Name: 열 블록을 사용한 동물성 플랑크톤에 대한 열 한계 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 열 블록을 활용한 해양 무척추동물 유생의 열 한계 측정 방법을. 모래달러 유생의 생존율을 19~37°C 범위에서 분석하여 기후 변화에 따른 종 취약성을 평가할 수 있습니다.

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이 연구는 Swarthmore College [KC]의 교수 연구 기금과 BJ를위한 Robert Reynolds and Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship의 지원을 받고 있습니다.

1. 히트 블록의 제작
<ol><li>120V, 100W 스트립 히터를 가변 저항기에 배선하십시오( 재료 표 참조).</li>
	<li>6 x 10 그리드에 60개의 구멍을 뚫어 20.3cm x 15.2cm x 5cm(8인치 x 5인치 x 2인치) 알루미늄 블록을 준비합니다( 재료 표 참조). 구멍이 양방향으로 중앙에서 중앙으로 2cm 간격으로 있는지 확인하십시오. 각각의 직경은 1.1cm, 깊이는 4.2cm여야 합니다(그림 1). 알림: 밀링 머신에서 드릴링을 수행하거나 고속 강철 드릴 비트로 드릴 프레스를 사용하십시오. 발열체 및 냉각 소자는 모두 가능한 한 15.2 cm x 5 cm 표면의 접촉면을 많이 덮도록 선택되었다.</li>
	<li>온도 컨트롤러 프로브의 크기와 일치하도록 1번째와 2번째 열과 9번째와 10번째 열 사이의 20.3cm x 5cm 표면 중 하나에 두 개의 추가 구멍을 뚫습니다(재료 표 참조).</li>
	<li>1.2cm(0.5인치) 투명 아크릴 시트( 재료 표 참조)로 케이스를 구성하여 요소를 제자리에 고정하고 완성된 열 블록을 단열합니다. 두 겹의 아크릴을 사용하여 발열체의 뒷면을 단열합니다(그림 1).</li>
	<li>최종 어셈블리에서 열 페이스트( 재료 표 참조)를 적용하여 발열체에서 블록으로, 블록에서 냉각 요소로의 열전도율을 최대화합니다.</li>
</ol>2. 열 구배 설정 결정
<ol><li>수조 / 수족관 냉각기를 Tygon 튜브와 연결하십시오 ( 재료 표 참조). 필요에 따라 폼 파이프 단열재로 튜브를 절연하십시오.</li>
	<li>온도 조절기 프로브를 알루미늄 블록 측면의 구멍에 삽입합니다. 프로브 1이 발열체 근처에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>가장자리까지 채워진 미세 원심 분리 튜브 (1.5 mL)에 수돗물을 모든 밀링 된 구멍 (총 60 개 튜브)에 놓습니다.</li>
	<li>온도 컨트롤러를 켜고 프로브 1의 정지 가열 온도를 35-37 °C로, 프로브 2를 21.5-22.5 °C로 설정합니다. 알림: 제안된 온도 조절기에는 독립적으로 작동하는 두 개의 콘센트가 있습니다. 이 특정 사용 사례에서 따뜻한 온도를 조절하는 데 프로브 1만 사용됩니다. 따라서 프로브 2의 온도를 로우 엔드 온도의 온도로 설정하십시오.</li>
	<li>가변 저항기를 돌려 발열체를 켜고 중간으로 설정하십시오.</li>
	<li>수조 / 수족관 냉각기를 켜고 냉각기 온도를 15 ° C로 설정하십시오.</li>
	<li>블록의 한쪽 끝이 따뜻하고 10 분 후에 다른 쪽 끝이 식은지 확인하십시오. 주의 : 발열체의 노출 된 끝은 뜨거울 수 있습니다. 만지지 마십시오.</li>
	<li>이후 10분마다 K형 전극( 재료 표 참조)이 있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인합니다. 온도는 ~ 60 분 후에 안정화되고 선형으로 나타납니다 (그림 2).</li>
	<li>필요에 따라 온도 컨트롤러와 수조의 설정을 변경하여 끝점의 값을 조정합니다.</li>
</ol>3. 열 노출 및 라이브:데드 열거
알림: 온도 구배에 대해 원하는 설정이 결정되면 2단계를 생략할 수 있습니다.
<ol><li>재순환 수조와 히터를 켜고 각각 15 °C 및 37 °C로 설정하여 19.5 °C에서 37 °C까지의 온도 구배를 생성합니다.</li>
	<li>열 구배가 선형이 되도록 하려면 밀링된 모든 구멍(총 60개 튜브)에 수돗물로 가장자리(1.5mL)까지 채워진 미세 원심분리 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>45-60분 동안 기다림으로써 열 블록이 설정 온도에 도달하도록 합니다. K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인하여 예상 온도에 도달했는지 확인합니다. 이 온도에 유의하십시오.</li>
	<li>연구 유기체의 크기가 >500μm이고 한 용기에서 다른 용기(예: 요각류)로 쉽게 옮길 수 있는 경우 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 750μL의 0.45μm 여과된 해수를 채웁니다. 또는 연구 유기체가 작은 경우 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 250μL의 0.45μm 여과된 해수를 채웁니다. 참고: 대표적인 데이터를 위해, 수정 후 2, 4, 6일 후에 사용되는 모래 달러 Dendraster excentrics 의 유충이 사용되었습니다( 재료 표 참조). 이들 개체의 평균 (± S.D., 각 연령에 대해 n = 15) 크기는 각각 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm 및 292 ± 14 μm였습니다. 이러한 유충이 쉽게 농축될 수 있다는 점을 감안할 때(단계 3.5), 미세원심분리 튜브를 750μL의 여과된 해수로 채웠다.</li>
	<li>연구 유기체의 배양물을 역여과(즉, 연구 유기체를 담는 용기에 메쉬를 놓고 메쉬의 상단을 통해 물을 제거)로 농축시켜, 연구 유기체가 비커(11)의 바닥에 남아 있도록 한다. 참고 : 30 μm 나일론 메쉬가 연구 된 유충 모래 달러에 사용되었습니다 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>농축된 동물 샘플을 여과된 해수로 헹굽니다(예: 조류 식품 또는 기타 화학 물질로 배양할 때). 역여과를 한 번 더 반복하여 동물 샘플을 농축시킨다.</li>
	<li>알려진 수의 개별 유기체를 반쯤 채워진 미세 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 해부 현미경 ( 재료 표 참조)으로 작은 플랑크톤 유기체를 세고 유리 파스퇴르 피펫으로 옮깁니다. 참고 : 배치 할 유기체의 수는 크기에 따라 다릅니다. ~ 200 μm 크기의 유충 모래 달러의 경우 미세 원심 분리 튜브 당 20 개체가 적절했습니다. 주의: 유리 피펫은 플라스틱 피펫보다 더 바람직한데, 일부 플랑크톤 유기체는 소수성이고 플라스틱 표면에 달라붙기 때문입니다.</li>
	<li>최종 부피가 0.45mL가 될 때까지 동물이 들어 있는 미세 원심분리 튜브에 1μm 여과된 해수를 추가합니다.</li>
	<li>유기체가 원하는 실험 온도까지 서서히 예열되도록하려면 3.7 단계에서 준비한 동물과 함께 마이크로 원심 분리기 튜브를 콜드 엔드에서 시작하는 열 블록에 넣습니다. 각 줄에 한 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다 (총 12 개의 튜브).</li>
	<li>10분 동안 기다립니다.</li>
	<li>3.9단계에서 삽입된 한 쌍의 미세 원심분리기 튜브를 더 따뜻한 온도의 인접한 천공 구멍으로 이동합니다. 콜드 엔드의 각 행에 추가 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 이제 각 행에 4개의 튜브가 있습니다. 10분 더 기다립니다.</li>
	<li>동물의 위치를 더 차가운 끝에서 따뜻한 끝으로 쌍으로 이동하여 동물과 함께 미세 원심 분리기 튜브를 계속 추가하십시오. 히트 블록이 완전히 채워질 때까지 각 교대 사이에 10분 동안 기다립니다. 참고 : 3.9-3.12 단계는 연구 유기체가 경험하는 온도를 점진적으로 높이기위한 상승 단계로 간주됩니다.</li>
	<li>동물을 지정된 온도에서 2 시간 동안 배양하게하십시오. 이 단계는 실험의 항온 노출 단계입니다.<ol><li>잠복기가 2시간을 초과하는 경우 매시간 열전대가 있는 미세 원심분리기 튜브의 온도를 확인하십시오. 참고: 실험 필요에 따라 배양 시간을 조정하십시오. 배양이 2 시간보다 길면 예기치 않은 장비 고장이 발생할 경우 열전대를 사용하여 일정한 시간 간격으로 튜브의 온도를 확인하십시오. 연구 유기체에 대한 교란을 최소화하려면 온도 모니터링을 위해 여과된 해수로만 채워진 6개 이상의 미세 원심분리기 튜브를 블록에 무작위로 배치합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배양 기간이 끝나면 K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 각 미세 원심분리 튜브 내부의 온도를 측정합니다. 이 온도에 유의하십시오.</li>
	<li>동물이 있는 60개의 미세 원심분리기 튜브를 모두 제거하고 사전 라벨이 부착된 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>튜브를 사육 온도와 같은 미리 결정된 온도에서 회복 기간인 1시간 동안 배양(단계 3.14)합니다. 참고: 회복 기간은 종에 따라 다를 수 있습니다. 유충 모래 달러의 경우, 사육 온도는 18°C였고, 따라서 샘플을 환경 챔버에 넣었다. 관련 문헌을 참조하거나 시험 실험을 수행하여 live:dead 수가 회복 기간의 영향을 받지 않는지 확인하십시오. 대표적인 데이터에서, 1 시간 후에 살아있는 동물의 수는 회복의 12 또는 24 시간 후와 동일했다.</li>
	<li>열 노출 후 살아있는 연구 유기체의 비율을 열거하려면 유리 피펫을 사용하여 개별 미세 원심분리 튜브의 내용물을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 여전히 활동적(생존)하고 수영을 하거나 용해된(죽은) 개체의 상대적인 수를 관찰하고 기록하십시오. 관찰된 총 개체 수가 3.7단계에서 튜브에 배치된 개체 수와 같은지 확인합니다. 숫자가 일치하지 않는 경우 마이크로 원심 분리기 튜브와 페트리 접시의 측면을 확인하십시오.</li>
</ol>4. LT50의 계산
<ol><li>최소한 다음 헤더가 있는 CSV 형식의 데이터 테이블을 생성합니다: 관심 있는 그룹화 변수, 튜브의 온도(°C), 생존한 개체 수 및 사망한 개인 수. 참고: 대표 데이터의 경우 목표가 연령 그룹 간의 비교이므로 관심 있는 그룹화 변수가 연령으로 대체됩니다.</li>
	<li>로지스틱 회귀 분석으로 데이터를 적합하려면 이항 분포가 있는 일반화 선형 모형을 사용하십시오. 보충 코딩 파일 1 은 오픈 소스 소프트웨어 R(22)을 사용하는 예제 샘플 스크립트를 나타낸다.</li>
	<li>중간 열 상한(LT 50)을 결정하려면 개인의50%가 생존한 예측 변수 값(즉, 온도)을 계산합니다. 보충 코딩 파일 2는R22의 MASS23으로부터의 함수 dose.p를 사용하는 예제 스크립트를 나타낸다.</li>
</ol>

<ol><li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+variation%2C+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li>
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<li>Bennett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+critical+thermal+limits+of+life+on+Earth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The evolution of critical thermal limits of life on Earth.</a> Nature Communications. 12 (1), 1198(2021).</li>
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<li>Collin, R., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+urchin+Lytechinus+variegatus+lives+close+to+the+upper+thermal+limit+for+early+development+in+a+tropical+lagoon%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon.</a> Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).</li>
<li>Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+thermal+sensitivities+among+different+life+stages+of+the+pulmonate+limpet+Siphonaria+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica.</a> Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).</li>
<li>Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effects+of+temperature+and+salinity+on+early+life+stages+of+the+sea+urchin+Heliocidaris+crassispina%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina.</a> Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).</li>
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<li>Stillman, J. H., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+the+upper+thermal+tolerance+limits+of+Eastern+Pacific+porcelain+crabs%2C+Genus+Petrolisthes%3A+Influences+of+latitude%2C+vertical+Zonation%2C+acclimation%2C+and+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).</li>
<li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+patterns+of+thermal+tolerance+and+phenotypic+plasticity+with+population+genetics+to+improve+understanding+of+vulnerability+to+warming+in+a+widespread+copepod%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod.</a> Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).</li>
<li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differentiation+underlies+seasonal+variation+in+thermal+tolerance%2C+body+size%2C+and+plasticity+in+a+short-lived+copepod%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod.</a> Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).</li>
<li>Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+potential+for+adaptation+to+climate+change+in+a+broadly+distributed+marine+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).</li>
<li>Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+parental+effects+confers+rapid+larval+thermal+tolerance+in+the+estuarine+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis.</a> Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745(2021).</li>
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<li>Sasaki, M., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+in+copepod+thermal+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Global patterns in copepod thermal tolerance.</a> Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 급성 열 노출을 통해 작은 플랑크톤 유기체의 열 한계를 결정하는 접근 가능하고 사용자 정의 가능한 접근 방식을 제공합니다. 하단의 수조와 상단의 히터에 의해 제어되는 10홀 설계와 유연한 온도 엔드포인트를 통해 LT50을 정밀하게 결정할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용하면 <1°C의 열 한계 차이를 감지할 수 있습니다(그림 3). 이 접근법은 다양한 종에 대한 열 한계 (시간 단위)의 신속한 결정을 제공하며, 결과 값은 여러 종 분포 모델(2,21)에 적용되었습니다. 그러나 급성 노출은 만성 노출 8,26과 비교할 때 다른 열 내성 추정치를 제공 할 가능성이 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
<p class="jove_...

열 내성은 유기체의 생존과 기능의 핵심입니다 1,2. 인위적인 탄소 배출로 인해 지구가 계속 따뜻해짐에 따라 열 한계의 결정 및 적용에 대한 관심이 높아지고 있습니다3. 사망률, 발달 실패 및 이동성 상실과 같은 다양한 종말점이열 상한 및 하한을 결정하는 데 사용되었습니다4. 이러한 열 한계는 종종 유기체의 열 틈새에 대한 대리인으로 간주됩니다. 이 정보는 지구 온난화에 더 취약한 종을 식별하고 미래의 종 분포와 그에 따른 종 상호 작용을 예측하는 데 사용됩니다 3,5,6,7. 그러나 특히 작은 플랑크톤 유기체의 경우 열 한계를 결정하는 것은 어려울 수 있습니다.
플랑크톤 유기체, 특히 해양 무척추 동물의 애벌레 단계의 경우 열 한계는 만성 노출을 통해 결정될 수 있습니다. 만성 노출은 며칠에서 몇 주에 걸쳐 여러 온도에서 유충을 사육하고 유충 생존율 및/또는 발달률이 감소하는 온도를 결정함으로써 달성됩니다 8,9,10. 그러나 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 대규모 인큐베이터와 유충 사육 경험이 필요합니다(해양 무척추 동물 유충 배양에 대한 좋은 소개는 참조11 참조).
또는 열 응력에 대한 급성 노출을 사용하여 열 한계를 결정할 수 있습니다. 종종, 이러한 결정 접근법은 온도 제어 건조 수조(12,13,14)에 유충이 있는 작은 바이알을 배치하거나, PCR 열 순환기(15,16)에서 열 구배 기능을 활용하거나, 바이알이 꼭 맞는 구멍(17)을 갖는 큰 알루미늄 블록의 단부에 가열 및 냉각을 적용하여 생성된 열 구배를 따라 유리 바이알/미세 원심분리 튜브를 배치하는 것을 포함하고, 18,19. 일반적인 건식 수조는 단일 온도를 생성합니다. 따라서 온도 범위에서 성능을 평가하기 위해 여러 장치를 동시에 작동해야 합니다. 열 순환기는 그래디언트를 생성하지만 작은 시료량(120μL)만 수용하므로 신중한 조작이 필요합니다. 열 순환기와 유사하게 대형 알루미늄 블록은 선형적이고 안정적인 온도 구배를 생성합니다. 두 접근법 모두 로지스틱 또는 프로빗 회귀와 결합하여 인구의 50%(LT50)12,20,21에 대한 치사 온도를 계산할 수 있습니다. 그러나 사용 된 알루미늄 블록의 길이는 ~ 100cm였습니다. 이 크기에는 넓은 실험실 공간과 구멍을 뚫기 위한 특수 컴퓨터 수치 제어 밀링 머신에 대한 액세스가 필요합니다. 목표 온도를 유지하기 위해 두 개의 연구 등급 수조를 사용하는 것과 함께 설정 조립에 드는 재정적 비용이 높습니다.
따라서이 작업은 상업적으로 이용 가능한 부품으로 안정적이고 선형적인 온도 구배를 생성하는 대체 수단을 개발하는 것을 목표로합니다. 이러한 제품은 설치 공간이 작아야하며 플랑크톤 유기체에 대한 급성 열 응력 노출 실험에 쉽게 사용할 수 있어야합니다. 이 프로토콜은 크기가 <1mm인 동물성 플랑크톤을 표적 유기체로 사용하여 개발되었으므로 1.5mL 또는 2mL 미세 원심분리 튜브의 사용에 최적화되었습니다. 더 큰 연구 유기체에는 사용되는 1.5mL 미세 원심분리 튜브보다 큰 용기와 알루미늄 블록의 확장된 구멍이 필요합니다.
실험 장치를보다 쉽게 이용할 수있게하는 것 외에도이 작업은 데이터 처리 파이프 라인을 단순화하는 것을 목표로합니다. 상용 통계 소프트웨어는 로지스틱 또는 프로빗 회귀를 사용하여 LT50 을 계산하는 루틴을 제공하지만 라이선스 비용은 적지 않습니다. 따라서 오픈 소스 통계 프로그램 R22 에 의존하는 사용하기 쉬운 스크립트는 데이터 분석을보다 쉽게 이용할 수있게합니다.
이 프로토콜은 시판되는 부품으로 소형 열 블록을 제조하고 동물성 플랑크톤(모래 달러 Dendraster excentricus의 유충)을 급성 열 스트레스에 노출시켜 열 상한을 결정하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 & 마이크로; m 멤브레인 필터</td><td>VWR</td><td>74300-042</td><td></td></tr><tr><td>&frac12; &rdquo; 아크릴 시트</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K266</td><td>충분한 단열재를 가진 융기 케이스를 구성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>VWR</td><td>76290-420</td><td></td></tr><tr><td>2 채널 7 열전대 유형 데이터로거</td><td>Omega Engineering</td><td>HH506A</td><td>마이크로 원심분리기 튜브 내부에 들어갈 수 있는 어떤 온도계로도 교체 가능</td></tr><tr><td>자동 피펫&nbsp;</td><td>라닌&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>볼트와 클램프 마운트 스트립 히터 with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W</td><td>McMaster-Carr</td><td>3619K32</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Bioassay Mix</td><td>Pentair</td><td>CM2B</td><td>aritifical 해수를 만드는 데 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Denraster excentricus</td><td>M-Rep&nbsp;</td><td></td><td>캘리포니아의 샌드 달러&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 현미경&nbsp;</td><td>니콘&nbsp;</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>DIYhz 알루미늄 수냉식 블록, PC 컴퓨터 CPU 그래픽 라디에이터 방열판 흡열 헤드 실버용 액체 수냉식 방열판 시스템(40mm x 120mm x 12mm)</td><td>아마존</td><td></td><td>수조에 연결하여 블록의 한쪽 끝을 냉각하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>쉽게 기계화할 수 있는 MIC6 주조 알루미늄 시트 2" 두께 8" x 8"&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>86825K953</td>은 <td>온도 조절기 프로브를 위해 한쪽에 뚫린 두 개의 추가 구멍이 있는 60개의 동일한 간격의 구멍(직경 11mm, 깊이 42mm)으로 2" x 6" x 8"로 가공되었습니다.</td></tr><tr><td>경제적이고 유연한 폴리에틸렌 폼 파이프 단열재</td><td>McMaster-Carr</td><td>4530K121</td>은 <td>냉각기와 블록 사이의 플라스틱 튜브를 덮어 열 손실을 줄입니다. 온도 범위가 실온에 가까운 경우 생략 가능&nbsp;</td></tr><tr><td>EVERSECU 72w 110-240v 수족관 물 냉각기 워머/쿨러 온도 컨트롤러 물고기 새우 탱크 해양 산호초 탱크 아래 20 L/30 L 수족관 냉각기</td><td>아마존</td><td></td><td>은 실험실 등급 수조 대신 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>애벌레 모래 달러를 사용한 예&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENNEL 100g 실버 실리콘 열 전도성 화합물 그리스 페이스트 GPU CPU IC LED 오븐 냉각</td><td>아마존</td><td></td><td>블록과 가열 및 냉각 요소 사이의 열전도율을 향상시킵니다.</td></tr><tr><td>Inkbird WiFi 파충류 온도 조절기 온도 조절기 2개의 프로브와 2개의 콘센트, IPT-2CH 파충류 히트 매트 온도 조절기(콘센트당 최대 250W)</td><td>Amazon</td><td></td><td>모니터 핫 엔드와 콜드 엔드. 범위에서 핫 엔드를 유지</td></tr><tr><td>Lauda Ecoline Silver Air-Cooled 냉장 순환기</td><td>VWR</td><td>89202-386</td><td>수족관 냉각기로 교체 가능&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>76019-014</td><td>더 큰 동물을 사용하는 경우, 스캔 바이알 (VWR 66022-004)이 좋은 대안입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitex 메쉬 필터</td><td>&nbsp; 자체 제작</td><td></td><td>1/2" PVC 튜브에 부착된 Nitex 메시에 뜨거운 접착제를 사용했습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (0.35 M)&nbsp;</td><td>Millpore-Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>R 통계 소프트웨어.&nbsp;</td><td>통계 계산을</td><td></td><td></td>위한 R 프로젝트</tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>VWR</td><td>89219-346</td><td>대상 유기체의 크기에 따라 gague 14와 16을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Tygon Tubing&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K65</td><td>사용된 냉각기와 블록에 맞게 조정&nbsp;</td></tr><tr><td>Zoo Med Repti Temp Rheostat</td><td>Chewy.com</td><td></td><td>150W로 정격화되었으며 발열체에 직접 공급되도록 다시 배선되었습니다. 열 출력 속도를 제어하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

열 블록을 사용한 동물성 플랑크톤에 대한 열 한계 결정

Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block

열 한계와 폭은 종 분포를 예측하는 데 널리 사용되었습니다. 지구 온도가 계속 상승함에 따라 순응에 따라 열 한계가 어떻게 변하고 생활 단계와 개체군간에 어떻게 변하는 지 이해하는 것이 미래의 온난화에 대한 종의 취약성을 결정하는 데 중요합니다. 대부분의 해양 생물은 초기 플랑크톤 단계를 포함하는 복잡한 수명주기를 가지고 있습니다. 이러한 작은 초기 발달 단계(수십 미크론에서 수백 미크론)의 열 한계를 정량화하면 발달 병목 현상을 식별하는 데 도움이 되지만 이 프로세스는 표적 유기체의 작은 크기, 큰 벤치 공간 요구 사항 및 높은 초기 제조 비용으로 인해 어려울 수 있습니다. 여기에서는 소량(mL에서 수십 mL)에 맞춰진 설정이 제시됩니다. 이 설정은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 결합하여 안정적이고 선형적인 열 구배를 생성합니다. 설정의 생산 사양과 살아있는 개체와 죽은 개체를 소개 및 열거하고 치사 온도를 계산하는 절차도 제공됩니다.

이 프로토콜의 목표는 동물성 플랑크톤의 열 상한을 결정하는 것입니다. 이를 위해서는 안정적이고 선형적인 열 구배가 필요합니다. 제안된 설정은 수조 온도를 8°C로 설정하고 히터를 39°C로 설정하여 14°C에서 40°C 범위의 열 구배를 생성할 수 있었습니다(그림 2A). 온도 구배는 끝점 값을 변경하여 좁히고 이동할 수 있습니다. 더 좁은 범위 (19 °C 내지 37 °C)를 갖는 열 구배는 또한 히터를 37 °C로 설정하고 수조를 15 °C로 설정함으로써 생성되었다. 블록의 온도는 설정 후 45분에서 1시간 이내에 안정화됩니다(그림 2B).
이 프로토콜을 동물성 플랑크톤에 적용하는 것을 설명하기 위해, 모래 달러 (Dendraster excentricus)의 유충에서 개체 발생을 통해 LT50으로 표시된 열 상한의 변화를 조사했습니다...

본 프로토콜은 안정하고 선형적인 열 구배를 생성하기 위해 상업적으로 이용가능한 성분의 사용을 예시한다. 이러한 구배는 플랑크톤 유기체, 특히 무척추 동물 유충의 열 상한을 결정하는 데 사용될 수 있습니다.

Thermal limits and breadth have been widely used to predict species distribution. As the global temperature continues to rise, understanding how thermal ...

지구 온도가 계속 상승함에 따라 열 한계와 순응 및 개체 발생과의 관계를 정량화하는 것은 미래의 온난화에 대한 종의 취약성을 결정하는 데 필수적입니다. 복잡한 생명 역사를 가진 해양 생물의 경우 열 한계를 결정하는 것은 논리적으로 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 작은 플랑크톤 유기체의 임계 온도를 추정하는 방법을 구축하기 쉽고 작은 설치 공간을 소개합니다.이 방법은 밀리미터 크기의 플랑크톤 미만의 작은 것을 위해 개발되었지만 약 50 밀리리터 부피의 섬광 바이알에 맞는 더 큰 해양 생물에 채택 될 수 있습니다. 스트립 히터를 가변 저항기에 배선하여 시작하십시오. 6 x 10 크기의 그리드에 60 개의 구멍을 뚫어 20.3 x 15.2 x 5cm 크기의 알루미늄 블록을 준비하고 구멍이 양방향으로 중심에서 중앙으로 2cm 간격으로 있는지 확인하십시오.첫 번째와 두 번째 열, 아홉 번째와 10번째 열 사이에 두 개의 추가 구멍을 뚫어 온도 컨트롤러 프로브의 크기와 일치시킵니다. 요소를 제자리에 고정하고 완성 된 열 블록을 단열하려면 투명 아크릴 시트로 케이스를 구성하여 발열체 뒷면에 두 개의 레이어를 적용하십시오. 최종 조립에서 열 페이스트를 적용하여 발열체에서 블록으로, 블록에서 냉각 요소로의 열전도율을 최대화합니다.수조를 Tygon 튜브로 연결하고 온도 조절기 프로브를 알루미늄 블록 측면의 구멍에 삽입합니다. 밀링 된 모든 구멍에 수돗물로 채워진 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 가장자리에 놓습니다. 온도 컨트롤러를 켜고 프로브 1의 정지 가열 온도를 섭씨 35도에서 37도로, 프로브 2를 섭씨 21.5도에서 22.5도로 설정합니다.가변 저항기를 돌려 발열체를 켜고 중간으로 설정하십시오. 수조를 켜고 냉각기 온도를 섭씨 15도로 설정합니다. K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 이후 10분마다 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인합니다.필요에 따라 온도 조절기와 수조의 설정을 변경하여 끝점의 값을 조정합니다. 재순환 수조와 히터를 켜고 각각 섭씨 15도, 섭씨 37도로 설정하여 섭씨 19.5도에서 섭씨 37도까지의 온도 구배를 생성합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 밀링 된 구멍에 넣고 열 블록의 온도에 도달하면 K 형 전극이있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심 분리 튜브 내부의 온도를 확인하십시오.그리고이 온도를 기록해 두십시오. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 바닷물로 채우고 0.45 마이크로 미터 메쉬를 통해 여과합니다. 역여과로 연구 유기체의 배양을 농축하여 유기체가 비커의 바닥에 남아 있도록 합니다.농축된 배양액을 여과된 해수로 헹구고, 역여과를 한 번 더 반복하여 시료를 농축한다. 해부 현미경으로 작은 플랑크톤 유기체를 세고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 알려진 수의 유기체를 반쯤 채워진 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 이제이 튜브의 최종 부피가 1 밀리리터에 도달 할 때까지 여과 된 해수를 추가하십시오.이제이 튜브를 쌍으로 가열 블록에 넣고 차가운 끝에서 시작하여 유기체가 원하는 실험 온도까지 점차적으로 예열 할 수 있도록합니다. 10분 동안 기다렸다가 마이크로 원심분리기 튜브 쌍을 더 따뜻한 온도의 인접한 천공 구멍으로 옮깁니다. 콜드 엔드의 각 행에 추가 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 배치하고 쌍으로 따뜻한 끝쪽으로 계속 이동하십시오.전체 블록이 채워지면 지정된 온도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 잠복기가 끝나면 각 튜브의 온도를 측정하고 기록해 두십시오. 그런 다음 모든 튜브를 사전 라벨링된 홀더로 옮기고 회수할 수 있도록 미리 결정된 온도에서 1시간 동안 배양합니다.살아있는 유기체 부분을 열거하기 위해, 유리 피펫을 사용하여 35mm 페트리 접시에 개별 마이크로 원심 분리 튜브의 내용물을 옮깁니다. 해부 현미경으로 살아있는 유기체와 죽은 유기체를 세고 숫자를 기록하십시오. 관찰 된 유기체의 수는 원래 취한 유기체와 일치해야합니다.그렇지 않은 경우 마이크로 원심 분리기 튜브와 페트리 접시의 측면을 확인하고 관심있는 헤더 그룹화 변수, 섭씨 온도 단위의 튜브 온도, 살아있는 개인 수 및 사망 한 개인 수와 함께 CSV 형식의 데이터 테이블을 생성합니다. 로지스틱 회귀 분석으로 데이터를 피팅하려면 이항 분포가 있는 일반화 선형 모형을 사용하십시오. 모델을 실행하려면 source를 입력하고 R 파일 modelloop.r을 사용합니다.개체의 50%가 생존한 예측 변수 값을 계산하여 열 상한의 중앙값을 결정합니다. 이 프로토콜을 사용하여 수정 후 2, 4 및 6 일에 섭씨 19도에서 37 도의 온도 범위에 걸쳐 유충 모래 달러의 생존을 측정했습니다. 유충 모래 달러가 발달함에 따라 열 상한은 수정 후 2 일 섭씨 28.6도에서 수정 후 4 일 섭씨 28.8도, 수정 후 6 일 섭씨 약 29도까지 증가했습니다.배양 및 회복 시간은 종에 따라 다릅니다. 선택한 타이밍이 신뢰할 수 있는 라이브 대 데드 추정을 산출하는지 확인하기 위해 예비 테스트를 수행하는 것이 중요합니다.

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연구

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