Name: 시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 나노입자 및 나노구조 표면의 항균 활성을 시험관 내 기법으로 평가하는 방법을. 다양한 미생물 종과의 상호작용 연구에 일관되고 비교 가능한 결과를 제공합니다.

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저자는 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학교 (UC) 리전트 교수 개발 펠로우쉽, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 Patricia Holt-Torres에게 수여 된 UC-Riverside 대학원 연구 멘토십 프로그램 보조금. 저자는 SEM/EDS 사용을 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis)과 XRD 사용을 위해 Perry Cheung 박사가 제공한 지원에 감사드립니다. 저자는 또한 실험 및 데이터 분석에 도움을 준 Morgan Elizabeth Nator 및 Samhitha Tumkur에게 감사를 표합니다. 이 기사에 표현된 모든 의견, 발견, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 국립 과학 재단 또는 국립 보건원의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

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저자는 이해 상충이 없습니다.

우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 특성화하기 위해 4 가지 시험관 내 방법 (AD)을 제시했습니다. 이러한 각 방법은 나노 물질에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 박테리아 성장 및 생존력을 정량화하지만 시간 경과에 따른 초기 박테리아 파종 밀도, 성장 및 생존력을 측정하는 데 사용되는 방법에는 약간의 차이가 있습니다. 이 방법 중 세 가지, 직접 공동 배양 방법 (A) 17, 직접 배양 방법 (C) 14 및 초점 접촉 노출 방법 (D) 16은 단위 부피당 CFU를 계산하여 나노 물질에 노출 된 후 박테리아 성장과 생존력을 정량화합니다. 이에 비해 직접 노출 방법(B)은 이산 실시간 광학 밀도(OD600) 측정을 통해 박테리아 성장을 정량화합니다. 이 방법은 CFU를 정량화하는 데 시간 제약이 있거나 동역학 연구에 실시간 박테리아 밀도...

미국에서만 매년 170만 명이 병원 획득 감염(HAI)을 일으키며, 이 중 17건 중 1건이 사망에 이른다1. 또한 HAI의 치료 비용은 연간 280억 달러에서 450억 달러에 이르는 것으로 추정됩니다 1,2. 이러한 HAI는 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)3,4 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)4에 의해 우세하며, 이들은 일반적으로 만성 상처 감염으로부터 분리되며, 일반적으로 유리한 환자 결과를 얻기 위해 광범위한 치료와 시간이 필요합니다.
지난 수십 년 동안 이러한 박테리아 및 기타 병원성 박테리아와 관련된 감염을 치료하기 위해 여러 항생제 종류가 개발되었습니다. 예를 들어, 리파마이신 유사체는 MRSA, 다른 그람 양성 및 그람 음성 감염, 및 Mycobacterium spp. 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다5. 1990년대에는 증가하는 M. tuberculosis 감염을 효과적으로 치료하기 위해 추가 약물을 리파마이신 유사체와 결합하여 효과를 높였습니다. 그러나, 결핵균 감염자의 약 5%는리팜피신에 내성이 남아 있으며5,6, 다제내성균에 대한 우려가 증가하고 있다7. 현재, 항생제 단독으로는 HAI 치료에 충분하지 않을 수 있으며, 이로 인해 대체 항균 요법에 대한 지속적인 연구가 촉발되었다1.
은(Ag)8,9,10 및 금(Au)11과 같은 중금속과 이산화티타늄(TiO2)12 및 산화아연(ZnO)13과 같은 세라믹은 나노입자(NP) 형태(각각 AgNP, AuNP, TiO2 NP 및 ZnONP)는 항균 활성에 대해 조사되었으며 잠재적인 항생제 대안으로 확인되었습니다. 또한, 마그네슘 합금 (Mg 합금) 14,15,16, 산화 마그네슘 나노 입자 17,18,19,20,21 및 수산화 마그네슘 나노 입자 [각각 nMgO 및 nMg (OH) 2]22,23,24 , 또한 조사되었습니다. 그러나 나노 입자에 대한 이전의 항균 연구는 일관되지 않은 재료와 연구 방법을 사용하여 비교하기 어렵거나 불가능하고 때로는 본질적으로 모순되는 데이터를 생성했습니다18,19. 예를 들어,은 나노 입자의 최소 억제 농도 (MIC)와 최소 살균 농도 (MBC)는 다른 연구에서 크게 달랐다. Ipe et al.25는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 MIC를 결정하기 위해 ~26nm의 평균 입자 크기를 갖는 AgNP의 항균 활성을 평가했습니다. 녹농균, 대장균, 황색포도상구균 및 MRSA에 대해 확인된 MIC는 각각 2μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL 및 10μg/mL였습니다. 대조적으로, Parvekar et al.26은 평균 입자 크기가 5nm인 AgNP를 평가했습니다. 이 경우 AgNP MIC와 0.625mg/mL의 MBC가 S. 아우레우스에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, Loo et al.27은 4.06 nm 크기의 AgNPs를 평가하였다. 대장균이 이러한 나노 입자에 노출되었을 때 MIC와 MBC는 7.8 μg / mL로보고되었습니다. 마지막으로 Ali et al.28은 평균 크기가 18nm인 구형 AgNP의 항균 특성을 조사했습니다. 녹농균, 대장균 및 MRSA가 이들 나노입자에 노출되었을 때, MIC는 각각 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL 및 36 μg/mL에서 확인되었고, MBC는 각각 36 μg/mL, 42 μg/mL 및 30 μg/mL에서 확인되었다.
나노 입자의 항균 활성은 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 보고되었지만 연구 전반에 걸쳐 직접 비교할 수 있는 재료 및 연구 방법에 대한 표준은 없습니다. 이러한 이유로 우리는 재료와 방법을 일관되게 유지하면서 나노 입자의 항균 활성을 특성화하고 비교하기 위해 직접 공동 배양 방법 (방법 A)과 직접 노출 방법 (방법 B)의 두 가지 방법을 제시합니다.
나노 입자 외에도 나노 구조 표면도 항균 활성에 대해 조사되었습니다. 여기에는 그래핀 나노시트, 탄소 나노튜브, 흑연29와 같은 탄소 기반 재료와 순수 Mg 및 Mg 합금이 포함됩니다. 이들 물질 각각은 탄소 기반 물질에 의해 세포막에 가해지는 물리적 손상 및 Mg가 분해될 때 활성 산소종(ROS)의 방출을 통한 대사 과정 또는 DNA 손상을 포함하여 적어도 하나의 항균 메커니즘을 나타냈습니다. 또한, 아연(Zn)과 칼슘(Ca)이 Mg 합금의 형성에 결합될 때, Mg 매트릭스 입자 크기의 미세화가 향상되고, 이는 Mg-단독 샘플(14)에 비해 기판 표면에 대한 박테리아 접착의 감소로 이어진다. 항균 활성을 입증하기 위해 직접 및 간접 표면 접촉을 통한 박테리아 집락 형성 단위(CFU)의 정량화를 통해 시간 경과에 따른 나노 구조 물질 위와 주변의 박테리아 부착을 결정하는 직접 배양 방법(방법 C)을 제시합니다.
크기, 모양 및 방향을 포함한 표면의 나노 구조의 기하학은 재료의 살균 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, Lin et al.16 은 양극 산화 및 전기 영동 증착 (EPD)을 통해 Mg 기판의 표면에 상이한 나노 구조 MgO 층을 제조했다. 시험관 내에서 나노구조화된 표면에 일정 기간 노출된 후, S. 아우레우스 의 성장은 처리되지 않은 Mg에 비해 실질적으로 감소되었다. 이것은 처리되지 않은 금속 Mg 표면에 비해 박테리아 접착에 대한 나노 구조 표면의 더 큰 효능을 나타냅니다. 다양한 나노 구조 표면의 항균 특성의 다양한 메커니즘을 밝히기 위해 관심 영역 내에서 세포-표면 상호 작용을 결정하는 집속 접촉 노출 방법(방법 D)이 이 기사에서 논의됩니다.
이 기사의 목적은 서로 다른 나노 입자, 나노 구조 표면 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 제시하는 것입니다. 비교 가능성을 위해 일관되고 재현 가능한 데이터를 생성하기 위해 각 방법에 대한 주요 고려 사항에 대해 논의합니다. 구체적으로, 나노입자의 항균성을 조사하기 위해 직접공배양법(17)과 직접노광법이 사용된다. 직접 공동 배양 방법을 통해 개별 종에 대해 최소 억제 및 최소 살균 농도(각각 MIC 및 MBC90-99.99)를 결정할 수 있으며 여러 종에 대해 가장 강력한 농도(MPC)를 결정할 수 있습니다. 직접 노출 방법을 통해 최소 억제 농도에서 나노 입자의 정균 또는 살균 효과는 시간 경과에 따른 실시간 광학 밀도 판독값으로 특성화할 수 있습니다. 직접 배양14 방법은 나노 구조 표면과 직접 및 간접적으로 접촉하는 박테리아를 검사하는 데 적합합니다. 마지막으로, 박테리아의 직접 적용과 세포-나노 구조 계면에서의 박테리아 성장의 특성화를 통해 나노 구조 표면의 특정 영역의 항균 활성을 조사하기 위해 초점 접촉 노출16 방법이 제시됩니다. 이 방법은 일본 산업 표준 JIS Z 2801:200016에서 수정되었으며 미생물-표면 상호 작용에 초점을 맞추고 미생물 배양에서 벌크 샘플 분해가 항균 활성에 미치는 영향을 배제하기 위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z336777</td><td></td></tr><tr><td>80 L NTRL 인증 대류 건조 오븐&nbsp;</td><td>MTI Corporation</td><td>BPG-7082</td><td>https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx</td></tr>(<tr><td>하이드록시메틸)아미노메탄 완충액 pH 8.5; 트리스 버퍼&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>42457</td><td></td></tr><tr><td>아나스펙&nbsp; THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-850-291</td><td></td></tr><tr><td>전자 증식 전하 결합 장치 디지털 카메라&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>글루테알데히드</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Brightline, Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>유도 결합 플라즈마 - 광학 방출 분광법 (ICP-OES)</td><td>PerkinElmer</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>역 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Life Science&nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani 국물 + 한천</td><td>시그마 생명 과학&nbsp;</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>매크로튜브 5.0&nbsp; &nbsp;</td><td>벤치 마크 사이언티픽</td><td>C1005-T5-ST</td><td></td></tr><tr><td>산화 마그네슘 나노 입자</td><td>US Research Nanomaterials, Inc</td><td>주식 # : &nbsp; US3310&nbsp; &nbsp; &nbsp; M</td><td>MgO, 99+%, 20 nm</td></tr><tr><td>MS Semi-Micro Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS105D</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 종이</td><td>Fisherbrand</td><td>09-801A</td><td></td></tr><tr><td>비조직 처리 12-웰 폴리스티렌 플레이트</td><td>Falcon Corning 브랜드&nbsp;</td><td></td><td></td>351143</tr><tr><td>비조직 처리된 48-웰 폴리스티렌 플레이트</td><td>Falcon Corning 브랜드&nbsp;</td><td></td><td></td>351178</tr><tr><td>비조직 처리된 96-웰 폴리스티렌 플레이트</td><td>Falcon Corning 브랜드&nbsp;</td><td></td><td></td>351172</tr><tr><td>페트리 접시 100 mm</td><td>VWR</td><td>470210-568</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 15 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>VWR</td><td>SP70P</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경 (SEM)</td><td>TESCAN&nbsp;</td><td>Vega3 SBH</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>VWR</td><td>97043-936</td><td></td></tr><tr><td>테이블 탑 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>accuSpin Micro 17</td><td></td></tr><tr><td>테이블 탑 원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5430</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>MP</td><td>1010617</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광광도계&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200 PRO</td><td>https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro</td></tr><tr><td>VWR 벤치마크 Incu-shaker 10L</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-ray 전력 굴절</td><td>&nbsp; Panalytical</td><td>N/A</td><td>PANalytical Empyrean 시리즈 2</td></tr></tbody></table>

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

은, 산화 아연, 이산화 티타늄 및 산화 마그네슘과 같은 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성은 이전에 임상 및 환경 환경과 소모성 식품에서 탐구되었습니다. 그러나 사용된 실험 방법과 재료의 일관성 부족은 동일한 나노 구조 유형과 박테리아 종에 대한 연구 사이에서도 상충되는 결과를 낳았습니다. 나노 구조를 제품 설계에서 첨가제 또는 코팅으로 사용하려는 연구자의 경우 이러한 상충되는 데이터는 임상 환경에서의 활용을 제한합니다. 
이 딜레마에 맞서기 위해 이 기사에서는 나노 입자와 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 네 가지 방법을 제시하고 다양한 시나리오에서 적용 가능성에 대해 논의합니다. 일관된 방법을 적용하면 연구 전반에 걸쳐 비교하고 다양한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 대해 구현할 수 있는 재현 가능한 데이터로 이어질 것으로 예상됩니다. 나노입자의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법과 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법을 소개합니다. 
나노 입자의 경우, 직접 공동 배양 방법을 사용하여 나노 입자의 최소 억제 및 최소 살균 농도를 결정할 수 있으며, 직접 노출 배양 방법을 사용하여 나노 입자 노출로 인한 실시간 정균 대 살균 활성을 평가할 수 있습니다. 나노 구조 표면의 경우, 직접 배양 방법은 나노 구조 표면과 간접적으로 직접 접촉하는 박테리아의 생존 가능성을 결정하는 데 사용되며, 초점 접촉 노출 방법은 나노 구조 표면의 특정 영역에서 항균 활성을 검사하는 데 사용됩니다. 우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 특성을 결정할 때 시험관 내 연구 설계를 위해 고려해야 할 주요 실험 변수에 대해 논의합니다. 이러한 모든 방법은 상대적으로 비용이 저렴하고 비교적 마스터하기 쉽고 일관성을 위해 반복 가능한 기술을 사용하며 광범위한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 적용할 수 있습니다.

산화 마그네슘 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 식별은 다양한 재료 유형 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 사용하여 제시되었습니다.
방법 A와 방법 B는 지연 단계 (방법 A) 및 로그 단계 (방법 B)에서 24 시간 이상 나노 입자에 노출되었을 때 박테리아 활동을 검사합니다. 방법 A는 MIC 및 MBC에 관한 결과를 제공하는 반면, 방법 B는 나노 입자의 억제 대 살균 효과를 결정합니다. 방법 C는 나노 구조 표면과 직접 및 간접 접촉하여 박테리아 활동을 검사하고, 방법 D는 24 시간 이상의 기간 동안 세포-나노 구조 계면의 선택된 영역에서 박테리아 활동을 검사합니다.
사용된 방법은 그림 1과 그림 2에 설명되어 있으며 그 결과는 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, </stron...

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

이 프로토콜은 예비 단계 조사에서 보다 복잡한 표면 검사에 이르기까지 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 검사하는 방법을 제공합니다. 연구 전반에 걸쳐 비교할 수 없는 데이터를 초래한 이전에 설명한 방법과 달리 이러한 방법은 다양한 나노 입자 재료, 나노 구조 재료 및 미생물 종에 걸쳐 일관되고 비교 가능한 결과를 생성합니다. 방법 A와 B에서 나노 입자의 균일 한 분포를 유지하는 것은 어려울 수 있습니다.샘플을 철저히 소용돌이 치면 나노 입자 현탁액이 보장되고 부분 표본 사이에 3-4 회 피펫 팅이 현탁액을 유지합니다. 하룻밤 사이에 자란 박테리아 배양 물 1 밀리리터를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 분주하여 배양 된 박테리아 수집을 시작합니다. 충분한 수의 분취액을 만든 후 원하는 좌석 밀도에 도달하도록 원심 분리합니다. 상청액을 수집 용기에 수집합니다.세포 펠릿을 0.5 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시킨다. 두 튜브의 현탁액을 결합하고 원심 분리를 반복하십시오. 원심 분리 후, 신선한 성장 배지로 두 번째 세척을하고 튜브를 원심 분리하기 전에 두 개의 튜브에서 내용물을 하나로 결합하는 것을 반복하십시오.0.33 밀리리터의 트리스 완충액 또는 히드 록시 에틸 아미노 메탄 완충액으로 세 번째 세척을하십시오. 각각 0.33 밀리리터 부피의 3 개의 현탁액을 하나의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기로 결합합니다. 원심분리 후, 펠릿화된 세포로부터 상청액을 제거하고, 세포 현탁액 또는 래그 단계 박테리아 파종 배양으로 알려진 1밀리리터의 신선한 트리스 완충액에 세포 펠릿을 다시 현탁시킨다.박테리아 및 나노입자 배양물을 형성하기 위해, 2밀리리터의 박테리아 파종 배양물을 조직 처리되지 않은 폴리스티렌 플레이트의 12웰의 각 웰에 분취한다. 미리 칭량된 산화마그네슘 입자가 들어 있는 각 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 3밀리리터의 박테리아 파종 배양물을 추가합니다. 튜브를 잠깐 소용돌이치게 하여 산화마그네슘 나노입자와 박테리아를 혼합한다.혼합 후, 산화마그네슘 나노입자 현탁액 1밀리리터를 3개의 개별 웰에 분취하여 산화마그네슘 나노입자의 미리 측정된 중량의 3배 샘플을 생성하였다. 샘플을 섭씨 37도 및 120rpm에서 밤새 배양합니다. 그리고 피펫을 사용하여 3 밀리리터 샘플을 개별 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 적절한 수의 컬럼에 대해 행 B에서 행 G의 각 웰에 180마이크로리터의 트리스 버퍼를 추가하여 96웰 플레이트에서 1-10회 연속 희석을 수행합니다. 박테리아 샘플이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브를 간단히 와동시키고 50마이크로리터의 박테리아 샘플을 행 A.Next의 개별 웰에 추가합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 B 행의 웰에서 C 행의 해당 웰로 20 마이크로 리터를 옮깁니다.G 행까지 계속하여 B 행의 10에서 10 행의 음극 6까지 연속 희석을 완료합니다. 플레이트를 가로질러 퍼뜨려 세포 배양물을 분산시킨다.웰 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 인큐베이터 셰이커에 넣고 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이션합니다. 플레이트를 검사하고, 대략 25 내지 300개의 콜로니를 갖는 플레이트를 계수한다. 가능하면 동일한 희석 값의 플레이트를 선택하십시오.시험할 각 물질에 대해, 성장 배지에 3개의 200 마이크로리터 분취액을 3개의 웰에 첨가하고, 박테리아 배양의 3개의 200 마이크로리터 분취액을 추가 웰에 첨가하여 하룻밤 박테리아 샘플을 희석한다. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔합니다. 필요한 경우 600나노미터 또는 OD 600에서 광학 밀도가 약 0.01에 도달할 때까지 배양액을 계속 추가하거나 밤새 박테리아 배양을 계속합니다.박테리아 나노 입자 현탁액 및 멸균 매체 나노 입자 현탁액을 제조하기 위해, 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 삼중 세트로부터 1 밀리리터의 박테리아 배양 또는 배지를 제거한다. 그리고 미리 측정 된 나노 입자가 들어있는 5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 첨가하십시오. 튜브를 소용돌이 치며 용액을 혼합합니다.5 밀리리터 원심분리 튜브로부터 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 1 밀리리터 분취량을 옮겨 나노입자를 균질하게 분배한다. 완료되면 각 샘플 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 웰에 분취합니다. 앞서 설명한 착석 밀도를 결정한 후, 샘플 및 대조군을 48 웰 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.다음에, 0.75 밀리리터의 세포 현탁액을 샘플 및 대조군을 함유하는 각각의 웰에 분취한다. 48웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이터 쉐이커에 넣고 120RPM으로 진탕합니다. 배양 후 각 그룹에서 두 개의 샘플을 수집하고 라벨이 붙은 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 개별적으로 옮깁니다.각 튜브에 2 밀리리터의 수정 된 모의 체액 (RSBF)을 추가하십시오. 멸균 된 아질산 셀룰로오스 종이를 직경 1cm로 잘라서 준비하십시오. 절단된 니트로셀룰로오스 종이를 적절한 배지가 들어 있는 한천 플레이트에 놓습니다.다음으로, 희석된 박테리아 배양액 50마이크로리터를 여과지에 첨가한 후 각 샘플 표면의 중앙에 적절한 배지 50마이크로리터를 첨가합니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 오거 표면에서 질산 셀로스 종이를 집어 올립니다. 질산 셀룰로오스 종이를 조심스럽게 뒤집어 샘플 표면에 놓아 박테리아가 50 마이크로 리터의 배지 및 관심있는 나노 구조 표면과 접촉하도록합니다.샘플이 배양 중에 분해되는 경우 트리스 버퍼와의 접촉을 피하기 위해 홀더를 그 아래에 놓아 들어 올리십시오. 1밀리리터의 트리스 완충액을 웰이 포함된 샘플에 추가하여 습도를 유지합니다. 하룻밤 배양 후, 각 샘플 표면으로부터 니트로셀룰로스 페이퍼를 수집하고, 이들을 5밀리리터의 트리스 완충액에 넣는다.수집된 여과지와 나노표면 물질 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다. 샘플에서 트리스 버퍼 현탁액을 수집하고 개별 신선한 수집 튜브에 넣습니다. 방법 A를 사용한 항균 효과는 그람 음성 대장균 및 녹농균에 대해 산화 마그네슘 나노 입자 밀리리터 당 1 밀리그램의 최소 및 억제 농도 (MIC)와 산화 마그네슘 나노 입자의 밀리리터 당 1.0 및 1.6 밀리그램의 최소 살균 농도 (MBC 99.9)를 각각 확인했다.그람 양성 포도상 구균 표피, S.Aureus 및 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 (MRSA)은 MIC의 값이 각각 밀리리터 당 0.5, 0.7 및 1 밀리그램 / 밀리리터 산화 마그네슘 나노 입자를 입증했습니다. 밀리리터당 1.6밀리그램 및 1.2밀리그램의 NBC 99.99 값이 각각 S.epidermis 및 S.aureus에 대해 확인되었습니다. MRSA는 NBC 90 이상으로 감소하지 않았습니다.밀리리터당 1.2 및 1밀리그램의 MIC는 약물 민감성 및 약물 내성 칸디다 종, C 알비칸스 및 C 알비칸스 플루코나졸 내성 또는 FR에서 각각 확인되었습니다. 대조적으로, 산화 마그네슘 나노 입자는 밀리리터 당 1 및 0.7 밀리그램, 또는 C.glabrata 및 C glabrata echinocandin 내성 또는 ER의 MIC 값을 각각 입증했다. 각 후보 종은 밀리리터당 0.7 내지 1.2 밀리그램의 NBC 90에 도달했지만, C.glabrata ER만이 밀리리터당 1.2 밀리그램의 NBC 99.9로 감소되었다.방법 B에서, 나노 입자에 노출 된 MRSA는 0.85의 OD로 기하 급수적으로 증가했다. 산화 마그네슘 나노 입자 밀리리터 당 1.2 밀리그램과 트리 메토 프림 밀리리터 당 6.25 밀리그램에 노출되면 박테리아 성장이 각각 80.2 %와 81.6 % 감소했다. 유사하게, 수산화 마그네슘 나노 입자의 밀리리터 당 2.9 밀리그램은 박테리아 성장을 70.3 %로 감소 시켰습니다 반코마이신 밀리리터 당 1 마이크로 리터에 노출되면 MRSA의 성장이 99.99 % 감소하여 산화 마그네슘 및 수산화 마그네슘 나노 입자의 정균 활성을 시사합니다.방법 C는 간접 접촉으로 박테리아 성장을 억제하지 않는 것으로 나타났습니다. 결과는 ZC21이 시험된 모든 표본을 위한 MRSA의 접착 그리고 성장에 대하여 가장 강한 항균 활동이, 있었다는 것을 나타내었다. 방법 D에서는 1.9A, 1.9 AA 및 EPD 샘플 또는 쌍을 이루는 여과지에서 생존 가능한 황색포도상구균이 확인되지 않았습니다.그러나, 무릎을 꿇은 후 EPD 샘플에 노출되면 나노 구조 표면 및 파싱 된 여과지에서 몇 개의 세포로 박테리아 성장이 감소했습니다. 나노 입자 및 나노 구조 표면 항균 활성을 식별하면 만성 상처 및 임플란트 관련 감염과 관련된 응용 분야를 포함하여 생명 공학 응용 분야에서 추가 조사가 이루어졌습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

전이 금속과 탄소의 조합으로 설계된 나노입자 복합재료가 포함된 매체가 담긴 튜브를 생각해 봅시다.항생제 내성 그람 양성 및 그람 음성 병원성 박테리아를 별도의 튜브에 시험 샘플로 주입합니다.처리되지 않은 박테리아를 음성 대조군으로, 항생제 처리된 박테리아를 양성 대조군으로 포함하세요.샘플을 흔들어 부양하세요.그람 음성 박테리아에서는 다공성 외막과 얇은 펩티도글리칸 층이 나노입자 침입을 촉진하여 막 파괴를 일으킵니다.나노입자는 반응성 산소 종의 생성을 촉진하여 DNA, 단백질, 막을 손상시켜 박테리아 사망률을 높입니다.그람 양성 박테리아에서는 테이코산으로 농축된 두꺼운 펩티도글리칸층이 나노입자 침투를 제한하여 박테리아 사사율을 낮춥니다.다음으로, 배지를 사용해 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석합니다.희석된 것을 한천에 접시하고, 군집 형성을 위해 배양한 뒤 군락 수를 세세요.시험 샘플 내 콜로니 수가 두 대조군보다 적은 수로 나노입자의 항균 효과가 확인되었습니다. 그러나 그 효과는...

병원성 박테리아에 대한 나노입자 복합재의 항균 활성 평가

Source: Holt-Torres, P. S. et al. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the use of the focused-contact exposure method to evaluate the antibacterial activity of nanostructured surfaces. It outlines the steps involved in establishing direct contact between bacteria and the nanostructured surface, incubation, bacterial collection, and colony counting to assess viability.

Assessing the Antibacterial Activity of Nanostructured Surfaces Using a Focused-Contact Exposure Method

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

이 연구에서는 항균 나노 multiwalled 탄소 나노튜브의 산 성 산화 및은 나노 입자의 연속적인 감소 증 착에 의해 합성 되었다. 항균 성 활동 및 세포 독성 테스트 준비로 나노 수행 했다.

나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

우리는 고급 재료의 항균 특성에 대 한 프로토콜을 제시. 여기, 소재 표면에 항균 성 활동 서로 보완 하는 두 가지 방법에 의해 측정 된다: 하나는 agar 디스크 확산 테스트 기반 이며 다른 표준 절차 ISO 22196:2007 규격에 따라.

생명 공학 응용 프로그램에 대 한 고급 재료의 항균 특성

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

항균 실험실 코트는 병원균 축적 및 우발적인 생물 유출의 교차 오염을 방지합니다. 여기에서는 실험실 코트의 일반적인 용도에 대한 효능과 적합성을 정확하게 평가하기 위해 나노 허브 캡슐화 및 수정된 표준 테스트를 사용하여 피부 친화적인 항균 직물을 개발하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

에센셜 오일의 나노 허브 캡슐화를 이용한 항균 직물

이 연구에서는 산화아연 나노입자를 침전방법을 사용하여 합성하였다. 합성된 입자의 항균 효과는 다제내성 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 및 녹농 균 균주에 대해 테스트되었습니다.

산화아연 나노입자의 제조 및 항균 효과 평가

이 프로토콜은 박테리아 활성 모델링과 조합적 상호작용 분석법을 사용하여 식물화학물질이 전통적 살균제의 살균 효과를 어떻게 증진할 수 있는지 체계적으로 평가하는 틀을 제공하며, 이는 미생물 방제를 개선하고 전체 살균제 사용을 줄이는 시너지 혼합물을 식별하는 것을 목표로 합니다.

시험관 내 식물유래 분자가 기존 살생물에 미치는 증강 효과 평가

학습하세요 나노입자 및 나노구조 표면의 항균 활성을 시험관 내 기법으로 평가하는 방법을. 다양한 미생물 종과의 상호작용 연구에 일관되고 비교 가능한 결과를 제공합니다.

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

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