한 폐쇄형 및 반자동 공정을 개발했습니다. WJ-hMSC는 규정을 준수하는 SFM XF(serum-free xeno-free) 배지를 사용하여 확장되었으며, 고전적인 혈청 함유 배지에서 확장된 WJ-hMSC와 유사한 세포 증식(집단 배가) 및 형태를 보여주었습니다. 당사의 폐쇄형 반자동 수확 프로토콜은 높은 세포 회수율(~98%)과 생존력(~99%)을 입증했습니다. 역류 원심분리를 사용하여 세포를 세척하고 농축하여 WJ-hMSC 표면 마커 발현, 집락-형성 단위 (CFU-F), 삼계통 분화 전위 및 사이토카인 분비 프로파일을 유지하였다. 연구에서 개발된 반자동 세포 수확 프로토콜은 서로 다른 세포 확장 플랫폼에 직접 연결하여 부피 감소, 세척 및 낮은 출력 부피로 수확을 수행함으로써 다양한 부착 및 현탁 세포의 중소 규모 처리에 쉽게 적용할 수 있습니다.

WJ-hMSC 마스터 세포 뱅크 (MCB) 해동 후는 실험을 위한 충분한 작업 세포 뱅크 (WCB)를 생산하기 위해 고전적인 혈청 함유 배지에서 3개의 연속 계대 (p1-p4) 동안 유지되었다. p4 WCB는 T-175 플라스크에서 3개의 추가 계대(p4-p7)를 위해 혈청 함유 배지 및 SFM XF 배지 모두에서 해동 및 확장되었습니다. WJ-MSC는 SFM XF 배지에서 확장되었을 때 잘 적응했으며 혈청 함유 배지에서와 유사한 안정적인 증식을 유지할 수 있었습니다(그림 2A). 그러나 SFM XF 배지에서 확장된 세포는 섬유아세포와 같은 방추형 형태가 약간 더 길었고, 그 결과 혈청 함유 배지의 ~15μm에 비해 평균 ~17μm의 약간 더 큰 세포 크기(그림 2B)를 나타냈습니다. 세 계대에 걸친 두 배지 조건에서 WJ-hMSC는 ~2.3 x 104 cells/cm2의 최대 세포 밀도와 ~34h의 집단 배가 시간에 일관되게 도달했습니다(그림 2C,D).
폐쇄형 시스템에서 대규모 WJ-hMSC 확장을 위해 먼저 4층 플라스크에서 WJ-hMSC의 시드 트레인 확장을 수행한 후 10층 다층 플라스크에서 수행했습니다. 배양 4일 후 약 80%-90% 밀도에서 4층 및 10층 스택에 대해 각각 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 및 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 108 세포를 수확했습니다. T-175 플라스크에 비해 3.6 x 10 4-3.8 x 104 cells/cm2의 더 높은 세포 밀도에 도달했으며, 이는 스택이 최대 7배까지 더 나은 세포 확장을 허용했음을 의미합니다.
또한, 10층 배양 용기에서 확장된 WJ-hMSC를 역류 원심분리를 사용하여 직접 수확했습니다. 일회용 키트에 대한 멸균 연결은 기기의 연동 펌프를 사용하여 최대 165mL/분의 유속으로 유체를 직접 전달하기 위해 쉽게 설정할 수 있었습니다. 반자동 세포 수확 공정은 먼저 효소 해리를 사용하여 세포를 수확하고, 부피 감소 및 농축을 위해 세포를 역류 챔버에 로딩한 다음, 역류 원심분리 챔버 부피의 약 3배인 세척 완충액으로 세척함으로써 달성되었습니다. 또한, 세척된 세포를 농축하고, 프로토콜에 미리 설정된 원하는 수확량으로 수확하였다. 반자동 세포 처리에 사용되는 처리 단계는 수동 수확 워크플로를 에뮬레이션하도록 설계되었습니다. 부피를 10배 감소시켜 530만 cells/mL에 달하는 세포 농도를 생성했습니다. 이 프로토콜은 세 가지 독립적인 실행 모두에 대해 일관되게 ~98%에서 높은 세포 회수율과 ~99%에서 높은 세포 생존율을 달성할 수 있었습니다(그림 3A-C).
우리는 수동 원심분리와 비교하여 역류 원심분리를 사용하여 세포 수확의 중요한 품질 특성을 결정하기 위해 광범위한 세포 특성화 분석을 수행했습니다. WJ-hMSCs의 정체를 시험하기 위해, 세포 표면 마커를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 두 가지 방법을 사용하여 수확된 WJ-hMSC는 ISCT 규정에 따라 특징적인 표면 마커 프로파일, CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현 및 CD34 및 CD45의 음성 발현을 나타냈다. 다음으로, WJ-hMSCs의 클론 생성 가능성을 평가하기 위해, CFU-F 분석을 수행하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 역류 원심분리로부터 수확된 세포는 수동 원심분리에 의해 수확된 세포와 비교하여 유사한 CFU-F 전위를 나타내었다 (각각 21% ± 1% 대 20% ± 1%). 또한, 도 4C에 나타난 바와 같이, 역류 후 원심분리-수확된 세포는 수동 원심분리 방법에서의 세포와 유사한 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화하는 능력을 유지하였다. 마지막으로, 우리는 다중 면역 분석법을 사용하여 세포의 18 가지 사이토 카인 분비 프로파일을 조사했습니다. 도 4D에 나타낸 바와 같이, 역류 후 원심분리를 사용하여 세포를 세척하고 농축한 후 사이토카인 분비 프로파일을 유지했으며, 프로파일은 세포 세척/농축 전에 채취한 샘플의 프로파일과 비슷했습니다(역류 전 원심분리).
전반적으로, 당사는 SFM XF 배양 시스템에서 효율적인 hMSC 확장을 입증했으며, 폐쇄형 자동 역류 원심분리 시스템을 사용하여 세척 및 농축된 세포는 세척 후 높은 세포 회수율과 생존력을 산출했으며 표현형과 기능을 유지할 수 있었습니다. 이 연구에서 개발된 폐쇄형 반자동 공정은 세 번의 독립적인 실행에서 입증된 바와 같이 최종 WJ-MSC 회수 측면에서 제품 품질 일관성을 제공할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> 그림 1: hMSC의 수확, 세척 및 농축을 위한 고유량 일회용 키트 구성 및 조립 . (A) 백이 각 튜브와 일직선으로 연결된 후의 키트 다이어그램. (B) 맞춤형 튜빙 어셈블리와 함께 고유량 일회용 키트에 연결된 10층 다층 플라스크. (C) 역류 원심분리 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스에서 활성화된 카메라 기능을 통해 역류 챔버에 형성된 안정적인 유동 세포 베드의 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> 그림 2: 혈청 함유 배지와 SFM XF 배지에서 hMSC의 세포 형태 및 확장 비교. (A) 고전적 혈청 배지 및 SFM XF 배지에서 hMSC의 대표적인 세포 형태. SFM XF 확장 세포는 더 긴 방추형 특징적인 섬유아세포와 유사한 형태를 보인 반면, 혈청 함유 배지에서 성장한 세포는 더 평평한 형태를 나타냈습니다. (B) 자동 세포 계수기(n=3)에 의해 측정된 혈청 함유 배지와 SFM XF 배지 사이의 평균 MSC 크기. SFM XF 확장 세포가 일반적으로 다른 계대에서 혈청 확장 세포보다 더 컸다는 것을 분명히 알 수 있습니다. 상이한 계대(n=3)에서의 총 세포 수율 (C) 배양 표면적당 세포 및 (D) 개체군 배가 수준. 서로 다른 계대에 걸쳐 SFM XF 배지와 혈청 함유 배지 간에 유사한 수준의 세포 수율이 얻어졌습니다. 데이터는 평균± 표준편차로 표현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> 그림 3: 역류 원심분리 시스템을 사용하여 처리된 세포의 특성 분석 . (a) 세척 전후의 총 생존 세포 및 농축. (B) 10배 부피 감소는 역류 원심분리 처리 후 달성되었습니다. (C) 세포의 총 회수율 및 생존력. 데이터는 세척 및 농축 실행의 3번의 생물학적 복제(n = 3)에 대해 평균화됩니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> 그림 4: 중요한 품질 속성 분석. (A) 유세포 분석의 대표 데이터. (B) 총 CFU를 보여주는 대표 이미지. (C) 삼계통 분화의 대표적인 현미경 이미지. (d) 역류 원심분리 시스템 상에서 세포를 처리하기 전과 후의 사이토카인 발현 분석 결과(n=3). 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 초기 프라이밍 단계를 포함하는 역류 원심분리 시스템 상의 트립신 처리, 세척 및 농축 프로토콜에 의한 hMSC 수확의 순서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 역류 원심분리 시스템을 사용하여 폐쇄형 반자동 방식으로 다층 플라스크에서 부착 세포를 수확하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 기존 단계를 거의 수정하지 않고 다른 세포 확장 플랫폼에서 부착 세포와 현탁 세포를 모두 수확하는 데 적용할 수 있습니다.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

탁상형 원심분리는 확장하기 어려운 개방형 수동 프로세스입니다. 당사의 프로토콜은 중간엽 줄기 세포(MSC)의 해리, 세척 및 수확을 한 번의 실행으로 닫고 자동화하는 방법을 보여줍니다. 설정은 간단합니다.전체 공정은 cGMP 등급 시설의 생물 안전 캐비닛 외부에서 수행 할 수 있습니다. 폐쇄형 자동 셀 처리는 위험에 노출될 수 있는 수동 처리 단계를 줄이고 cGMP 준수를 가능하게 합니다. 이 방법은 다층 배양 시스템에서 확장된 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다.역류 원심분리 시스템을 사용하면 다양한 응용 분야에 대한 모든 프로토콜 단계를 수정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 싱가포르의 스타 인 Bioprocessing Technology Institute의 줄기 세포 바이오 프로세싱 그룹의 직원 과학자 인 Alan Lam 박사가 될 것입니다. 일회용 역류 원심분리 키트 조립을 시작하려면 이미지에 설명된 대로 튜브 용접을 통해 일회용 키트를 일회용 PVC 이송 백과 연결합니다.그런 다음 생물 안전 캐비닛 내부에서 합류, Wharton's Jelly 유래 인간 중간엽 줄기 세포 또는 Wharton's Jelly HMSC가 포함된 10층 다층 플라스크를 맞춤형 튜브 어셈블리에 부착합니다. 맞춤형 튜빙 어셈블리가 있는 부착된 10층 배양 용기를 벤치로 옮기고 일회용 키트의 라인 E에 용접합니다. 또한. 멸균 샘플 포트를 고유량 일회용 키트의 라인 G에 용접합니다.다음으로, 수확 라인 H를 50 밀리리터 주사기가 장착 된 멸균 루어에 연결하십시오. 기기 실행을 설정하려면 기기 후면의 토글 스위치를 사용하여 기기를 켜고 제공된 USBC 케이블을 사용하여 노트북을 기기의 USBC 포트에 연결합니다. 바탕 화면이나 시작 메뉴에서 Counterflow Centrifuge 그래픽 사용자 인터페이스 또는 GUI 소프트웨어를 실행하고 로그인합니다.그런 다음 기본 시작 페이지에서 Select a protocol 버튼을 클릭하여 프로토콜을 로드합니다. 그런 다음 기기의 파란색 잠금 해제 버튼을 누르고 유리 도어를 열어 조립된 일회용 키트를 역류 원심분리 시스템에 로드합니다. 10겹 다층 플라스크를 비스듬히 배치한 상태에서 버블 센서 스트립의 튜브 포트와 가장 잘 정렬되는 순서로 가방을 옷걸이 후크에 걸어 놓는 것으로 시작합니다.두 개의 키트 위치 버튼으로 키트를 정렬합니다. 연동 펌프 주위의 펌프 튜브를 늘리고 흰색 전구 모양의 커넥터를 제자리에 누릅니다. 역류 원심분리기 챔버 캐리어의 은색 레버를 들어 올려 원심분리기 챔버를 부착하고 레버를 수직 위치로 되돌려 고정합니다.키트의 각 포트에서 버블 센서 스트립을 따라 트랙으로 튜브를 누릅니다. 도어 걸쇠를 눌러 도어를 닫습니다. GUI에서 시작 버튼을 누르십시오.체크리스트가 나타납니다. 처음 네 항목은 기기 검사이고 마지막 두 항목은 사용자 검사입니다. 이 시점에서 가방과 연결부가 키트 이미지와 일치하고 수동 클램프가 열려 있는지 확인하십시오.확인을 눌러 프로토콜 입력 화면을 표시합니다. 데이터 입력 또는 수확량 대화 상자 값을 45밀리리터로 설정하고 확인을 누릅니다. 기기의 녹색 시작 버튼을 눌러 프로토콜 실행을 시작합니다.초기 프라이밍이 완료되면 사용한 매체가 폐기물 봉투로 완전히 펌핑되었는지 확인하십시오. 워크플로 테이블에 표시된 일시 중지 단계에서 다층 플라스크를 들어 올리고 흔들어 버퍼를 모든 트레이에 균등하게 분배합니다. 완료되면 다음 단계를 위해 10층 다층 플라스크를 원래 그리기 위치에 다시 놓습니다.단계 20 및 23에서, 트립신 처리된 세포가 중간 백으로 완전히 옮겨졌는지 확인한다. 단계 25에서 중간 백을 수동으로 잘 혼합합니다. 단계 26에서, 2밀리리터 루어 주사기를 사용하여 샘플링 포트를 통해 샘플링한다.단계 29 및 30에서, 유동화된 세포층의 안정된 형성을 확인한다. 여기에 표시된 유동 세포층과 같아야 합니다. r에서 실행이 완료됩니다.amp 정지 단계, 역류 원심분리 시스템의 모든 핀치 값이 자동으로 닫힙니다.프로토콜 실행이 완료되면 기기의 파란색 잠금 해제 버튼을 누르고 유리문을 엽니다. 핸드 캐리 튜브 실러를 사용하여 수확 라인을 무균 밀봉하고 농축된 세포 수확물로 채워진 밀봉된 주사기를 세포 계수 및 냉동 보존을 위해 생물학적 안전 캐비닛으로 조심스럽게 옮깁니다. 레버를 사용하여 챔버를 다시 분리합니다.전구 커넥터를 피팅에서 당겨 빼내고 키트를 조심스럽게 들어 올려 생물학적 위험 백에 폐기합니다. 에탄올 물티슈를 사용하여 기기를 청소하고 문을 닫습니다. 마지막으로, 기기 후면의 스위치를 끄기 전에 먼저 GUI 애플리케이션을 닫습니다.Wharton's Jelly MSC는 혈청 함유 및 무혈청, 무이종 배지 모두에서 확장되었을 때 잘 증식했습니다. 그러나 무혈청, 무이종 배지의 세포는 혈청 배지의 15미크론에 비해 평균 세포 크기가 17미크론으로 약간 더 긴 섬유아세포와 같은 방추형 형태를 나타냈습니다. 세 통로에 걸친 두 매체 모두에서 Wharton's Jelly HMSC는 평방 센티미터당 약 23, 000 세포의 최대 세포 밀도와 34시간의 인구 배가 시간에 일관되게 도달했습니다.입증된 역류 원심분리를 사용하여 Wharton's Jelly HMSC를 10층 배양 용기에서 확장했을 때 부피가 10배 감소하여 밀리리터당 530만 개의 세포에 달하는 세포 농도가 생성되었습니다. 이 프로토콜은 3개의 독립적인 실행에 대해 약 98%의 높은 세포 회수율과 약 99%의 높은 세포 생존율을 일관되게 달성했습니다. 두 가지 방법을 사용하여 수확한 Wharton's Jelly HMSC는 CD73, CD90 및 CD105 양성과 CD34 및 CD45 음성인 특징적인 표면 마커 프로파일을 나타냈습니다.역류 원심분리로부터 수확된 세포는 수동 원심분리에 의해 수확된 세포와 비교하여 유사한 콜로니-형성 단위 섬유아세포 분석 또는 CFU 전위를 나타내었다. 두 방법 모두에서 세포는 지방 세포, 조골 세포 및 연골 세포로 분화하는 능력을 유지했습니다. 역류 후 원심분리 후 세포의 사이토카인 분비 프로파일은 역류 전 원심분리와 비슷하였다.침대 설정을 참조하여 일회용 키트를 조립하고 이 Counterflow Centrifusion System Protocol Builder에서 교체해야 합니다. 최종 제품에서 잔류 불순물을 세척하기 위한 프로토콜은 사용자가 로트 방출 기준을 충족하도록 지원하기 위해 임상 적용에 사용될 수 있습니다. 대규모 처리를 위한 유체 이송 공정을 가속화하기 위해 외부 펌프를 사용하여 다층 플라스크에서 직접 수확하는 대신 트립신 처리된 내용물을 먼저 이송 백으로 이송할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Sharma, AD, et.al. 신경 보호 전략을 위한 치료 인자 전달을 위해 조작된 성체 줄기 세포의 고처리량 특성화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 치료용 신경영양 인자를 발현하도록 조작된 형질전환 중간엽 줄기세포를 특성화하는 과정을 보여줍니다. 세포 증식 마커를 표적으로 하는 1차 및 2차 항체로 세포를 고정, 투과화 및 염색한 다음 핵에서 형광 신호를 포착하기 위해 고함량 스크리닝 시스템을 사용하여 분석하는 단계를 간략하게 설명합니다. 증식 마커 발현 증가는 신경 치료 응용에 대한 형질전환 세포의 적합성을 확인합니다.

신경치료 응용을 위한 유전자 조작 중간엽 줄기 세포의 특성화

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

이 연구는 신경계 구조 및 복구를 위한 장기 생체 내 이식 연구에 적용하기 전에 조작된 줄기 세포와 그 행동을 신속하게 특성화하는 실험 플랫폼을 설명합니다.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수에서 얻어지며 확장 배양이 필요합니다. 시료가 처리 전에 응고되면 (효소) 혈전용해제인 우로키나아제(urokinase)를 사용하는 프로토콜을 적용하여 혈전을 분해할 수 있습니다. 따라서 세포가 방출되어 확장 배양에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 리샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

학습하세요 역류 원심분리 시스템을 활용한 폐쇄형 자동화 인간 중간엽 줄기 세포 수확 방법을. 이 프로토콜은 약 98%의 세포 회수율과 99%의 생존율을 달성하며 cGMP 규정 준수를 지원합니다.

폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리

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