Name: 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략 탐색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 탐색하세요 저산소증으로 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 한약재 조합 전략을 배양 및 세포 생존율 분석을 통해 검증하는 방법을. 이 기술은 신경세포 보호 효과가 있는 최적의 허브 조합을 선별하는 간단하고 효율적인 시험관 내 실험법을 제공합니다.

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이 연구는 쓰촨성 과학기술부(2020YFS0325)의 주요 R&D 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다.

<ol><li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cerebral+ischemia%2C+and+dizziness%5BTitle%5D)+AND+%22Zhurnal+Nevrologii+i+Psikhiatrii+Imeni+SS+Korsakova%22%5BJournal%5D)">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li>
<li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Integrated+Traditional+and+Western+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li>
<li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Jilin+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li>
<li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method%5BTitle%5D)+AND+%22China+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2%2FHO-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li>
<li>Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> 924(2020).</li>
<li>Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> 1592(2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy%3A+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K%2FAKT%2FBcl-2%2FBAX+pathway+in+human+chondrosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li>
<li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Asarone+ameliorates+%CE%B2-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K%2FAkt%2FNrf2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).</li>
<li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Xinjiang+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li>
<li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine+Modern+Distance+Education+of+China%22%5BJournal%5D)">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li>
<li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22China+Journal+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li>
<li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Clinical+Rational+Drug+Use%22%5BJournal%5D)">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li>
<li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hebei+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).</li>
<li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Guangdong+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li>
<li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164(2020).</li>
<li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress%2C+inflammation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619(2019).</li>
<li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K%2FAkt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Armed+Police+Logistics+College+%28Medical+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li>
<li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K%2FAkt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li>
<li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer%27s+disease+and+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo%3A+Involvement+of+dual+PI3K%2FAkt+and+Nrf2%2FHO-1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li>
<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

현대 임상 실습에서 뇌 허혈 치료를위한 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 기를 보충하고 혈액 순환 방법을 활성화시키는 지침에 따라 Ast, Eri 및 기타 제제가 TCM의 임상 실습에서 병용되어 왔으며 우수한 종합 이점을 달성했습니다13,14,15. 많은 연구에 따르면 Ast는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키고 뇌 혈류를 증가 시키며 신경 세포가 저산소증을 견디고 산소 자유 라디칼 손상에 저항하는 능력을 향상시키고 신경 기능 장애를 크게 개선 할 수 있습니다16,17. 노인성 허혈성 뇌혈관 질환16,17에 특...

뇌저관류로 인한 만성 뇌허혈은 중년 및 노인에게 흔한 질환입니다1. 장기 잠복성 허혈 질환으로서 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 주요 병리학 적 메커니즘에는 세포 사멸 및 산화 적 손상이 포함되며 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애를 유발합니다. 이것은 알츠하이머 병, 혈관성 치매 및 기타 질병의 병리학 적 기초이며 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 그러나 만성 뇌 허혈을 치료하기위한 현대 의학의 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 동시에, 황기 몽홀리쿠 스(Ast)와 에리게론 브레비스카푸스 (Eri)의 조합은 중국 전통 의학(TCM)의 임상 실습에서 널리 사용되었습니다.4. 병용 전략은 뇌 허혈 후 신경 기능의 회복을 촉진하는 데 현저하게 개선되었으며, 이는 단일 약물보다 우수합니다. 그러나, 두 약물의 조합에서 투여 비율에는 큰 차이가 있습니다4. 효과적인 구성 요소와 작용 메커니즘이 잘 정의되어 있지 않아 임상 적용을 제한하는 핵심 문제입니다.
이전 연구는 쥐의 뇌 허혈 치료에서 Ast 주사와 Eri 주사의 제제 조합의 시너지 효과를 입증했습니다. p-Akt 단백질의 발현을 상향조절하고 B-림프모세포종 2(Bcl-2) 계열 단백질 중 하나인 Bcl-2 관련 사멸 촉진제(BAD) 단백질 5,6의 발현을 하향조절하여 세포사멸을 촉진하는 효과가 있습니다. 그러나 시너지 효과의 물질적 근거와 메커니즘은 명확하지 않습니다. 또한, PC12 세포의 손상 모델을CoCl2 조합 무포도당 배지로 확립하고, Ast 및 Eri에서의 최적 성분 조합을 스크리닝하고 7로 정의하였다.
이 연구에서, Ast 및 Eri의 유효 투여량은 손상된 PC12 세포 모델을 사용하여 스크리닝된다. 두 약물의 최적 조합은 균질 설계 방법과 결합 된이 모델을 사용하여 스크리닝됩니다. 세포 모델은 손상된 PC12 세포에서 제제 조합과 성분 조합의 효과 및 메커니즘의 차이를 추가로 평가하는 데 사용됩니다. 이 전략은 PI3K/Akt/Nrf2 신호 경로를 통해 손상된 PC12 세포에 대한 두 가지 유형의 조합의 보호 효과 및 조절 메커니즘을 탐색하여 최상의 조합 모드를 결정하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 TCM의 최상의 애플리케이션 모드를 최적화하기위한 참고 자료를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1300 시리즈 클래스 II 생물안전 캐비닛</td><td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>1374</td><td></td></tr><tr><td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td><td>Guangzhou saiguo biotech Company</td><td>1334GR001</td><td>MTT</td></tr><tr><td>ACEA NovoExpress&nbsp; 1.4.0</td><td>ACEA Biosciences,</td> <td>Inc-Akt</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>10176-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>분석 유세포 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>62-2-1810-1027-0</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>C1062L</td><td></td></tr><tr><td>황기 주사</td><td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td><td>A03190612144</td><td>Ast 주입</td></tr><tr><td>Astragaloside A</td><td>충칭 Gao Ren 생명 공학 회사</td><td>84687-43-4</td><td></td></tr><tr><td>Bax</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>60267-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 정량 키트</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0012</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>26593-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>0816-2014</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>19677-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>클로로겐산</td><td>충칭 Gao Ren Biotechnology Company</td><td>327-97-9</td><td></td></tr><tr><td>코발트 클로라이드 육수화물</td><td>Merck Biotechnology, Inc.</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Guangzhou saiguo biotech Company</td><td></td><td>2020112701 DMSO</td></tr><tr><td>인산수소이나트륨 도데카하이드레이트</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2020090101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고당 매체</td><td>Thermo scientific Hyclone</td><td>2110050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 무설탕 매체</td><td>Beijing Solarbio life sciences Company</td><td></td><td></td>2029548</tr><tr><td>ECL 발광 유체</td><td>Lianshuo Biological Company</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., 상하이, 중국</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 기기</td><td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1658026</td><td></td></tr><tr><td>Erigeron breviscapus capsule</td><td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td><td>Z53021671</td><td>에리 캡슐</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td><td>20210402</td><td>FBS</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympms Corporation</td><td>IX71-F32PH</td><td></td></tr><tr><td>젤 이미저</td><td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 2 차 항체</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 2차 항체</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>SA00001- 2</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 버전 26.0</td><td>International Business Machines Corporation, USA-ImageJ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.8.0</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>-</td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Immunol&nbsp; 형광&nbsp; 염색 키트</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2021070901</td><td></td></tr><tr><td>마커</td><td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td><td></td><td></td>HH35L2018296</tr><tr><td>Motic 도립 현미경</td><td>Nanda Scientific Instruments Co.</td><td></td><td></td>AE2000LED</tr><tr><td>NaCl</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2014081301</td><td></td></tr><tr><td>무지방 우유</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0216</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>16396-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>P-Akt</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>66444-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>PC12 세포</td><td>중국과학원</td><td></td><td></td>CBP60430</tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Thermo scientific Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase 프로테아제 억제제 혼합물</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P1045</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼</td>륨 <td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2015082901</td><td></td></tr><tr><td>활성산소종 분석 키트</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>RI-PA 용해 솔루션</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>Scutellarin</td><td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td><td>27740-01-8</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼, 5x</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 팁(0.22 &마이크로; m)</td><td>머크 바이오테크놀러지, Inc.</td><td></td><td></td>SLGP033RB</tr><tr><td>Tris-base</td><td>Guangzhou saiguo biotech Company</td><td>1115GR500&nbsp;</td><td>증권 시세</td></tr> 표시기<tr><td>Trypsin</td><td>Thermo scientific Hyclone</td><td>J190013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2021051301</td><td></td></tr><tr><td>Vortex oscillator</td><td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>VXMNAL&</td><td></td></tr><tr><td>beta;-actin</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>66009-1-IG</td><td></td></tr></tbody></table>

손상된 pc12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략 탐색

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

뇌 허혈 치료에서 중국 전통 의학(TCM) 조합의 이점을 고려하여 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략을 탐구하기 위해 제제 조합과 성분 조합 간의 효능 및 메커니즘의 차이를 연구했습니다. 글루코오스가 없는 배지와 결합된 염화코발트(CoCl2)를 사용하여PC12 세포의 산화적 손상을 유도하였다. 이어서, 황기몽홀리쿠 스(Ast)와 에리 게론 브레비스카푸 스(Eri) 주사제의 최적 조합을 선정하고, PC12 세포에 대한 안전하고 효과적인 농도를 스크리닝한 후 균일한 설계 방법에 따라 조합하였다. 또한, 스크리닝된 성분 조합은 2개의 허브에 10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산을 포함한다. 그런 다음 MTT, Annexin V-FITC / PI, 면역 형광 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 손상된 PC12 세포에서 제제 조합 및 성분 조합의 효능 및 메커니즘을 평가했습니다. 그 결과 세포 생존 촉진을 위한 최적의 제제 조합은 6:1.8(μM) 농도의 Ast 주사와 Eri 캡슐이었습니다. 성분 조합(10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산)이 제제 조합보다 더 효과적이었습니다. 두 조합 모두 세포 사멸 속도, 카스파제 -3의 형광 강도 및 세포 내 활성 산소 종 (ROS) 수준을 현저하게 감소시켰다. 한편, 그들은 p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax 및 Nrf2의 발현 수준을 상향 조절했다. 이러한 효과는 성분 조합에서 더 분명했습니다. 결론적으로, 두 조합 모두 PC12 세포 상의 무포도당 배지와 결합된CoCl2 에 의해 유도된 손상을 억제할 수 있고, 따라서 세포 생존을 촉진할 수 있다. 그러나, 제제 조합에 비해 성분 조합의 효율은 산화 스트레스 및 세포 사멸과 관련된 PI3K / Akt / Nrf2 신호 전달 경로의 더 강한 조절 때문일 수있다.

Ast 주사와 Eri 캡슐의 최적 조합의 스크리닝은 그림 1에 나와 있습니다. 정상 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 세포 생존율은 도 1A에 나타내었다. 세포 생존율은 12 μM 이상의 농도에서 Ast 주사 (그림 1A) 및 5 μM 이상의 농도에서 Eri 캡슐 (그림 1A)에서 95 %보다 낮았으며, 이는 최대 무독성 농도가 각각 12 μM 및 5 μM임을 나타냅니다. 그들의 세포 독성은 단독으로 사용 된 아스트라갈로 사이드 A와 스쿠 텔라 린보다 컸다. CoCl2에 의해 유도 된 손상된 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 생존율은 그림 1B, C에 나와 있습니다. 모델 그룹과 ...

이 프로토콜은 손상된 PC12 세포를 치료하기 위해 두 허브의 조합 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 중국 전통 의학(TCM)의 최상의 적용 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다.

손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략 탐색

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

이 연구의 프로토콜은 저산소증으로 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 허브의 조합 전략과 허브의 최상의 조합 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다. 이 기술은 저산소 세포에 대해 허브로부터 효과적인 성분 조합을 스크리닝하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 시험관 내 실험 방법을 제공할 수 있습니다. 이 전략은 또한 다른 허브 제제 조합으로부터의 저산소 세포에 대한 성분 조합을 스크리닝하고 그들의 보호 메커니즘을 설명하기 위해 적용될 수 있다.시작하려면 5%이산화탄소가 보충된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2-3일마다 PC12 세포를 계대 배양하여 모든 후속 실험에 대해 4 내지 8의 계대 배양을 얻습니다. 70 내지 80%의 융합성 PC12 세포를 0.25%트립신 1밀리리터로 처리하고, 세포 박리를 현미경으로 관찰한다. 그런 다음 3 밀리리터의 완전한 배지를 추가하여 트립신 소화를 중지하십시오.15밀리리터 원심분리 튜브에서 840 x g로 5분 동안 전사된 세포를 회전시킵니다. 상청액을 버린 후 세포 펠릿을 전체 배지로 재현탁하고 세포 현탁액을 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 계수하려면 유세포 분석 소프트웨어를 시작하고 계수 설정에서 세포 용액의 해당 희석 배수를 선택하십시오.클릭 밀도 차트 셀 샘플을 로드한 후. 셀 모집단을 x축과 y축에서 멀리 원을 그립니다. 그림 아래의 데이터 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 X, Y, 개수 및 복근을 선택합니다.개수를 매기면 Abs.Count의 데이터 테이블에서 셀 계수 결과를 얻을 수 있습니다. 완전한 배지로 밀리리터당 5번째 세포에 약 10배 10배로 세포 농도를 조정한 후 웰당 세포 현탁액 100마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 상청액 폐기 플레이트에 각 웰에 밀리리터 MTT 용액 당 1 밀리그램의 120 마이크로 리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 4 시간 동안 배양한다.배양 후 상청액이 폐기되면 각 웰에 150마이크로리터의 DMSO를 추가합니다. 분당 240 회의 속도로 10 분 동안 와류 발진기에서 플레이트를 흔들어 두십시오. 그 다음 마이크로플레이트 리더에서 490 나노미터에서 흡광도를 측정한다.균질한 설계 방법에 의해 약물의 최적 조합을 스크리닝하기 위해, 앞서 입증된 바와 같이 세포를 배양하고, 손상된 PC12 세포를 6개의 상이한 비율 농도의 황기 주사 및 브레비스카푸스 캡슐로 처리한다. 두 가지 최적의 조합의 보호 효과를 평가하려면 손상된 PC12 세포를 두 가지 유형의 약물 조합으로 치료하십시오. 세포를 24시간 동안 배양하고 앞에서 입증된 바와 같이 세포 생존율을 계산한다.PC12 세포를 12웰 플레이트에 시드하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 약물 처리 후 세포를 웰당 250마이크로리터의 트립신으로 처리하고 실온에서 5분 동안 840 x g으로 세포를 원심분리합니다. 이어서, 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 결합 완충액으로 재현탁시킨다.각 그룹마다 5 마이크로 리터의 Annexin V-FITC와 10 마이크로 리터의 요오드화 프로피듐을 삼중 물로 첨가하고 실온에서 15 분 동안 암실에서 세포를 배양하여 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸을 확인합니다. 유세포분석기 소프트웨어의 시작 메뉴에서 자동 보정을 클릭하고 선택 채널에서 FITC, PE, PerCP 및 APC를 선택한 다음 높이 보정을 선택합니다. 그런 다음 통계 항목:중앙값에서 확인을 클릭합니다.밀도 맵을 클릭하고 앞에서 설명한 세포 계수 방법으로 유효 세포 집단에 동그라미를 칩니다. FITC 형광을 x축 파라미터로 사용하고 다른 형광을 y축 파라미터로 사용하여 밀도 맵을 생성합니다. 시작 메뉴에서 보상 매트릭스를 클릭하고 오버플로 매트릭스에서 계수를 클릭합니다.PC12 세포를 24웰 플레이트 웰에 놓인 커버슬립에 삼중으로 시드하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 약물 치료 후 커버 슬립을 PBS로 각각 5 분 동안 두 번 헹구고 4 % 파라 포름 알데히드로 15 분 동안 고정하고 실온에서 0.5 % Triton X-100으로 20 분 동안 투과시킵니다. 세포를 헹군 후 실온에서 1시간 동안 10%염소 혈청으로 차단합니다.희석된 1차 항체 카스파제-3 200마이크로리터를 각 커버슬립에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, TBST 완충액으로 각각 3분 동안 3회 세척하고, 200 마이크로리터의 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 커버슬립을 DAPI의 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 300 마이크로리터로 10분 동안 배양하고, 세포를 TBST로 각각 5분 동안 3회 세척한다.형광 현미경으로 커버슬립 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어로 형광 강도를 통계적으로 분석합니다. 약물-처리된 PC12 세포 커버슬립을 PBS로 각각 3분 동안 3회 세척하고, 섭씨 37도에서 400 마이크로리터의 10 마이크로몰 디클로로디클로로하이드로플루오레세인 디아세테이트와 함께 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 무혈청 DMEM으로 각각 3분 동안 두 번 다시 세척합니다.형광 소광제를 추가하고 형광 현미경으로 커버슬립 이미지를 즉시 캡처하여 이미징 소프트웨어로 상대 형광 강도를 계산합니다. 약물 처리된 PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 PBS로 3회 각각 5분 동안 세척하고, 준비된 웰당 100 마이크로리터의 용해 완충액에서 30분 동안 얼음 상에서 배양한다. 용해 후, 세포를 섭씨 4도에서 20 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리하여 상청액을 수집한다.Bradford 분석으로 단백질 농도를 검출한 후 각 레인에서 25마이크로그램의 단백질로 12%SDS-PAGE 전기영동을 실행하고 겔을 PVDF 막으로 옮깁니다. 실온에서 1.5 시간 동안 5 % 무 지방 우유로 막을 막고 섭씨 4도에서 24 시간 동안 상응하는 1 차 항체 5 밀리리터와 함께 배양한다. 배양 및 TBST로 막을 각각 10분 동안 3회 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 5밀리리터의 2차 HRP-접합 항체와 함께 배양한다.마지막으로, TBST 세척 멤브레인에 제조업체의 지침에 따라 단백질 밴드 검출을 위한 화학발광 HRP 기질을 추가합니다. 그런 다음 화학 발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처하여 베타 액틴을 내부 대조군으로 사용하여 단백질의 회색 값을 정량화합니다. 정상 PC12 세포의 세포 생존율은 12 마이크로 몰 이상의 농도에서 황기 주사로 95 %보다 낮았고 breviscapus 캡슐의 경우 5 마이크로 몰 이상이었습니다.황기 주사는 2 내지 5 마이크로몰에서 6 내지 12 마이크로몰 및 브레비스카푸스 캡슐의 농도 범위에서 손상된 PC12 세포의 생존율을 향상시킬 수 있었다. 반면 6 내지 1.8 마이크로몰의 비율로 약물 조합은 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다. 손상된 PC12 세포에 대한 두 조합의 세포 생존율은 상당히 촉진되었고, 성분 조합은 제제 조합보다 우수했습니다.아폽토시스 비율은 초기, 후기 및 총 세포사멸 세포의 백분율이 정상 그룹에서보다 모델 그룹에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었다. 모델 그룹과 비교하여, 각 단계에서의 세포 사멸 세포의 비율은 치료 그룹에서 유의하게 낮았다. caspase-3의 형광 강도는 모델 그룹에 비해 각 처리군에서 유의하게 낮았으며, 성분 조합 군에서 상대적으로 낮았다.Akt, Bcl-2 및 Bax 유전자의 상대적 발현은 성분 조합이 세포 생존을 촉진하는데 있어서 제제 조합보다 우수하다는 것을 밝혀냈으며, 이는 더 강한 항세포사멸 효과와 관련이 있다. 성분 조합은 제제 조합의 것보다 더 우수한 항산화 손상 효과를 나타내었고, Nrf2 단백질의 발현이 상당히 높았다. 이 방법은 항염증제, 항균제 등과 같은 허브 조합으로부터의 다른 잠재적인 약리학적 활성과 성분 조합을 선별하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

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Medicine

의학

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