Name: 체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 학습하세요 히알루로난이 풍부한 세포외 기질에서 신경 능선 세포의 이동과 부착을 분석하는 체외 이동 분석법을 통해 발달 생물학적 메커니즘과 약물 스크리닝 응용 가능성을 탐구하는 방법을.

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이 방법을 수립하는 데 격려와 친절한 제안을 해주신 이리에 후미토시와 야마구치 유에게 큰 감사를 표합니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (#19KK0232에서 TI까지, #20H03896에서 TI까지)의 과학 연구 프로그램에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 유리 기판에 HA를 코팅하고 기판에 대한 현장 HA 분해 분석을 위한 원래 방법은 Yamamoto et al. (2017)8, HA/Col1 혼합 기판의 제조 방법은 Irie et al. (2021)7.

모든 시술은 오사카 대학 치과 대학원 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 마우스 두개골 신경 능선 세포의 배양
참고: 이 연구에 사용된 신경 능선 세포주는 원래 Wnt1-Cre에서 파생된 O9-1 세포로 구성됩니다. E8.5 마우스 배아에서 분리된 R26R-GFP 발현 세포12 (논의 참조). O9-1 세포를 배양하기 위해 여기에 설명된 방법은 이전에 확립된 프로토콜13을 따른다.
<ol><li>기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비합니다.<ol><li>기저막 매트릭스( 재료 표 참조)를 얼음 위에서 해동합니다. 식힌 1x PBS에 매트릭스 1:50을 희석하고 얼음에 보관하십시오.</li>
		<li>10cm 배양 플레이트에 희석된 기저막 매트릭스 용액 10mL를 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하고 사용하기 전에 매트릭스를 흡인합니다.</li>
		<li>플레이트를 2mL의 PBS로 3배 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>O9-1 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 배양한다.<ol><li>완전한 배아 줄기 (ES) 세포 배지 ( 재료 표 참조)를 37°C의 수조에서 따뜻하게 한다.</li>
		<li>O9-1 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고(재료 표 참조) 자동 세포 계수기(재료 표 참조)를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 완전한 ES 세포 배지를 사용하여 세포 농도를 1.1 × 106/mL로 조정합니다.</li>
		<li>매트릭스 코팅된 10cm 배양 플레이트에 미리 예열된 완전 ES 세포 배지 8mL를 추가하고 O9-1 세포를 1.1 x 106 세포/플레이트에 시드합니다. 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>다음날, 배지를 새로운 완전 ES 세포 배지로 교체한다(37°C로 예열됨). 그 후 2-3일마다 새 배지로 교체하십시오. 주: 세포가 대략 80% confluent일 때 (도금 후에 3-4 일), 그들은 0.25% 트립신 EDTA로 분리되고 더 계대하거나 나중에 사용하기 위해 얼어붙을 수 있습니다. O9-1 세포의 대표 이미지는 그림 1에 나와 있습니다.</li>
		<li>트립신 처리 전에 2mL의 1x PBS로 배양 플레이트를 세척합니다. 예열된 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 완전한 셀 분리를 확인하십시오. 필요한 경우 접시의 측면을 몇 번 가볍게 두드리십시오.</li>
		<li>예열된 완전 ES 세포 배지 2mL를 배양 플레이트에 넣고 해리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리십시오. 그런 다음 예열된 완전 ES 세포 배지 2mL를 튜브에 넣고 피펫팅으로 세포를 완전히 재현탁합니다. 원하는 세포 밀도로 새로운 배양 접시에 세포를 시드합니다.</li>
		<li>대안적으로, 완전한 ES 세포 배지 대신 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 세포 동결 배지 1mL를 튜브에 첨가하고 세포를 완전히 재현탁하여 냉동 세포 스톡을 준비합니다. 세포 현탁액을 극저온 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HA/Col1 코팅 접시의 제조
참고: 유리 바닥 접시에 HA/Col1을 코팅하는 원래 방법은 Irie et al.7에 의해 제안되었습니다.
<ol><li>희석되지 않은 트리에톡시실란 50μL를 3.5cm 유리 바닥 접시에 조심스럽게 추가합니다( 재료 표 참조). 실온(RT)에서 5분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 참고: 트리에톡시실란을 사용한 배양은 5분을 초과해서는 안 됩니다. 이는 코팅 효율에 영향을 미치고 바람직하지 않은 제품을 생성할 수 있습니다.</li>
	<li>접시를 증류수 2mL로 빠르게 3배 씻습니다. 접시당 PBS에 100배 희석한 0.25% 글루타르알데히드 50μL를 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 2mL로 빠르게 4배 세척합니다. 그런 다음 RT에서 0.2N 아세트산에 300μL의 콜라겐 유형 I로 접시를 1시간 동안 코팅합니다.</li>
	<li>PBS 2mL로 빠르게 3번 세척합니다. 300μL의 200μg/mL 플루오레세이나민 표지 히알루론산나트륨-H2(FAHA-H2)(PBS로 희석)를 각 접시에 넣고 RT에서 밤새 배양합니다. PBS를 흡인 한 후 깨끗한 벤치에서 플레이트를 5 분 동안 자연 건조시킵니다. 참고: FAHA-H2는 평균 분자량이 1,200-1,600KDa인 플루오레세인아민 표지 히알루론산 나트륨입니다. 연구 설계에 따라 적절한 분자량의 HA를 사용할 수 있다.</li>
</ol>3. HA/Col1 코팅 접시의 마이그레이션 분석
참고: Col1/HA 기질에서 정의된 500μm 무세포 간격을 사용하는 상처 봉합 기반 분석은 2웰 배양 삽입물을 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조). O9-1 세포는 세포외 공간9 에서 HA의 부착 및 분해에 필요한 Tmem2를 발현합니다(그림 2 및 그림 3).
<ol><li>코팅된 유리 바닥 접시를 건조시킨 후 2-웰 배양 삽입물을 접시에 부착하고 삽입물을 PBS 1mL로 외부에 채웁니다.</li>
	<li>삽입물당 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM) 100μL의 1 x 104 세포로 웰에 O9-1 세포를 시딩합니다. 세포를 5%CO2 가습 배양기에서 37°C에서 2일 동안 배양하였다.</li>
	<li>핀셋으로 코팅된 유리 바닥 접시에서 인서트를 조심스럽게 제거합니다. 코팅된 유리 바닥 접시를 2mL의 1x PBS로 부드럽게 세척하여 세포와 세포 파편을 제거합니다. 2% FBS를 함유한 신선한 DMEM 2mL를 배양 접시에 추가합니다.</li>
	<li>이제 고해상도 설정(6dB에서 게인, 비닝 없음)의 흑백 모드에서 올인원 형광 현미경을 사용하여 시작 시점으로 위상차 이미지를 캡처합니다. 4x에서 20x의 배율을 가진 대물 렌즈가 이 연구에서 이미징에 사용되었습니다( 재료 표 참조). 참고: 해당 축척 막대로 위상차 이미지를 캡처하고 TIFF 형식으로 저장합니다.</li>
	<li>세포를 37°C 및 5%CO2에서 추가의 48시간 동안 배양한다. 올인원 형광 현미경을 사용하여 배양 24시간 및 48시간에 위상차 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL로 48시간에 세포를 고정합니다. 그런 다음 신선한 PBS 1mL로 각각 5분 동안 접시를 3번 세척합니다.</li>
	<li>추가 형태학적 관찰을 위해 장착 매체가 있는 커버슬립( 재료 표 참조)을 놓습니다. 참고: 접시는 즉시 이미지화하거나 4°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>선택 사항: 관심 단백질에 대해 세포에 면역 표지를 합니다. 참고: 마우스 유래 단클론 항-빈쿨린 항체( 재료 표 참조)를 사용하여 국소 접착(FA) 복합체를 검출하는 프로토콜이 여기에 예로 설명되어 있습니다.<ol><li>접시(단계 3.6부터)를 0.5mL의 블로킹 완충액(PBS 중 5% 정상 염소 혈청)과 함께 60분 동안 배양합니다. 참고: 1차 항체에 적합한 차단 버퍼를 선택하십시오. 전형적인 차단 완충액은 사용된 2차 항체와 동일한 종으로부터의 5% 정상 혈청일 것이다.</li>
		<li>항체 희석 완충액(PBS 중 1% 정상 염소 혈청)에 희석된 1차 항체를 준비합니다. 희석된 1차 항체 0.5mL와 함께 접시를 4°C에서 밤새 배양합니다. 참고: 적절한 항체 희석 완충액을 선택하십시오. 전형적으로, 항체는 1:50-1:200 희석으로 사용된다.</li>
		<li>PBS 2mL로 각각 5분 동안 3회 헹굽니다. 염소 유래 항-마우스 2차 항체를 항체 희석 완충액(PBS 중 1% 정상 염소 혈청)에 희석하여 준비한다. 희석된 2차 항체 0.5mL와 함께 실온에서 1-3시간 동안 접시를 배양합니다. 참고: 일반적으로 2차 항체는 1:500-1:1,000 희석으로 사용됩니다. DAPI는 핵을 염색하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>매번 5분 동안 2mL의 PBS로 3번 헹굽니다. 50μL의 장착 매체가 있는 커버슬립을 놓습니다. 참고: 접시는 GFP 필터(여기: 470/40, 방출: 525/50) 및 TexasRed 필터(여기: 560/40, 방출: 630/75)가 있는 올인원 형광 현미경을 사용하여 고해상도 설정(6dB에서 게인, 비닝 없음)이 있는 흑백 모드에서 이미지화할 수 있습니다. 4x에서 20x의 배율을 가진 대물 렌즈가 이 연구의 이미징에 사용되었습니다. 알림: 슬라이드는 2°C에서 최대 4개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>ImageJ 1.51s 소프트웨어를 엽니다. ImageJ 창의 메뉴 모음에서 파일 > 열기를 선택하여 저장된 이미지 파일을 엽니다.</li>
	<li>측정 축척을 설정하려면 축척 막대와 같은 거리의 선을 그립니다. 축척 설정 > 분석 으로 이동하여 축척 설정 창의 해당 상자에 선의 알려진 거리와 단위를 입력합니다.</li>
	<li>셀 간격 사이에 직선을 그리고 분석 > 측정값 을 눌러 값을 데이터 창으로 전송합니다. 각 표본에서 최소 5개의 서로 다른 위치를 측정하고 거리의 평균을 구하여 대표 표본 데이터를 얻습니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.

다양한 ECM 구성 요소가 NCC 마이그레이션/마이그레이션을 규제합니다. 예를 들어, HA는 NCC 마이그레이션 2,15를 긍정적으로 규제합니다. 흥미롭게도, 세포 표면 히알루로니다아제인 Tmem2의 유전자 마우스 모델을 기반으로 한 연구는 NCC 이동에서 HA 분해의 필요성을 설명했다9. 콜라겐은 또한 신경관을 둘러싸고 있는 ECM에 풍부하다(16). 류신이 풍부한 작은 프로테오글리칸인 데코린(Decorin)은 신경 발달 과정에서 NCC 이동을 조절하는 것으로 나타났다17. 라미닌(laminin)과 피브로넥틴(fibronectin)을 포함한 다른 ECM 성분은 NCC 접착 및 이동에 영향을 미친다18. 그러나 NCC 마이그레이션에서 ECM 구성 요소의 특...

신경 능선 세포(NCC)는 발달 중인 배아에 존재하는 다능성 세포 집단이며 신경 형성 동안 신경판 경계에서 유래합니다. 그들은 말초 신경계, 심혈관계, 두개 안면 조직 및 골격을 포함한 다양한 조직의 형성에 기여합니다1. 신경판 경계에서 유도 및 NCC 사양 후, NCC는 신경 상피에서 이동하여 NCC 유래 조직 부위로 이동합니다1.
히알루론산(HA)은 세포외 기질(ECM)의 구성 요소로서 다양한 조직에 분포하는 비황산화 글리코사미노글리칸입니다. 배아 발달에서 HA의 중요성은 히알루론산 대사를 담당하는 유전자의 절제를 통해 모델 시스템에서 입증되었습니다. 예를 들어, 제노푸스(Xenopus)의 히알루론산 합성효소 유전자(Has1 및 Has2)의 돌연변이는 NCC 이동 결함과 두개안면 기형을 유발하는 것으로 밝혀졌다2. 또한, HA 결합 프로테오글리칸인 아그레칸(aggrecan)과 베르시칸(versican)은 NCC 이동에 대한 억제 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다3. 마우스에서 Has2 절제는 심내막 쿠션 형성에 심각한 결함을 일으켜 임신 중기(E9.5-10) 치사율을 초래합니다 4,5,6.
세포 표면 히알루로니다아제인 막횡단 단백질 2(Tmem2)는 부착 부위 7,8에서 매트릭스 관련 HA를 제거하여 인테그린 매개 암세포 부착 및 이동을 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 최근 입증되었습니다. 보다 최근에, Inubushi et al.9는 Tmem2의 결핍이 NCC 이주/이주 및 생존의 이상으로 인해 심각한 두개안면 결함을 유발한다는 것을 입증했습니다. 이전 연구9에서, Tmem2 발현은 NCC 형성 및 이동 동안 분석되었다. Tmem2 발현은 NCC 박리 부위 및 이주하는 Sox9 양성 NCC에서 관찰되었습니다(그림 1). 또한, Tmem2가 고갈된 마우스 O9-1 신경 능선 세포를 사용하여 연구에서는 Tmem2의 시험관 내 발현이 O9-1 세포가 국소 유착을 형성하고 HA 함유 기질로 이동하는 데 필수적임을 입증했습니다(그림 2 및 그림 3)9.
이러한 결과는 Tmem2가 HA가 풍부한 ECM을 통한 NCC 접착 및 이동에도 중요하다는 것을 강력하게 나타냅니다. 그러나 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동의 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 따라서 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동을 완전히 탐색하기 위해 체외 배양 실험 시스템을 구축할 필요가 있습니다.
세포 이동을 검사하는 데 사용되는 수많은 접근법 중에서, 세포 상처 봉합 기반 분석법은 생리학 및 종양학 분야에서 자주 사용되는 간단한 방법이다10. 이 접근법은 생체 내 표현형과의 관련성으로 인해 유용하며 세포 이동 동안 약물 및 화학 유인 물질의 역할을 결정하는 데 효과적이다11. 시간 경과에 따른 세포 갭 거리를 측정함으로써 전체 세포 질량과 개별 세포 모두의 이동 능력을 평가할 수 있다11. 이 원고에서는 신경관을 둘러싼 HA가 풍부한 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 수정된 시험관 내 상처 봉합 기반 분석이 도입되었습니다. 이 절차는 NCC 이동에서 ECM 스캐폴드의 역할을 분석하기 위해 다양한 ECM 구성 요소(즉, 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌)를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. 아니요. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2웰 배양 인서트</td><td>ibidi</td><td>Cat. No. 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 라벨이 붙은 염소 안티-마우스 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>염소 유래 항-마우스 2차 항체</td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. 아니요. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>세포 동결 매체</td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td>시그마</td><td>Cat. 제 08-115</td><td></td></tr><tr><td>완전 ES 셀 매체</td><td>Millipore</td><td>Cat. 아니요. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Keyence</td><td>Cat. 아니요. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>형광 라벨 HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르데히드</td><td>시그마</td><td>Cat. 번호 G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. 아니요. CB-40234</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>단클론 항빈쿨린 항체</td><td>Sigma</td><td>Cat. 아니요. V9264</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 cells</td><td>Millipore</td><td>Cat. 아니요. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>트리에톡시실란</td><td>시그마</td><td>Cat. No. 390143</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>밀리포어</td><td>고양이. 아니요. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

신경능선세포(NCC)는 신경관의 등쪽 영역에서 유래하는 이동성이 높은 세포입니다. 신경관에서 NCC를 이동하는 것은 NCC 생산 및 표적 부위로의 후속 이동을 위한 필수 과정입니다. 주변 신경관 조직을 포함한 NCC의 이동 경로에는 히알루론산(HA)이 풍부한 세포외 기질이 포함됩니다. 신경관에서 이러한 HA가 풍부한 주변 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 HA(평균 분자량: 1,200-1,400kDa)와 콜라겐 유형 I(Col1)로 구성된 혼합 기질 이동 분석이 이 연구에서 확립되었습니다. 이 이동 분석은 NCC 세포주인 O9-1 세포가 혼합 기질에서 고도로 이동하며 HA 코팅이 이동 과정에서 국소 접착 부위에서 분해됨을 보여줍니다. 이 시험관 내 모델은 NCC 마이그레이션과 관련된 기계적 기반에 대한 추가 탐색에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 NCC 이동을 연구하기 위해 스캐폴드로 다양한 기질을 평가하는 데에도 적용할 수 있습니다.

여기에 기술된 프로토콜을 사용하여 Col1 및 고분자량 HA(평균 분자량: 1,200-1,400 kDa)로 구성된 혼합 기질 상에서 이동 분석을 수행하였다. 갭의 경계에 있는 O9-1 세포는 HA가 풍부한 갭으로 쉽게 이동하는 것으로 나타났습니다(그림 4). FA 마커인 빈쿨린14에 대한 면역염색을 통해 O9-1 세포가 HA 분해 부위에서 국소 유착(FA)을 형성했음을 확인했습니다(그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64749/64749fig01.jpg"> 그림 1: NCC에서의 TMEM2 발현.</st...

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

히알루론산은 동물 모델에서 가장 풍부한 세포외 기질 중 하나입니다. 배아 발달에서 히알루론산의 중요성이 입증되었습니다. 이 시험관 내 모델은 신경 능선 세포가 히알루론산이 풍부한 세포외 기질 내에서 어떻게 부착되고 이동하는지 탐색하는 데 유용합니다.우리의 기술을 통해 우리는 시간이 지남에 따라 도매 개체군과 개별 세포의 이동 및 HA 분해 능력을 평가할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 HA 분해를 가속화하거나 방지하는 화합물을 찾기 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 시작하려면 기저막 매트릭스를 식힌 PBS로 1:50 비율로 희석하고 얼음 위에 보관하십시오.희석된 매트릭스 용액 10밀리리터로 10cm 배양 플레이트를 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2 밀리리터의 PBS로 플레이트를 3 번 세척하십시오. 매트릭스 코팅된 플라템에서 O9-1 세포를 배양하기 위해 완전한 배아 줄기 또는 ES 세포 배지를 섭씨 37도의 수조에서 따뜻하게 합니다.O9-1 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 완전한 ES 세포 배지를 사용하여 세포 농도를 밀리리터당 110만 개로 조정합니다. 매트릭스 코팅된 10cm 배양 플레이트에 8밀리리터의 예열된 완전한 ES 세포 배지를 추가하고 플레이트당 110만 개의 세포로 O9-1 세포를 시딩합니다.섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 다음날, 배지를 섭씨 37도로 예열된 신선하고 완전한 ES 세포 배지로 교체합니다. 그 후 2-3일마다 새로운 배지로 교체하십시오.PBS의 2 밀리리터와 배양 플레이트를 세척하고 그리고 나서 예열 된 0.25 % 트립신 EDTA의 2 밀리리터를 추가한다. 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 예열된 완전 ES 세포 배지 2밀리리터를 배양 플레이트에 넣고 해리된 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.튜브를 300g에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다. 2밀리리터의 예열된 완전한 ES 세포 배지를 튜브에 넣고 피펫팅으로 세포를 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 원하는 세포 밀도로 새 배양 접시에 세포를 시드합니다.희석되지 않은 트리에톡시실란 50마이크로리터를 3.5cm 유리 바닥 접시에 조심스럽게 넣고 빛으로부터 보호되는 실온에서 5분 동안 배양합니다. 2 밀리리터의 증류수로 접시를 3 번 씻고 접시 당 PBS에서 100 배 희석 한 0.25 % 글루 타르 알데히드 50 마이크로 리터를 첨가하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양 한 후 2 밀리리터의 PBS로 4 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 0.2 노멀 아세트산에 300 마이크로 리터의 콜라겐 유형 1로 접시를 코팅합니다.다시 2 밀리리터의 PBS로 3 번 씻으십시오. 각 접시에 히알루론산 나트륨 H2로 표시된 밀리리터당 200마이크로그램의 플루오레세인아민 300마이크로리터를 넣고 실온에서 밤새 배양합니다. PBS 2 밀리리터로 다시 세 번 씻으십시오.코팅된 유리 바닥 접시를 건조시킨 후, 두 개의 웰 배양 삽입물을 접시에 부착하고 1밀리리터의 PBS로 삽입물을 외부에 채웁니다. O9-1 세포를 삽입당 2% 태아 소 혈청 또는 FBS를 포함하는 100마이크로리터의 DMEM에 있는 10, 000개의 세포에 있는 웰에 시드한다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 이틀 동안 세포를 배양하고, 올인원 형광 현미경을 사용하여 위상차 이미지를 시작 시점으로 캡처합니다.핀셋으로 코팅된 유리 바닥 접시에서 삽입물을 조심스럽게 제거하고 코팅된 유리 바닥 접시를 2밀리리터의 PBS로 부드럽게 세척하여 세포와 세포 파편을 제거합니다. 2%FBS를 함유한 신선한 DMEM 2밀리리터를 배양 접시에 넣습니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 추가로 48시간 동안 세포를 배양하고 배양 24시간 및 48시간 후 위상차 이미지를 캡처합니다.PBS로 접시를 씻고 48 시간 후에 4 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터로 실온에서 15 분 또는 섭씨 4도에서 밤새 세포를 고정시킨다. 그런 다음 1 밀리리터의 신선한 PBS로 5 분 동안 접시를 세 번 씻으십시오. 마지막으로 추가 형태학적 관찰을 위해 장착 매체와 함께 커버 슬립을 놓습니다.E9.0에서 Tmem2 플래그 배아의 신경관의 횡단면이 이 그림에 나와 있습니다. 신경관의 두개골 및 몸통 수준의 섹션은 Tmem2 플래그 단백질과 히알루로난에 대해 이중 라벨이 붙었습니다. Tmem2 발현은 신경판과 신경관의 경계 영역에서 관찰된 반면, 이들 부위에는 히알루론산 염색이 없었습니다.Tmem2 플래그 및 Sox9에 대한 신경 능선 세포의 이중 라벨링이 여기에 표시됩니다. E9.0 신경관의 횡단면을 Tmem2 플래그 및 Sox9에 대해 염색하였다. 일반 배양 접시에서 배양된 Tmem2 고갈 및 대조군 O9-1 세포의 대표 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.이들 세포에서 Tmem2의 발현을 정상화를 위한 내부 대조군으로서 GAPDH를 사용한 qPCR에 의해 평가하였다. Tmem2가 고갈되고 대조군 O9-1 세포는 형광 히알루로난으로 코팅된 유리 커버 슬립 상에서 48시간 동안 배양되었습니다. 히알루론산 분해 활성은 형광 배경의 어두운 영역으로 드러납니다.히알루론산 분해 수준은 또한 Tmem2 고갈 세포와 대조군 O9-1 세포 사이에서 정량적으로 비교되었습니다. O9-1 세포의 국소 접착에서 기질 결합 히알루론산의 분해가 이 그림에 나와 있습니다. Col1/HA로 구성된 혼합 기질에서 배양된 O9-1 세포는 항-빈쿨린 항체로 면역 표지되었습니다.어두운 반점 또는 줄무늬는 FAHA H2 기질에서 히알루론산 분해 활성을 나타냅니다. 히알루론산 분해 부위와 국소 접착 부위는 혼합 기질에 공동 국소화되었습니다. 유리 바닥 접시에 HA를 코팅하는 것은 프로토콜에서 중요한 단계인데, 부적절한 코팅으로 인해 접착 및 이동 중에 기계적 힘에 의해 HA가 쉽게 제거될 수 있기 때문입니다.적절한 코팅을 보장하기 위해 글루타르알데히드, 알데히드에 대한 무장 결합을 통해 유리에 화학적으로 고정된 1형 콜라겐을 사용합니다. 1형 콜라겐 외에 세포외 기질 기질을 사용하는 것이 가능하지만, 무장기가 있어야 하며, 화학적 특성으로 인해 유리 바닥 접시에 코팅하는 데 한계가 있을 수 있습니다. 따라서 최상의 접근 방식을 결정하기 위해 시행 착오가 필요할 수 있습니다.이 실험실 실험은 신경능선 세포가 신경관 주변의 HA 또는 HA 환경으로 이동하는 동안 특정 분자가 어떻게 작동하는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 이러한 이동 과정을 가속화하거나 예방할 수 있는 약물을 테스트하는 유용한 방법이 될 수 있습니다. Tmem2가 HA에 대한 접착력과 HA의 분해 기능을 모두 갖는 이유와 HA가 전체 응집 부위에서 분해되어야 하는 이유를 아는 것은 흥미로울 것입니다.HA는 세포외 기질에서 가장 흔한 물질이기 때문에 이 질문에 대한 답을 찾는 것은 생물학과 의학에서 정말 중요합니다. 이 실험 프로토콜은 피부 섬유아세포, 상피 세포 및 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에 적용할 수 있기 때문에 가치가 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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