Name: 쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 쥐 등쪽 뿌리 신경절과 슈반 세포 공동 배양을 통한 말초 신경계 수초화 연구 방법. 이 시험관 내 모델은 축삭-슈반 세포 상호작용 분석 및 신경퇴행성 질환 치료제 선별에 활용됩니다.

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조언과 지원을 해주신 Ralf Gold 교수님과 Gisa Ellrichmann 박사님께 감사드립니다.

모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 공동체 협의회 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 슈반 세포 배양
<ol><li>Schwann 세포 배양용 코팅<ol><li>무균 상태에서 세포 배양 접시를 코팅합니다. 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 2mL를 각각 2개의 60mm 조직 배양(TC) 접시에 바르고 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>PLL을 제거하고 TC 접시를 증류수로 2배 세척한 다음 4°C에서 밤새 1μg/cm2 라미닌 2mL와 함께 배양합니다. TC 접시를 아쿠아 데스트로 2번 씻고 접시를 자연 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Schwann 세포 배양을 위한 배지 준비<ol><li>멸균 조건에서 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)/F-12(고포도당)에 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2μM 포스콜린, 10nM 뉴레굴린 및 50μg/mL 겐타마이신을 추가하여 50mL의 Schwann 세포 배지를 준비합니다.</li>
		<li>멸균 조건에서 70μg/mL 겐타마이신으로 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>좌골 신경 준비 알림: 모든 좌골 신경 준비 단계는 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.<ol><li>Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL가 포함된 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 5mL가 포함된 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 50mL와 겐타마이신 50μg/mL가 포함된 100mm TC 접시 1개를 준비합니다.</li>
		<li>고압증기멸균으로 모든 기구를 청소하십시오. 기구와 작업 공간에 70% 에탄올을 뿌립니다.</li>
		<li>CO2 흡입 및 참수를 사용하여 3주령의 수컷 Sprague Dawley 쥐 5마리를 안락사시킵니다. 쥐의 몸통에 70 % 에탄올을 뿌립니다.</li>
		<li>가위로 등쪽 좌측을 열고 이두근 대퇴골 근육을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게로 부드럽게 올리면 좌골 신경을 풀어 신경을 멍들게하지 않도록하십시오.</li>
		<li>구부러진 집게로 신경의 가장 근위 부분을 잡고 신경을 곧게 펴고 가위를 사용하여 신경을 최대한 높게 자릅니다. 그런 다음 가위로 천골 신경총과 발에 가까운 신경을 잘라냅니다. 오른쪽에 대해 1.3.4-1.3.5단계를 반복합니다. 알림: 팔다리를 열 때 혈관에 멍이 들지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>집게를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 좌골 신경을 얼음처럼 차가운 DPBS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>좌골 신경 재건<ol><li>집게를 사용하여 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-100 배지와 15 μg/mL 겐타마이신이 있는 50mm TC 접시에 모든 신경을 옮깁니다. 실체 현미경을 계속 사용하고 두 쌍의 미세 집게로 신경에서 지방, 근육 및 혈관을 제거합니다. 집게로 신경을 잡고 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-100 매체가 있는 15mm TC 접시에 옮깁니다.</li>
		<li>좌골 신경의 근위부와 말단부를 확인하십시오. 한 쌍의 미세 집게로 근위부에서 원위 방향으로 한 쌍의 미세 집게로 신경외막을 제거하고 두 번째 쌍의 미세 집게로 근위 신경 끝을 유지합니다.</li>
		<li>정제된 신경을 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지와 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 100mm TC 접시에 옮깁니다. 두 쌍의 미세 집게를 사용하여 단일 신경 섬유를 분리하고 분리하기 위해 분리된 신경 다발을 애타게 합니다.</li>
		<li>10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 신경 섬유를 50mL 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 배지를 차지합니다. 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 신경 섬유에 넣고 50mL 튜브에서 몇 번 죽였습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>좌골 신경의 효소 소화 알림: 다음 단계(단계 1.5-1.8, 2.1 및 2.2)는 무균 조건에서 수행됩니다.<ol><li>10mL의 DMEM(고포도당)에 0.25% dispase II, 0.05% type I collagenase 및 50μg/mL gentamycin을 포함하는 효소 분해 용액을 준비합니다.</li>
		<li>튜브를 4°C에서 5분 동안 188 x g 로 원심분리하고, 25mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 1,000mL 피펫을 사용하여 나머지 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠릿을 60mm TC 접시에 옮깁니다.</li>
		<li>50mL 튜브를 효소 분해 용액 10mL로 헹구고 신경 섬유가 들어있는 접시에 넣습니다. 소화를 위해 접근 가능한 표면을 최대화하기 위해 피펫의 끝으로 접시의 조직을 조심스럽게 분배하십시오.</li>
		<li>37°C 및 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션하고,Ca2 및Mg2+ (HBSS) 없이 행크스 평형염 용액에 40% FCS 10mL를 첨가하여 소화를 중지시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 분리<ol><li>소화된 신경을 혈청학적 피펫과 원심분리기를 사용하여 50°C에서 10분 동안 188 x g 에서 4mL 튜브로 옮깁니다. 상층액을 버리고 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 10mL의 DMEM에 펠릿을 재현탁합니다. 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL 및 200 μL 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 20회 재현탁합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 100 μm 세포 여과기를 통해 여과하고, 4°C에서 10분 동안 188 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 10% FCS와 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 4mL의 DMEM으로 펠릿을 재현탁합니다.</li>
		<li>2 mL의 세포 현탁액을 2개의 PLL- 및 라미닌-코팅된 60 mm TC 디쉬 각각에 첨가하고, 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 2 일 동안 플레이트를 그대로 두어 세포를 기계적 스트레스로부터 보호하고 부착을 지원합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슈반 세포 분화<ol><li>2일 후 배지를 제거하고 DMEM(고포도당), 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신으로 플레이트를 2배 조심스럽게 헹굽니다. 그런 다음 Schwann 세포 배지 2mL를 추가합니다. Schwann 세포 배지를 2일마다 교체하고 현미경을 사용하여 세포 모양과 밀도를 관찰합니다. 참고: Schwann 세포와 DRG 외식편은 공동 배양을 위해 시기 적절하고 조정된 방식으로 준비되어야 합니다. Schwann 세포가 80%의 합류도에 가까울 때 E 13.5의 배아가 있는 쥐가 DRG 준비에 사용할 수 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 트립신 처리 및 자기 분리 참고: 다양한 Schwann 세포 배양 단계의 예시 사진은 보충 그림 1을 참조하십시오.<ol><li>세포가 약 80%(배양 6-12일)의 밀도에 도달하면 플레이트를 3mL의 DPBS로 2배 조심스럽게 세척하고 2mL의 0.05% 트립신/EDTA(37°C로 예열)와 함께 3분 동안 배양합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 분리되면 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가하여 소화를 비활성화합니다. 알림: 트립신 처리 시간을 엄격하게 3분으로 유지하고 그 후 빠르게 진행하십시오.</li>
		<li>0.5% 소혈청알부민(BSA) 및 2nM EDTA가 포함된 DPBS를 포함하는 2mL의 자기 세포 분리 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 10 μL의 세포 현탁액과 10 μL의 트리판 블루를 결합하고 염색 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 188 x g 에서 원심분리하고, 세포 펠릿을 1 x 10 7 세포 당 90 μL의자기 세포 분리 완충액에 재현탁시킨다. 1 x 107 세포당 10 μL의 Thy-1 마이크로비드를 추가합니다. 용액을 몇 번 재현탁하고 8°C의 암실에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>2mL의 자기 세포 분리 완충액을 세포 현탁액에 넣고 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다.</li>
		<li>자성 세포 분리 컬럼에 1mL의 자성 세포 분리 완충액을 적십니다. 자기 셀 분리 컬럼을 자기 셀 분리기에 놓습니다. 셀을 자성 셀 분리 컬럼에 적용합니다. 흐름을 수집하고 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 참고: 섬유아세포는 양성으로 선택되고 컬럼에 남아 있는 반면 Schwann 세포는 컬럼을 통과합니다. 섬유아세포는 스탬프로 수집할 수 있습니다(예: 슈반 세포 염색 프로토콜에 대한 음성 대조군으로서).</li>
		<li>상청액을 버리고 펠렛을 1mL의 공배양 배지에 재현탁합니다(단계 3.1.1 참조). 트립판 블루로 염색한 후 세포를 염색 챔버에서 계수한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DRG 체외이식편 배양
<ol><li>DRG 성장 배지 준비<ol><li>신경기저 배지에 2% B27, 2% 말 혈청, 1% L-글루타민, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 및 10ng/mL 신경 성장 인자(NGF)를 추가하여 DRG 성장 배지를 준비합니다. 성장 배지를 4°C에서 보관한다. 참고: 성장 배지는 2일 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG 외식편용 코팅<ol><li>커버 슬립을 70 % 에탄올에서 1 시간 동안 배양하고 곡선 집게를 사용하여 4 웰 접시의 우물에 넣습니다. 에탄올이 건조된 후 웰당 0.2mg/mL 폴리-D-라이신(PDL) 300μL를 바르고 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>커버슬립을 DPBS로 각각 3분 동안 5번 연속으로 세척합니다. DPBS를 제거하고 커버슬립에 1μg/mL 라미닌 300μL을 바르고 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>5분 동안 DPBS로 3회 세척 단계 후 DPBS를 190μL의 DRG 성장 배지로 교체합니다. 4-웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG 준비 알림: 깨끗한 벤치 아래에서 배아 쥐의 DRG를 수확합니다.<ol><li>준비하기 전에 모든 기구를 70% 에탄올로 세척하십시오. 접시당 2mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 35mm TC 접시 10개(배아당 2개)를 채우고 접시당 5mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 100mm TC 접시 2개를 채웁니다.</li>
		<li>임신한 래트(성인 암컷 Sprague Dawley rats, E13.5)를CO2 흡입 및 참수로 안락사시킨다.</li>
		<li>몸에 70 % 에탄올을 뿌리고 쥐의 복부 몸통을 엽니 다. 자궁을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 HBSS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.</li>
		<li>구부러진 집게를 사용하여 자궁을 잡고 미세한 집게로 자궁벽을 엽니다. 하나의 양막을 제거하고 미세한 집게로 구멍을 꼬집어 조심스럽게 엽니 다.</li>
		<li>주변 조직에서 배아를 제거하고 탯줄을 자르고 미세한 집게를 사용하여 배아를 참수합니다. 구부러진 집게와 주걱을 사용하여 HBSS로 채워진 100mm TC 접시에 몸통을 넣습니다.</li>
		<li>자궁에서 모든 배아를 신속하게 제거하고 HBSS로 채워진 하나의 100mm TC 접시에 옮깁니다. 배아가 5개 이상인 경우 2.3.1단계에 따라 2mL의 HBSS가 포함된 추가 35mm TC 접시를 준비합니다.</li>
		<li>주걱과 구부러진 집게를 사용하여 HBSS로 채워진 35mm TC 접시에 배아 몸통 하나를 부드럽게 넣습니다. 실체 현미경으로 몸통의 등쪽 부분을 열어 미세한 집게와 미세 가위를 사용하여 배아를 두 부분으로 나눕니다. 절반을 옆으로 돌리고 배아의 등쪽 부분에 일렬로 위치한 DRG 가닥을 확인하십시오.</li>
		<li>가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 DRG 전체를 잘라냅니다. 35mL의 HBSS로 채워진 신선한 2mm TC 접시에 DRG를 넣고 미세 집게와 마이크로 가위를 사용하여 나머지 조직에서 단일 DRG를 분리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG 세포 배양<ol><li>190μL의 DRG 성장 배지가 들어 있는 4웰 플레이트를 인큐베이터에서 DRG를 준비할 클린 벤치로 가져갑니다. 미세 집게와 주걱을 사용하여 단일 DRG를 4웰 배양 플레이트의 한 웰에 조심스럽게 옮깁니다. DRG를 부착하려면 중앙 위치가 중요하므로 DRG를 각 웰의 중앙에 배치합니다.</li>
		<li>이제부터 무균 상태에서 작업하십시오. 체외이식편 배양물을 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 다음날, 100 mL 피펫을 사용하여 50 μL의 DRG 성장 배지를 각 웰에 조심스럽게 첨가한다.</li>
		<li>매일 현미경을 사용하여 DRG 외식편 부착 및 축삭 성장을 관찰하고 배양 3일째에 커버슬립에서 분리되었거나 축삭을 능가하지 못한 DRG 외식편을 버립니다. 참고: DRG 외식편은 배양 첫날에 매우 약하므로 특히 배지를 교체할 때 플레이트를 인큐베이터 안팎으로 이동할 때 또는 인큐베이터 문을 닫을 때에도 주의해서 다루어야 합니다. 웰당 190μL의 배지의 정확한 부피는 배양 첫날 동안 DRG 외식편을 제자리에 유지하는 데 중요합니다. 느슨한 DRG 외식편은 커버 슬립에 달라 붙지 않고 매체에서 수영하기 때문에 일상적인 통제 중에 쉽게 식별 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 공동 문화
<ol><li>Schwann 세포를 DRG 외식편 배양으로 전달<ol><li>DRG 성장 배지에 0.1% 아스코르브산을 첨가하여 공배양 배지를 준비합니다.</li>
		<li>DRG 외식편 배양 3일째에 DRG 성장 배지를 웰당 30,000개의 Schwann 세포(1.8단계로부터)를 포함하는 보조 배양 배지 250μL로 조심스럽게 교체합니다.</li>
		<li>DRG 외식편과 Schwann 세포의 공동 배양을 최대 22일 동안 유지합니다. 250 μL의 공배양 배지를 격일로 조심스럽게 교체하고 현미경을 사용하여 세포의 모양을 관찰합니다. 참고: 배양 첫 번째 날에 공동 배양된 DRG 축삭 및 Schwann 세포의 예는 그림 1을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>면역세포화학적 염색 참고: 공동 배양 샘플은 쉽게 손상될 수 있으므로 염색 절차 중에 매우 조심스럽게 다루십시오.<ol><li>커버슬립에 세포를 고정하려면 배지를 천천히 제거하고 DPBS로 3배 세척한 다음 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 DPBS로 교체하고 고정된 세포를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다. 주의 : 4% PFA를 취급할 때는 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
		<li>커버슬립을 DPBS로 5분 동안 3번 세척한 다음 차단 용액(10% 염소 혈청, 10% 소 혈청 알부민[BSA], 0.1% 젤라틴 및 0.05% Triton X-100)으로 1시간 동안 차단합니다. 1차 항체인 βIII-튜불린(1:7,500)과 미엘린 염기성 단백질(MBP)(1:750)을 블로킹 용액에 희석하고 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>세포를 DPBS로 5분 동안 3배 세척합니다. 형광 염료 접합 2차 항체를 블로킹 용액에 1:1,000으로 희석하여 사용하고 실온(RT)에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>세포를 DPBS로 3분 동안 5배 세척하고 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 포함한 형광 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 세포를 장착합니다. 현미경으로 문서화될 때까지 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오. 주의 : 형광 장착 매체를 다룰 때는 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>도립 현미경을 사용하여 중앙의 DRG 체편을 둘러싼 8개의 정의된 영역의 사진을 찍습니다.</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션을 사용하여 MBP로 염색된 βIII-튜불린 양성 축삭 및 수초화 영역을 정량화합니다.</li>
		<li>수초화 축삭과 비수초 축삭의 비율로 수초화 비율을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Lehmann, H. C., Höke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li>
<li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+%28CIDP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).</li>
<li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Communications%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li>
<li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

여기에서 우리는 두 개의 개별 세포 유형 배양인 Schwann 세포와 후근 신경절 외식편을 병합하여 시험관 내 수초화 생성을 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 특히 배양 첫날에 DRG 외식편을 재배하는 것입니다. DRG는 강력한 축삭 네트워크가 구축되기 전에 매우 약하기 쉬우며, 예를 들어 인큐베이터에서 꺼내거나 배지를 교체하는 동안 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 우물 바닥에서 분리되어 매체에서 수영하는 DRG는 실패한 재배를 보여줍니다. Schwann 세포의 경우, 다양한 배양 조건 및 보충제(예: 배지 내 혈청)로 인한 증식 속도 변화는 공배양에 대한 도전이 될 수 있습니다. 배양 물이 과도한 수의 슈반 세포에 의해 자라면 우물 바닥에서 분리되어 사용할 수 없게됩니다. 따라서 배양에서 Schwann 세포 수를 적정하는 것이 좋습니다. Schwann 세포 프로토콜을 설정하는 동안 SOX10 또는 S100 면역염색을 사용하여 순...

말초 신경계(PNS)에서 빠른 정보 전달은 미엘린으로 둘러싸인 축삭에 의해 매개됩니다. 축삭의 수초화는 전기 자극의 빠른 전파를 가능하게 하는 데 필수적인데, 이는 신경 섬유의 전도 속도가 축삭 직경 및 미엘린 두께와 상관관계가 있기 때문입니다1. 말초에서 중추신경계(CNS)로의 감각 신호 전달은 후근 신경절(DRG)이라고 하는 후근의 확대에 존재하는 1차 감각 뉴런의 활성화에 의존합니다. 미엘린의 형성과 유지를 위해, PNS의 수초화 신경교세포인 축삭과 슈반 세포 사이의 지속적인 소통은 필수적이다2.
PNS의 많은 질병은 일차 축삭 또는 탈수초 손상에 의한 정보 전달을 방해하여 감각 이상 또는 감각 이상을 유발합니다. 1차 감각 뉴런은 뉴런 손상 후 뉴런과 주변 슈반 세포 사이의 복잡한 상호작용에 의해 어느 정도 재생될 수 있는 능력을 가지고 있다3. 이 경우, 슈반 세포는 세포 재프로그래밍을 통해 축삭 및 미엘린 파편을 제거하고 축삭 재생을 촉진하여 재수초화를 일으킬 수 있다4. PNS의 탈수초성 장애에 대한 가능한 치료 옵션을 찾기 위해서는 건강과 질병에서 수초화의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 미엘린은 또한 급성 신경외상에 의해 손상될 수 있으며, 말초 신경 손상 후 기능 회복을 촉진하기 위해 수초화를 촉진하는 접근법이 연구 중이다5.
말초 수초화에 대한 우리의 지식은 Schwann 세포와 감각 뉴런의 수초 공배양으로부터 크게 도움이 되었습니다. 첫 번째 접근법이 적용된 이래로 6,7,8, 수초화는 다른 공동 배양 시스템 9,10,11을 사용하여 집중적으로 연구되었습니다. 여기에서 우리는 후근 신경절 축삭의 강력한 시험관 내 수초화를 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제공합니다. Schwann 세포 준비를 위한 프로토콜은 이전에 Pitarokoili et al.13에 발표된 Andersen et al.12의 프로토콜을 기반으로 합니다. 우리는 어린 쥐에서 유래한 Schwann 세포와 배아 DRG 외식편 배양을 사용하여 공동 배양을 수행하며, 이 배양에서 수초화가 약 14일에 발생합니다. 이 방법의 목표는 직접적인 축삭-슈반 세포 상호작용의 결과로서 미엘린의 형성을 조사하는 시스템을 제공하고, PNS 수초화의 조절제를 연구하는 것이다. 해리된 신경 세포 배양과 비교하여 DRG 외식편은 해부학적으로 더 보존되고 긴 축삭 돌기를 형성합니다. 수초화된 축삭 영역의 정량화는 공배양에서 수초화에 대한 충분한 판독값을 제공합니다. 상기 방법은 PNS 수초화에 대한 그의 잠재적 효과에 대해 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 도구이며, 또한 동물 모델에서 생체내 연구 이외에 활용될 수 있다14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, 토끼</td><td>Novus Biologicals, Centannial, 미국</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig; III-튜불린, 마우스&nbsp;</td><td>Biolegend, 미국 샌디에이고657402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임&nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27-supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, 슈베르테, 독일&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>생물권 필터 팁, 100 &마이크로; L</td><td>사르스테트, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>70760212</tr><tr><td>생물권 필터 팁, 1250 &마이크로; L</td><td>사르스테트, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>701186210</tr><tr><td>생물권 필터 팁, 20 &마이크로; L</td><td>사르스테트, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>701114210</tr><tr><td>생물권 필터 팁, 300 &마이크로; L</td><td>사르스테트, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70765210 소 혈청 알부민</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 100 & 마이크로; M</td><td>BD Bioscience, 하이델베르크, 독일</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>커버슬립 12mm</td><td>Carl Roth, 칼스루에, 독일&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 세밀한 펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, Germany</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td>4942078001</tr><tr><td>증류수 (정수 시스템)&nbsp;</td><td>Millipore, 프랑스 몰스하</td>임 <td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td>31331093</tr><tr><td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>VWR, 래드너, 미국&nbsp;</td><td></td><td></td>1009862500</tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 독일 스타인하임&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS는 슈반 세포 배양을 위해 테스트해야 합니다</td></tr><tr><td>Fine tysections (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일&nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (no Ca2+ 및 Mg2+ 없음)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td></td><td></td>14170138</tr><tr><td>HERAcell Incubator</td><td>Heraeus Instruments, 독일 하나우&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td></td><td></td>51029882</tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>HIH, Bethesda, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>레보비츠&급성; s L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, 슈베르테, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>11415064</tr><tr><td>L-글루타민 200 mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>MACS 멀티스탠드&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, 독일</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>현미경 Axio observer 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany&nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR, Radnor, USA&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber&nbsp;</td><td>보조, 독일 에를랑겐</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>21103049 NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Biozol, Eching, Germany</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon &Delta; multidishes, 4 well</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>아크로스 오가닉스, 미국 뉴저지&nbsp;</td><td></td><td></td>10342243</tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td>4430000018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일&nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일&nbsp;</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>반응관, 15&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>62554502</tr><tr><td>반응 튜브, 50&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>62547254</tr><tr><td>반응 용기, 1.5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>72690001</tr><tr><td>안전 캐비닛 S2020 1.8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td>51026640</tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫, 10 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>861254025</tr><tr><td>혈청학 피펫, 25 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>861685001</tr><tr><td>혈청학 피펫, 5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>861253001</tr><tr><td>Spatula</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Discovery.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany&nbsp;</td><td>495015-0012-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>외과용 가위</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>TC 접시 100, 셀 +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>833902300</tr><tr><td>TC 접시 35, 셀 +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>833900300</tr><tr><td>TC 접시 60, 셀 +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>833901300</tr><tr><td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임&nbsp;</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션 0.4%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>트립신(2.5%), 페놀 레드 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Type I Collagenase</td><td>Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일&nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>수조 유형 1008</td><td>GFL, 부르크베델, 독일&nbsp;</td><td>4285</td><td></td></tr></tbody></table>년

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

수초화 과정은 신경계에서 빠르고 충분한 신호 전달을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 말초 신경계에서 뉴런과 슈반 세포는 축삭의 수초화를 제어하기 위해 복잡한 상호 작용에 관여합니다. 이러한 상호 작용의 교란과 수초의 파괴는 염증성 신경병증의 특징이며 신경퇴행성 장애에서 이차적으로 발생합니다. 여기에서 우리는 말초 신경계의 수초화 과정을 조사하고, 축삭-슈반 세포 상호 작용을 연구하고, 각 세포 유형에 대한 치료제의 잠재적 효과를 개별적으로 평가하기 위해 말초 축삭의 강력한 수초화를 개발하는 후근 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 제시합니다. 방법론적으로, 배아 쥐(E13.5)의 등쪽 뿌리 신경절을 수확하고, 주변 조직으로부터 해리시키고, 3일 동안 전체 외식편으로 배양하였다. 슈반 세포는 3 주령의 성인 쥐로부터 분리되었고, 좌골 신경은 효소에 의해 소화되었다. 생성된 슈반 세포는 자기 활성화 세포 분류에 의해 정제되고 뉴레귤린 및 포스콜린이 풍부한 조건 하에서 배양되었습니다. 후근 신경절 외식편 배양 3일 후, 30,000개의 슈반 세포를 아스코르브산을 함유하는 배지에서 하나의 후근 신경절 외식편에 첨가했습니다. 수초화의 첫 징후는 면역세포화학적 염색에서 미엘린 염기성 단백질에 대한 산란 신호를 통해 공동 배양 10일째에 검출되었습니다. 14일째부터 수초가 형성되어 축삭을 따라 전파되었습니다. 수초화는 축삭 밀도의 차이를 설명하기 위해 수초화 면적과 축삭 면적의 비율로 미엘린 염기성 단백질 염색으로 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 시험관 내에서 말초 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험 기회를 제공하며, 이는 말초 신경계의 염증 및 신경퇴행성 질환에서 탈수초화 및 신경변성의 병리와 가능한 치료 기회를 이해하는 데 중요합니다.

공동 배양의 수초화는 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 및 20일에 평가되었습니다. DRG 외식편 및 Schwann 세포를 MBP, βIII-튜불린 및 DAPI에 대해 염색하였다. 공동 배양의 축삭 네트워크는 밀도가 높았고 관찰 시간 경과에 따라 눈에 띄게 변하지 않았습니다. 작은 파편 형태의 미엘린의 첫 징후는 10 일째에 검출 가능했고 12 일째에 증가했다 (그림 2). MBP 양성 영역은 배양 20일까지 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 수초화는 MBP 및 βIII-튜불린 양성 영역의 비율로 정량화되었습니다. 수초화는 10일에 비해 18일과 20일에 유의하게 증가했다(그림 3; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001).
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후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

이 모델은 시험관 내에서 말초 신경계의 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다. 이를 통해 미엘린 정량화와 Axon-Schwann 세포 상호작용 검사가 가능합니다. 공동 배양은 14 일부터 강력한 수초화를 발달시킵니다.DRG 외식편 배양은 해리된 뉴런 배양에 비해 온전한 구조 구조의 이점을 제공합니다. 이 방법은 말초 신경계의 염증성 및 신경 퇴행성 질환에 대한 tropotic 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 안락사 된 쥐의 몸통에있는 작업 영역을 70 % 에탄올로 소독하십시오.쥐의 등 왼쪽 하지를 가위로 열고 이두박근의 대퇴근을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게로 부드럽게 올리면 좌골 신경을 풀어 신경을 멍들게하지 않도록하십시오. 집게를 사용하여 잘린 신경을 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 조직 배양 접시에 옮기고 겐타 마이신 밀리리터 당 50 마이크로 그램을 함유합니다.그런 다음 실체 현미경을 사용하여 두 쌍의 미세 집게로 신경에서 지방, 근육 및 혈관을 제거합니다. 좌골 신경의 근위 및 원위 끝을 식별하고 두 번째 쌍의 미세 겸자로 근위 신경 끝을 잡고 근위부에서 원위 방향으로 한 쌍의 미세 집게로 신경외신경을 제거합니다. 정제된 신경을 겐타마이신이 함유된 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지로 다른 조직 배양 접시에 옮긴 후, 분리된 신경 다발을 애타게 하여 두 쌍의 미세 집게를 사용하여 단일 신경 섬유를 분리 및 분리합니다.10 밀리리터 혈청 피펫을 사용하여 신경 섬유를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 매체를 차지합니다. 그런 다음 겐타 마이신과 함께 leibovitz의 L 15 배지 50 밀리리터를 신경 섬유에 몇 번 추가합니다. 신경 섬유가 들어있는 튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 188G에서 원심 분리합니다.상층액을 제거한 후 남은 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠렛을 60mm 조직 배양 접시에 옮깁니다. 50 밀리리터 튜브를 10 밀리리터의 효소 분해 용액으로 헹구고 신경 섬유 접시에 첨가하십시오. 피펫 끝으로 접시에 신경 섬유를 조심스럽게 분배하십시오.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 18시간 동안 배양합니다. 그리고 HBSS에 40% FCS에서 10밀리리터를 추가하여 효소 분해를 중지합니다. 소화된 신경을 50밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 4도에서 10분 동안 188G에서 원심분리합니다.상청액을 버린 후, 10% FCS 및 겐타마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 함유하는 DMEM 10밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킨다. 다음으로, 세포 현탁액을 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 여과한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 188G에서 원심분리한 후 FCS와 겐타마이신을 함유하는 4밀리리터의 DMEM으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.2 밀리리터의 세포 현탁액을 2 개의 폴리 리신 및 라미닌 코팅 된 60 밀리미터 조직 배양 접시 각각에 첨가한다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양하고 인큐베이터에서 이틀 동안 접시를 손대지 않은 상태로 둡니다. Schwann 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 188 G에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 90 마이크로리터의 자성 세포 분리 완충액에 1회 10회 7번째 세포에 재현탁한다.그런 다음 일곱 번째 셀에 10 곱하기 10 당 10 마이크로 리터의 ti1 마이크로 비드를 추가합니다. 재현탁 용액을 섭씨 8도의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 자기 세포 분리 완충액에 2 밀리리터를 세포 현탁액에 첨가한다.섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리한 후 펠릿을 500마이크로리터의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 자성 세포 분리 컬럼을 셀 분리기에 넣고 1밀리리터의 자기 세포 분리 버퍼로 컬럼을 적십니다. 그런 다음 세포를 적용하여 원심 분리를 위해 흐름을 수집합니다.안락사된 임신한 쥐에서 자궁을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 HBSS가 있는 100mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 구부러진 집게를 사용하여 자궁을 잡고 미세한 집게로 자궁벽을 엽니 다. 양수 자루 하나를 제거하고 미세한 집게로 구멍을 뚫어 조심스럽게 엽니다.자궁에서 모든 배아를 신속하게 제거하고 HBSS로 채워진 접시에 옮깁니다. 부드럽게 배아 몸통 하나를 HBSS로 채워진 35mm 접시에 넣습니다. 실체 현미경으로 몸통의 등쪽 부분을 열어 배아를 두 부분으로 나눕니다.절반을 옆으로 돌려 배아의 등쪽 부분에 있는 선에 위치한 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 가닥을 식별합니다. 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 DRG 전체를 잘라냅니다. 2밀리리터의 HBSS로 채워진 신선한 접시에 DRG를 넣은 후 미세한 집게와 미세 가위를 사용하여 나머지 조직에서 단일 DRG를 분리합니다.각 웰에 190마이크로리터의 DRG 성장 배지가 들어 있는 4웰 플레이트를 취하고, 미세 집게와 주걱을 사용하여 단일 DRG를 각 웰의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 DRG 체외이식편 배양물을 섭씨 37도와 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다. 다음날, 50 마이크로리터의 DRG 성장 배지를 각 웰에 조심스럽게 첨가하고, 매일 현미경을 사용하여 DRG 외식편 부착 및 축삭 성장을 관찰한다.DRG 외식편 배양 3일째에 공동 배양을 위해, DRG 성장 배지를 웰 당 30, 000 슈반 세포를 함유하는 250 마이크로리터의 공동 배양 배지로 조심스럽게 교체한다. 면역세포화학적 염색을 수행하기 위해, DPBS 세척된 세포를 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 배양하여 커버 슬립에 세포를 고정시켰다. 도립 현미경을 사용하여 중앙의 DRG 외식편을 둘러싸고 있는 8개의 정의된 영역에서 면역세포화학적으로 염색된 샘플의 사진을 찍습니다.길쭉한 방추형 형태를 가진 슈반 세포의 모습과 공동 배양에서 얇은 DRG 축삭이 여기에 묘사되어 있습니다. 공동배양물에서의 수초화는 미엘린 염기성 단백질 또는 MBP, 베타세튜불린, 및 DAPI에 대해 DRG 외식편 및 슈반 세포를 염색함으로써 상이한 날에 평가하였다. 공동 배양의 축삭 네트워크는 밀도가 높았고 관찰 시간 경과에 따라 눈에 띄게 변하지 않았습니다.수초화의 첫 징후는 공동 배양 10일과 12일에 나타났습니다. 14일째부터 MVP 신호가 더 뚜렷해졌고 미엘린으로 둘러싸인 축삭이 검출되었습니다. 수초화는 20일까지 공동 배양 시간에 따라 증가했습니다.수초화는 MVP 및 베타 3 튜불린 양성 영역의 비율로 정량화되었습니다. 수초화의 현저한 증가는 10일에 비해 18일과 20일에 관찰되었습니다. DRG 체외이식편 배양은 깨지기 쉬우므로 조심스럽게 다루어야 합니다.예를 들어, 인큐베이터에서 꺼내거나 배지 변경 및 고정 중에 꺼낼 때. 공동배양 샘플의 유전자 발현 분석은 미엘린을 보다 상세히 조사하기 위해 형성될 수 있다. 여기에서 22일째에 미엘린 마커 PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1을 검출했습니다.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

배아 쥐의 두뇌 집합의 문화 시스템을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 집계에 Multipotent progenitors 개발하고 뉴런, astrocytes 및 oligodendrocytes로 구별하실 수 있습니다.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

이 비디오는 쥐 배아에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 분리하고 슈반 세포 전구체와 공동 배양하여 성숙한 슈반 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 DRG는 뉴런과 신경교세포를 분리하기 위해 처리됩니다. 분리된 세포를 배양하여 뉴런을 정제한 다음, 공동 배양 배지에서 슈반 세포 유사 세포(SCLC)와 공동 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 SCLC가 슈반 세포로 성숙하도록 유도합니다.

DRG 뉴런의 분리 및 Schwann 세포 전구체와의 공동 배양을 통해 Schwann 세포 생성

이 비디오는 배측근신경절(DRG) 뉴런과 슈반 세포의 공동 배양을 보여줍니다. DRG 뉴런은 정렬된 축삭 성장을 위해 미리 늘어난 막에서 먼저 성장합니다. 그런 다음 슈반 세포(Schwann cell)를 도입하여 축삭돌기에 부착하여 축삭을 절연하고 신경 세포의 생존과 기능을 촉진합니다.

Pre-Stretched Membrane에서 Schwann 세포와 DRG 뉴런의 공동 배양

이 비디오는 등쪽 뿌리 신경절 이식과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 보여줍니다. 공동 배양 조건에서 아스코르브산은 슈반 세포가 수초화 형태로 분화되는 것을 촉진합니다. 슈반(Schwann) 세포는 축삭돌기를 여러 번 감싸 신경 기능에 필수적인 미엘린 수초(myelin sheath)를 만듭니다.

Neuron Myelination을 위한 Schwann Cells와 Dorsal Root Ganglion Explant의 공동 배양

이 비디오는 쥐의 좌골 신경 섬유에서 슈반 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

마우스 좌골 신경에서 슈반 세포의 자기 분리

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

이 프로토콜은 랫트에서 분리된 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리와 축삭 정렬을 향상시키기 위한 정적 사전 스트레치 세포 배양 시스템에서 DRG 뉴런의 배양을 설명하며, 이후 슈반 세포(SC)의 공동 배양은 수초화를 촉진합니다.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

이 프로토콜은 마우스 등뿌리신경절(DRG)의 전체 마운트 및 해리 배양을 확립하는 방법과 종양-신경 상호 작용을 평가하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

배우세요 쥐 등쪽 뿌리 신경절과 슈반 세포 공동 배양을 통한 말초 신경계 수초화 연구 방법. 이 시험관 내 모델은 축삭-슈반 세포 상호작용 분석 및 신경퇴행성 질환 치료제 선별에 활용됩니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

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