쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

이 모델은 시험관 내에서 말초 신경계의 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다. 이를 통해 미엘린 정량화와 Axon-Schwann 세포 상호작용 검사가 가능합니다. 공동 배양은 14 일부터 강력한 수초화를 발달시킵니다.

DRG 외식편 배양은 해리된 뉴런 배양에 비해 온전한 구조 구조의 이점을 제공합니다. 이 방법은 말초 신경계의 염증성 및 신경 퇴행성 질환에 대한 tropotic 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 안락사 된 쥐의 몸통에있는 작업 영역을 70 % 에탄올로 소독하십시오.

쥐의 등 왼쪽 하지를 가위로 열고 이두박근의 대퇴근을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게로 부드럽게 올리면 좌골 신경을 풀어 신경을 멍들게하지 않도록하십시오. 집게를 사용하여 잘린 신경을 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 조직 배양 접시에 옮기고 겐타 마이신 밀리리터 당 50 마이크로 그램을 함유합니다.

그런 다음 실체 현미경을 사용하여 두 쌍의 미세 집게로 신경에서 지방, 근육 및 혈관을 제거합니다. 좌골 신경의 근위 및 원위 끝을 식별하고 두 번째 쌍의 미세 겸자로 근위 신경 끝을 잡고 근위부에서 원위 방향으로 한 쌍의 미세 집게로 신경외신경을 제거합니다. 정제된 신경을 겐타마이신이 함유된 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지로 다른 조직 배양 접시에 옮긴 후, 분리된 신경 다발을 애타게 하여 두 쌍의 미세 집게를 사용하여 단일 신경 섬유를 분리 및 분리합니다.

10 밀리리터 혈청 피펫을 사용하여 신경 섬유를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 매체를 차지합니다. 그런 다음 겐타 마이신과 함께 leibovitz의 L 15 배지 50 밀리리터를 신경 섬유에 몇 번 추가합니다. 신경 섬유가 들어있는 튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 188G에서 원심 분리합니다.

상층액을 제거한 후 남은 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠렛을 60mm 조직 배양 접시에 옮깁니다. 50 밀리리터 튜브를 10 밀리리터의 효소 분해 용액으로 헹구고 신경 섬유 접시에 첨가하십시오. 피펫 끝으로 접시에 신경 섬유를 조심스럽게 분배하십시오.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 18시간 동안 배양합니다. 그리고 HBSS에 40% FCS에서 10밀리리터를 추가하여 효소 분해를 중지합니다. 소화된 신경을 50밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 4도에서 10분 동안 188G에서 원심분리합니다.

상청액을 버린 후, 10% FCS 및 겐타마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 함유하는 DMEM 10밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킨다. 다음으로, 세포 현탁액을 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 여과한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 188G에서 원심분리한 후 FCS와 겐타마이신을 함유하는 4밀리리터의 DMEM으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

2 밀리리터의 세포 현탁액을 2 개의 폴리 리신 및 라미닌 코팅 된 60 밀리미터 조직 배양 접시 각각에 첨가한다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양하고 인큐베이터에서 이틀 동안 접시를 손대지 않은 상태로 둡니다. Schwann 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 188 G에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 90 마이크로리터의 자성 세포 분리 완충액에 1회 10회 7번째 세포에 재현탁한다.

그런 다음 일곱 번째 셀에 10 곱하기 10 당 10 마이크로 리터의 ti1 마이크로 비드를 추가합니다. 재현탁 용액을 섭씨 8도의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 자기 세포 분리 완충액에 2 밀리리터를 세포 현탁액에 첨가한다.

섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리한 후 펠릿을 500마이크로리터의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 자성 세포 분리 컬럼을 셀 분리기에 넣고 1밀리리터의 자기 세포 분리 버퍼로 컬럼을 적십니다. 그런 다음 세포를 적용하여 원심 분리를 위해 흐름을 수집합니다.

안락사된 임신한 쥐에서 자궁을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 HBSS가 있는 100mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 구부러진 집게를 사용하여 자궁을 잡고 미세한 집게로 자궁벽을 엽니 다. 양수 자루 하나를 제거하고 미세한 집게로 구멍을 뚫어 조심스럽게 엽니다.

자궁에서 모든 배아를 신속하게 제거하고 HBSS로 채워진 접시에 옮깁니다. 부드럽게 배아 몸통 하나를 HBSS로 채워진 35mm 접시에 넣습니다. 실체 현미경으로 몸통의 등쪽 부분을 열어 배아를 두 부분으로 나눕니다.

절반을 옆으로 돌려 배아의 등쪽 부분에 있는 선에 위치한 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 가닥을 식별합니다. 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 DRG 전체를 잘라냅니다. 2밀리리터의 HBSS로 채워진 신선한 접시에 DRG를 넣은 후 미세한 집게와 미세 가위를 사용하여 나머지 조직에서 단일 DRG를 분리합니다.

각 웰에 190마이크로리터의 DRG 성장 배지가 들어 있는 4웰 플레이트를 취하고, 미세 집게와 주걱을 사용하여 단일 DRG를 각 웰의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 DRG 체외이식편 배양물을 섭씨 37도와 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다. 다음날, 50 마이크로리터의 DRG 성장 배지를 각 웰에 조심스럽게 첨가하고, 매일 현미경을 사용하여 DRG 외식편 부착 및 축삭 성장을 관찰한다.

DRG 외식편 배양 3일째에 공동 배양을 위해, DRG 성장 배지를 웰 당 30, 000 슈반 세포를 함유하는 250 마이크로리터의 공동 배양 배지로 조심스럽게 교체한다. 면역세포화학적 염색을 수행하기 위해, DPBS 세척된 세포를 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 배양하여 커버 슬립에 세포를 고정시켰다. 도립 현미경을 사용하여 중앙의 DRG 외식편을 둘러싸고 있는 8개의 정의된 영역에서 면역세포화학적으로 염색된 샘플의 사진을 찍습니다.

길쭉한 방추형 형태를 가진 슈반 세포의 모습과 공동 배양에서 얇은 DRG 축삭이 여기에 묘사되어 있습니다. 공동배양물에서의 수초화는 미엘린 염기성 단백질 또는 MBP, 베타세튜불린, 및 DAPI에 대해 DRG 외식편 및 슈반 세포를 염색함으로써 상이한 날에 평가하였다. 공동 배양의 축삭 네트워크는 밀도가 높았고 관찰 시간 경과에 따라 눈에 띄게 변하지 않았습니다.

수초화의 첫 징후는 공동 배양 10일과 12일에 나타났습니다. 14일째부터 MVP 신호가 더 뚜렷해졌고 미엘린으로 둘러싸인 축삭이 검출되었습니다. 수초화는 20일까지 공동 배양 시간에 따라 증가했습니다.

수초화는 MVP 및 베타 3 튜불린 양성 영역의 비율로 정량화되었습니다. 수초화의 현저한 증가는 10일에 비해 18일과 20일에 관찰되었습니다. DRG 체외이식편 배양은 깨지기 쉬우므로 조심스럽게 다루어야 합니다.

예를 들어, 인큐베이터에서 꺼내거나 배지 변경 및 고정 중에 꺼낼 때. 공동배양 샘플의 유전자 발현 분석은 미엘린을 보다 상세히 조사하기 위해 형성될 수 있다. 여기에서 22일째에 미엘린 마커 PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1을 검출했습니다.