Name: 신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 인간 대뇌 오가노이드에 신경 세포를 이식하고 장기간 추적하는 방법을. iPSC 유래 신경 전구세포의 이식 및 형광 현미경을 활용하여 세포 기능과 약물 반응을 평가할 수 있습니다.

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이 작업을 위한 기금은 Marcelle and Jean Coutu 재단과 Fonds de recherche du Québec - Santé(FRQS #295647)의 IRIC 자선 기금을 통해 제공되었습니다. D.J.H.F.K.는 Chercheurs-boursiers Junior 1 펠로우십(#283502)의 형태로 FRQS로부터 급여 지원을 받습니다. M.I.I.R.은 면역학 및 암 연구소(Institut of Research in Immunology and Cancer)의 IRIC 박사상(IRIC Doctoral Award), 몬트리올 대학교(University of Montreal)의 Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat, Bourse de Mérite aux cycles supérieurs의 지원을 받았습니다.

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중추신경계 손상/신경퇴행성 질환 1,2,3,4,5,6,7,8 치료를 위한 세포 치료 접근법에 대한 상당한 관심을 감안할 때 이식 환경에서 세포 기능 모델이 중요해지고 있습니다. 이 논문은 조직학 및 면역형광 염색을 통한 살아있는 세포 추적 및 종말점 평가와 함께 표지된 인간 NPC를 인간 대뇌 오가노이드에 이식하는 방법을 제시합니다. 중요한 것은 이식된 세포가 오가노이드 환경에서 이동, 분화 및 장기(4개월) 지속성이 가능하다는 것을 보여주었다는 것입니다. 이러한 장기적 지속성은 뇌절편 배양(brain slice cultures)의 유지가능성에 비해 현저하게 증가한다17. 따라서 이 시스템은 생존, 증식 및 분화와 같은 잠재적인 치료 환경에서 평가해야 하는 많은 행동을 검사하는 데 적합합니다. 실제로, 최근 직교 연구에서는 이식된 NPC가 NSG 마우스 뇌에 이식된 NPC와 비교하여 대뇌 오가노이드에서 유사하게 행동한다는 것을 입증했으며,20 따라서 이식 수혜자로서 오가노이드의 유용성을 확인했습니다. 이것은 시험관 시스템이기 때문에 사이토카인 또는 관심 약물을 추가하는 것도 간단합니다. 이것은 염증 및 면역 억제제와 같은 특정 환경이 이식된 세포에 미치는 영향을 더 잘 이해하여 치료 환경에서 발생할 수 있는 것을 더욱 모방하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 시연한 주기적 면역형광 프로토콜(이전 연구21 기반)은 이 접근법의 힘을 더욱 확장하여 단일 섹션에서 다양한 계통 및 잠재적으로 질병 특이적 마커를 동시에 평가할 수 있으므로 이식된 세포와 조직에 미치는 영향을 정확하게 추적할 수 있습니다. 물론 분석 목표에 따라 다른 종점 평가 방법을 대신 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 형태학이 주요 관심사인 경우 3D 재구성을 통한 조직 투명화를 사용할 수 있으며, 특정 세포 유형의 정량화가 최종 목표인 경우 유세포 분석에 따른 해리를 사용할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 CNS 종양과 같은 다른 세포 유형으로 쉽게 확장될 수 있을 것으로 기대하며, 잠재적으로 미세환경적으로 관련된 맥락에서 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 유사하게, 수용체로 사용된 오가노이드는 질병 모델 오가노이드25,26,27로 교환될 수 있으며, 잠재적으로 이러한 상태에 대한 이식 접근법의 모델링을 가능하게 할 수 있습니다.
모든 모델과 마찬가지로 여기에 제시된 모델에도 고유한 한계가 있습니다. 우선, iPSC 유래 오가노이드는 발달적으로 미성숙하기 때문에19 많은 신경퇴행성 질환이 나타나는 노화된 뇌와 비교하여 중요한 차이점이 있습니다. 대뇌 오가노이드는 또한 발달 과정에서 균일하지 않기 때문에(19) 동일한 생리학적 틈새에 일관된 주입을 할 수 없다. 더욱이, 이들은 관련 뇌 영역(18,19)의 세포 유형을 포함하지만, 생체 내 환경(14)에서도 중요한 내피, 미세아교세포 및 면역 성분이 결여되어 있다. 이것은 숙주가 세포 이식에 어떻게 반응할 것인지에 대한 연구를 제한합니다. 혈관28 및 미세아교세포29 세포를 추가하고 오가노이드 일관성 및 국소화(18)를 증가시켜 오가노이드 이식 시스템의 모델링 성능을 향상시키는 기술이 현재 상용화되고 있습니다. 그러나 여기에 제시된 것 이상의 추가 테스트 및 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 특수 장비가 필요하지 않지만 주입 깊이와 같은 여러 가지 중요한 기술적 고려 사항이 남아 있습니다. 이는 오가노이드가 관류되지 않기 때문에 너무 커지면 괴사 중심이 생기는 경우가 많고(19) 빛이 살아있는 세포 추적을 위해 오가노이드 코어를 통과할 수 없기 때문입니다. 따라서 너무 깊숙이 주입된 세포와 내부로 이동한 콜로니를 놓칠 수 있습니다. 이는 조직 침투율이 더 좋은 장파장 형광단(30)을 사용하여 개선할 수 있지만, 오가노이드 크기 및 검출 장치에 따라 이는 고려 사항으로 남아 있을 수 있습니다. 마지막으로, 뇌 오가노이드는 발달 상태에 있기 때문에 이식 시기는 또 다른 주요 고려 사항인데, 이는 오가노이드가 주입되는 오가노이드의 발달 단계에 따라 환경이 달라질 수 있기 때문입니다. 이는 주입 시 일관된 오가노이드 연령을 보장함으로써 어느 정도 제어할 수 있지만, 의심할 여지 없이 고려해야 할 요소입니다.
이 프로토콜은 저렴하고 간단하며 동물이 없으며 특수 장비가 필요하지 않으므로 다양한 실험실에서 이식 모델링에 액세스할 수 있습니다. 신경 세포 치료제와 오가노이드 모델 시스템의 빠른 발전 속도로 인해 여기에 제시된 오가노이드 이식 프로토콜은 다양한 질병 및 치료 접근법에 유용한 모델이 될 것으로 예상됩니다.

인간의 뇌는 신경 및 신경교 계통의 여러 세포 유형으로 구성된 복잡한 기관입니다. 이들은 함께 인지를 유발하는 정교한 네트워크를 형성합니다. 외상성 뇌 손상(TBI)1,2, 신경 퇴행성 질환 3,4,5,6,7 및 뇌졸중8을 포함한 다양한 신경 장애에 대한 치료법으로 이 시스템에 세포를 이식하는 데 상당한 관심이 있습니다. 그러나 이러한 전략의 발전에 있어 한 가지 주요 한계는 예상되는 이식 결과를 결정하기 위해 사용 가능한 전임상 모델이 상대적으로 부족하다는 것입니다. 현재 가장 많이 사용되는 모델은 세포 전위를 결정하고 마우스에 이종 이식을 하기 위한 체외 배양 방법입니다. 세포 배양 방법은 분화 및 자가재생 가능성을 평가할 수 있지만9, 이는 이식 상황에서 세포가 직면할 수 있는 미세환경을 모방하지 않는 최적의 성장 조건에서 수행된다. 더욱이, 세포가 성장하는 방식은 세포의 행동에 영향을 미칠 수 있다10.
생쥐의 뇌는 미세환경의 모든 세포를 포함하고 있으며, 따라서 이식을 위한 매우 강력한 모델 시스템이다11. 그러나 생쥐와 인간 피질 사이에는 중요한 차이점이 있으며,12,13 모든 성장 인자가 종 간에 교차 반응하는 것은 아닙니다. 영장류 모델은 인간 시스템을 더 잘 모방할 수 있는 더 가까운 대안이며 중요한 전임상 결과도 산출했다14. 그러나 더 밀접하게 관련된 이러한 친척들조차도 세포 구성에서 중요한 차이점을 유지한다15. 이 두 모델 시스템 모두 이식 중 세포 행동에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 최종 치료의 수술 요소를 통합하지만 불완전한 상태로 남아 있습니다. 또한 비용이 많이 들고 기술적으로 까다롭기 때문에(즉, 동물에게 뇌 수술을 수행해야 함) 가능한 처리량이 제한됩니다. 더욱이, 인간의 뇌세포를 동물에게 이식하는 것과 관련된 수많은 윤리적 문제가 있다16. 뇌 절편 배양은 하나의 뇌를 잘라 여러 치료에 사용할 수 있으므로 동물 이식의 한계 중 일부를 제거합니다. 그러나, 이들은 제한된 수명(주)을 가지며, 여전히 동물-유래이며, (얇은 절편이기 때문에) 세포(17)의 주입을 모방하기에 충분한 부피/표면 무결성을 갖지 않는다. 따라서 엄격한 세포 배양/전위 모델과 생체 내 이식 사이에는 중요한 격차가 남아 있습니다.
대뇌 오가노이드는 뇌에 존재하는 주요 신경 세포 유형을 포함하는 체외 모델이며 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 많은 수로 생성될 수 있습니다18,19. 따라서 이러한 오가노이드는 이식 환경에서 관심 있는 테스트 세포의 기능적 능력을 평가할 수 있는 세포 컨텍스트를 제공합니다. 실제로, 최근 연구에 따르면 인간 대뇌 오가노이드에 이식된 신경 전구 세포(NPC)는 n명의 비만 당뇨병 환자의 뇌에 이식된 NPC와 유사하게 생존, 증식 및 분화합니다 20. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌의 세포 유형을 포착하는 잔인하지 않고 수명이 길며(>6개월) 비용 효율적인 시스템을 나타냅니다. 따라서 그들은 신경 세포의 재생 능력에 대한 초기 단계 테스트를 위한 이상적인 이식 수혜자가 될 수 있습니다.
이 논문은 표지된 인간 NPC를 인간 대뇌 오가노이드에 이식하고 후속 추적하기 위한 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이는 GFP 표지 NPC를 성숙한(2-4개월) 대뇌 오가노이드(18)에 주입하는 것으로 시작된다. 이식된 세포는 4개월 동안 살아있는 세포 형광 현미경 검사를 받습니다. 이 시간 동안 주입 부위에서 세포의 지속성뿐만 아니라 오가노이드의 원위 영역으로의 이동도 보여줍니다. 종점에서는 이전 연구21을 기반으로 추가 염색 및 이미징 라운드를 허용하기 위해 기존 AlexaFluor 기반 염료의 퀀칭 프로토콜을 포함하여 이러한 오가노이드에서 파생된 조직학적 절편의 항원 회수, 염색 및 이미징을 시연합니다. 따라서 이 프로토콜은 이식 환경에서 세포의 분화 능력, 이식 내구성, 제자리 세포 확장 및 이식 부위로부터의 세포 이동을 측정하는 데 유용할 수 있습니다. 이는 재생 의학/세포 치료 응용 분야뿐만 아니라 종양 세포를 관련 부위 특이적 오가노이드에 생착하여 종양 모델링에 유용할 것으로 예상됩니다.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>단백질 분해-콜라겐 분해 효소 혼합물</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP 항체</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP 항체 (clone SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (클론 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulin &beta; 3 (TUBB3) (클론 TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid Monohydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek-Denaturated</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ethyl Alcohol (Anhydrous)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>성장 인자 감소 (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Phenol Red-free, LDEV-free</td></tr><tr><td>MX35 마이크로톰 블레이드&nbsp;</td><td>에프레디아&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; 스테인리스 스틸 베이스 몰드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE 생검 처리/임베딩 카세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 전뇌 뉴런 분화 키트</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Progenitor Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi 신경 유도 키트</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Tissue</td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; AI 조직 처리기</td><td>Sakura Finetek-Toluene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(histological)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blue; 0.4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

세포 이식 접근법의 발전에는 이식된 세포의 기능적 효능을 정확하게 평가할 수 있는 모델 시스템이 필요합니다. 중추 신경계의 경우, 이종 이식이 여전히 최첨단이지만, 이러한 모델은 기술적으로 까다롭고 처리량이 제한적이며 비용이 많이 듭니다. 더욱이, 존재하는 환경 신호는 인간 세포와 완벽하게 교차 반응하지 않습니다. 이 논문은 인간 신경 세포를 인간 대뇌 오가노이드에 이식하고 추적하기 위한 저렴하고 접근 가능하며 처리량이 높은 호환 모델을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 상용 키트를 사용하여 인간 유도 만능 줄기세포에서 쉽게 생성할 수 있으며 대뇌의 주요 세포 유형을 포함합니다. 
먼저 EGFP 표지 인간 iPSC 유래 신경 전구 세포(NPC)를 이러한 오가노이드에 주입하여 이 이식 프로토콜을 시연합니다. 다음으로 살아있는 세포 형광 현미경으로 오가노이드에서 이러한 세포의 성장을 추적하기 위한 고려 사항에 대해 논의하고 4개월 동안 오가노이드에서 이식된 EGFP 표지 NPC의 추적을 보여줍니다. 마지막으로, 절편, 주기적 면역형광 염색 및 이식된 세포의 국소적 맥락에서 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 오가노이드 이식 모델을 사용하면 저렴하고 수행하기 쉬운 프로토콜을 사용하여 인간 미세환경에서 직접 이식된 인간 세포를 장기간(최소 4개월) 추적할 수 있습니다. 따라서 이는 신경 세포 치료(이식)와 중추 신경계(CNS) 종양을 보다 미세환경적으로 정확한 방식으로 모델링하는 데 유용한 모델입니다.

대뇌 오가노이드 정체성의 검증으로, 성숙한(2개월) 대뇌 오가노이드의 조직학적 절편을 PAX6(등쪽 NPC23의 마커) 및 SATB2(성숙, 유사분열 후, 상층 뉴런24의 마커)에 대해 염색했습니다. 예상대로 PAX6+ 세포는 오가노이드 내부에 존재하고 SATB2+ 세포는 상층에 존재했습니다(그림 2). 이러한 결과는 사용된 대뇌 오가노이드가 실제로 분화 키트에 명시된 대로 등쪽 전뇌였다는 것을 뒷받침합니다. 대뇌 오가노이드 이식 시스템의 용량 의존성을 확립하기 위해 2개월 된 대뇌 오가노이드에 EGFP+ iPSC 유래 NPC를 주입했습니다. 입력 세포 수에 대한 GFP 형광의 명확한 용량 의존성이 존재했으며, 10,000개 이상의 세포에서 일관된 EGFP+ 세포 패치 검출이 있었습니다(그림 3). 이식된 NPC의 지속성과 이동은 시간이 지남에 따라 이식된 오가노이드를 추적하여 다음으로 평가되었습니다. 이를 위해 50,000마리의 iPSC 유래 EGFP+ NPC를 동일한 iPSC 계통에서 생성된 2-3개월 된 뇌 오가노이드에 이식했습니다. 주입된 오가노이드 및 대조군은 향후 3-4개월 동안 표시된 시점에서 EGFP 양성에 대해 이미지화되었습니다. 이 이식 시리즈에서는 4개월의 추적 기간 동안 주입된 부위의 지속성을 관찰했습니다(그림 4A). 추가 EGFP+ 세포 패치는 이식 후 9일 후에 나타나고 연구 종점(오가노이드에 따라 3-4개월)까지 지속되어 세포의 이동과 새로운 부위에서의 통합을 나타냅니다(그림 4A). 더 높은 배율에서 오가노이드에 긴 돌출부로 명확한 신경 형태를 관찰할 수 있었으며(그림 4B), 주입된 세포의 통합을 확인했습니다.
주입된 세포의 분화 상태를 주입 후 늦게 결정하기 위해 4개월 추적 오가노이드와 그 대조군을 고정하고 파라핀을 포매한 다음 15μm 두께의 조각으로 절단하고 유리 슬라이드에 장착했습니다. 그런 다음 슬라이스를 한 번의 형광 염색(EGFP, TUJ1, NESTIN) 또는 두 번의 연속 염색 주기로 처리하고 염색하여 추가 마커(MAP2, GFAP)를 추가했습니다. 초기 1회 염색에서는 NPC 상태를 유지하는 세포(NESTIN+TUJ1−)와 신경 운명으로 분화한 세포(NESTIN−TUJ1+)의 혼합물을 포함하여 주사 부위에 EGFP+ 세포의 존재가 확인되었습니다(그림 5). 대조군과 주입된 오가노이드 모두에서 매우 적은 수의 NESTIN+ NPC가 관찰되었으며(전부는 아니지만 대부분 주입 부위의 EGFP+ 이식 NPC임), TUJ1+ 미성숙 뉴런의 대다수가 관찰되었습니다(그림 5). 2차 염색을 통해 오가노이드의 외부 영역 대부분에 성숙한 뉴런(NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−)이 나타나고 미성숙한(NESTIN-TUJ1+MAP2−GFAP−) 뉴런 영역이 중간으로 향합니다(그림 6A,B). 성상교세포(NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+)는 주입된 오가노이드와 대조군 오가노이드 모두에 존재했으며 바깥쪽 가장자리 주위에 산재되어 있었습니다(그림 6A,B). 주입된 오가노이드에서 2라운드 염색을 수행한 절편은 성숙한 뉴런의 표현형을 채택한 주입 부위에서 멀리 떨어진 EGFP+ 세포의 작은 위성 콜로니를 보여주었습니다(그림 6B,C). 이들 중 일부는 성상교세포(astrocyte)에 근접한 것으로 나타났다. 그러나 GFAP 염색과 완전히 겹치는 EGFP+ 세포는 없었으며, 이는 성상교세포 자체를 생성하기보다는 인접해 있음을 시사합니다(그림 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> 그림 1: 표지된 세포를 대뇌 오가노이드에 이식한 모델. 렌티바이러스 형질도입에 의한 표지된 세포의 생성, 대뇌 오가노이드로의 이식, 살아있는 세포 이미징 및 면역형광에 의한 추적에 대한 개략적인 개요. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> 그림 2: 초기 및 후기 오가노이드의 구조를 보여주는 조직학적 절편의 면역형광. 2개월 된 뇌 오가노이드를 고정하고, 파라핀을 내장하고, 슬라이스하고, PAX6, SATB2 및 DAPI로 염색했습니다. 염색되지 않은 절편은 자가형광의 위양성 신호를 피하기 위해 노출 및 통합 시간을 설정하는 데 사용되었습니다. PAX6+ 세포는 오가노이드 내부에 존재했고, SATB2+ 세포는 상층에 존재했습니다. Z-stack 이미지는 전체 15μm 조직 절편을 통해 4.2μm마다 촬영되었습니다. 광학 섹션은 기본 옵션과 함께 Gen5 소프트웨어의 초점 스태킹 옵션을 사용하여 결합되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: PAX6 = 쌍을 이루는 상자 6 단백질; SATB2 = 특별한 AT가 풍부한 서열 결합 단백질 2; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> 그림 3: NPC를 대뇌 오가노이드에 투여 의존적으로 생착. 오가노이드는 0개(음성 대조군), 1,000개, 5,000개, 10,000개 또는 50,000개의 GFP+ iPSC 유래 NPC를 이식했습니다. 이식 후 1주일에 오가노이드를 GFP 필터 큐브를 사용하여 Cytation 5에서 이미지화했습니다. 네거티브 대조군은 자가형광을 최소화하기 위해 노출 및 통합 시간을 설정하는 데 사용되었습니다. 색상이 어두울수록 음성 대조군에 비해 더 많은 EGFP 형광을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 전체 오가노이드의 4x 이미지입니다. 이미징 후, 오가노이드 전체의 가변 배경 강도를 보정하기 위해 디스플레이 전에 픽셀 반경 50의 롤링볼 배경 빼기를 수행했습니다. 가장 높은 생착 부위로 식별된 주입 부위는 생착이 있는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 약어: NPC = 신경 전구 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; EGFP = 향상된 GFP; iPSC = 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> 그림 4: 형광 살아있는 세포 이미징을 사용한 이식된 세포 성장, 이동 및 지속성 추적. (A) 대조군 및 이식된(50,000 GFP+ iPSC 유래 NPC) 오가노이드 후 두 개의 독립적인 이식 세트에서 2-4개월 동안 형광 생세포 이미징을 수행했습니다. 네거티브 대조군 오가노이드를 사용하여 노출 및 통합 시간을 설정하여 각 시점에서 자가형광을 최소화했습니다. EGFP 이미지는 이식 후 표시된 시간에 Cytation 5의 GFP 필터 큐브를 사용하여 캡처되었습니다. 색상이 어두울수록 해당 시점의 음수 대조군에 비해 더 많은 EGFP 형광을 나타냅니다. 픽셀 반경이 50인 롤링볼 배경 빼기는 오가노이드 전체의 가변 배경 강도를 보정하기 위해 디스플레이 전에 수행되었습니다. 오가노이드는 각 시점에서 거의 동일한 방향으로 배치되었으며, 디스플레이의 일관성과 이식된 세포 성장을 명확하게 보여주기 위해 이미지를 회전했습니다. 가장 빠른 시점에서 가장 높은 생착 영역으로 식별된 주입 부위는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 네거티브 컨트롤 오가노이드의 예가 그림 하단에 나와 있습니다. (B) 이식 후 1주차 및 15주차에 생착된 오가노이드의 예 20x 이미지를 보여줍니다. 신경돌기 가시성을 보장하기 위해 FIJI를 사용하여 표시하기 전에 국소 대비가 향상되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: NPC = 신경 전구 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; EGFP = 향상된 GFP; iPSC = 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> 그림 5: 이동 및 신경 분화와 함께 주입 부위에서 이식된 NPC의 지속성을 나타내는 조직학적 절편의 면역형광. (A) 비주입 및 (B) 이식된 오가노이드의 단일 채널 형광 이미지. 오른쪽의 오버레이된 이미지는 관심 있는 세 개의 채널(NESTIN, TUJ1 및 EGFP)을 보여주지만 DAPI는 포함하지 않습니다. 디스플레이 최소값은 음성 셀에서 신호를 제외하도록 설정되었습니다(주입되지 않은 대조군의 EGFP 및 알려진 마커 조합을 기반으로 하는 다른 채널에 대해 결정됨). 표시 최대값은 모든 세포에서 해당 항체에 대해 관찰된 가장 높은 신호를 기반으로 했습니다. 직접 비교할 수 있도록 주입되지 않은 오가노이드와 이식된 오가노이드 간에 표시 범위를 일정하게 유지했습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: NPC = 신경 전구 세포; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; TUJ1 = 베타-III 튜불린; EGFP = enhanced green fluorescent protein(향상된 녹색 형광 단백질). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> 그림 6: 조직학적 절편의 주기적 면역형광을 이용한 생착된 세포 분화 상태 및 국소화 평가. 비주입, (A) 연령 일치 및 (B) 이식된 오가노이드의 단일 채널 형광 이미지는 표시된 대로 1차 및 2차 염색에 대해 표시됩니다. 디스플레이 최소값은 음성 셀에서 신호를 제외하도록 설정되었습니다(주입되지 않은 대조군의 EGFP 및 알려진 마커 조합을 기반으로 하는 다른 채널에 대해 결정됨). 표시 최대값은 모든 세포에서 해당 항체에 대해 관찰된 가장 높은 신호를 기반으로 했습니다. 표시 범위(및 물론 이미징 매개변수)는 대조군과 주입된 오가노이드 간에 일정하게 유지되어 직접 비교할 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. 각 오가노이드의 각 염색 라운드에 대해 오버레이된 이미지(DAPI 제외)가 오른쪽에 표시됩니다. (B) 이미지 정합이 수행된 주입된 오가노이드의 경우, 모든 이미지는 두 염색 라운드에서 관찰된 영역으로 잘립니다. (나,씨) 주입된 오가노이드의 경우 EGFP+ 세포 영역은 파란색으로 윤곽선이 표시됩니다. 이미지 등록 중에 DAPI를 사용하여 기능을 일치시키는 방법에 대한 다이어그램이 (C)에 나와 있으며 등록된 이미지의 전체 병합이 이어집니다. 약어: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = 베타-III 튜불린; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; MAP2 = 미세소관 관련 단백질 2; GFAP = 신경교세포섬유산성 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>클론</td>
			<td>형광단</td>
			<td>농도</td>
		</tr><tr><td>안티 네스틴</td>
			<td>10C2 규격</td>
			<td>알렉사플루어 594</td>
			<td>1의 2,000</td>
		</tr><tr><td>안티 TUBB3</td>
			<td>투지1</td>
			<td>알렉사플루어 647</td>
			<td>1의 2,000</td>
		</tr><tr><td>안티 GFP</td>
			<td>FM264G (FM264G)</td>
			<td>알렉사플루어 488</td>
			<td>1의 200</td>
		</tr><tr><td>GFAP 방지</td>
			<td>재질 보기 SMI 25</td>
			<td>알렉사플루어 594</td>
			<td>1의 500</td>
		</tr><tr><td>안티 MAP2</td>
			<td>재질 보기 SMI 52</td>
			<td>알렉사플루어 488</td>
			<td>1의 1,000</td>
		</tr><tr><td>안티 PAX6</td>
			<td>영형18-1330</td>
			<td>알렉사플루어 647</td>
			<td>1의 100</td>
		</tr><tr><td>안티 SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>알렉사플루어 594</td>
			<td>1의 500</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 염색을 위한 항체 농도. 약어: TUBB3 = 베타-튜불린 III; GFP = 녹색 형광 단백질; GFAP = 신경교세포의 섬유성 산성 단백질; MAP2 = 미세소관 관련 단백질 2; PAX6 = 쌍을 이루는 상자 6 단백질; SATB2 = 특별한 AT-rich 염기서열 결합 단백질 2.

여기에서는 표지된 신경 세포를 인간 대뇌 오가노이드에 이식하고 추적하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

세포 치료에 대한 관심이 높아짐에 따라 이러한 세포의 기능을 평가하기 위한 새로운 방법이 필요합니다. 이 프로토콜은 신경 맥락에 대한 이러한 세포 생착에 대한 시험관 내 장기 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 구성 요소가 인간에서 유래했다는 것입니다.또한 생착을 쉽게 추적할 수 있고 오가노이드의 환경을 쉽게 변경할 수 있어 다양한 약물이나 치료제를 테스트할 수 있습니다. 이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 재능 있는 박사 과정 학생인 Iliana Ibanez입니다. 유도만능줄기세포 또는 iPSC 유래 신경전구세포(NPC)의 단세포 현탁액을 얼음에서 제거하고 섭씨 4도에서 5분간 300g으로 원심분리하는 것으로 시작합니다.상층액을 제거하고 세포 펠릿을 가용화된 기저막 매트릭스의 밀리리터당 3밀리그램으로 재현탁시켜 주입당 2마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 사용할 때까지 즉시 서스펜션을 얼음 위에 다시 놓으십시오. 섭씨 20도의 냉동실에서 미리 식힌 주사기를 얼음 양동이로 옮겨 나중에 사용할 수 있습니다.다음으로 인큐베이터에서 뇌 오가노이드 플레이트를 제거하고 넓은 보어 팁을 사용하여 오가노이드를 35mm 접시에 옮깁니다. 오가노이드를 안정화하고 주입을 용이하게 하려면 오가노이드를 손상시키지 않고 배지를 최대한 제거하십시오. 오가노이드가 들어 있는 35mm 접시를 해부 현미경 아래에 놓아 주입을 용이하게 합니다.오가노이드를 주입할 준비가 되면 냉각된 P20 피펫 팁을 사용하여 EGFP 표지된 NPC 세포를 부드럽게 재현탁시키고 이 세포 2마이크로리터를 사전 냉각된 멸균 유리 슬라이드로 옮깁니다. 얼음에서 미리 채워진 인슐린 주사기를 꺼내 바늘의 경사가 아래를 향하도록 하여 2마이크로리터의 세포 현탁액을 천천히 끌어올립니다. 현미경의 초점을 맞추기 전에 오가노이드가 들어 있는 접시의 뚜껑을 엽니다.한 손으로 접시를 잡고 바늘의 경사를 위로 올립니다. 그리고 다른 손으로 세포를 오가노이드 표면에 천천히 주입합니다. 세포를 주입한 후 뚜껑을 다시 접시에 넣고 주입된 오가노이드를 1-2분 동안 배양합니다.그런 다음 오가노이드 매질 500마이크로리터를 플레이트에 부드럽게 첨가한 후 오가노이드를 넓은 보어 팁이 있는 24웰 플레이트로 옮깁니다. 오가노이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀에 한 번씩 완전히 배지를 교체하여 배양합니다. 형광 현미경에 주입되지 않은 또는 음성 대조군 오가노이드를 로드합니다.그리고 조명 강도를 1과 2 사이로 설정하고 노출 시간을 80에서 100밀리초 사이로 설정하여 자가형광을 최소화합니다. 다음으로, 양성 대조군 오가노이드를 로드하고 노출 시간을 높여 표지된 세포가 보이도록 합니다. 넓은 보어 피펫 팁으로 오가노이드의 위치를 변경하여 주입을 위한 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP 플러스 영역을 찾습니다.오가노이드를 로드하기 전에 오가노이드에서 배지를 완전히 제거합니다. 그리고 선택한 설정으로 이미지를 만듭니다. 이미징이 완료되면 오가노이드가 건조되는 것을 방지하기 위해 즉시 새 배지를 추가합니다.모든 오가노이드에 대해 배지 제거 및 이미징을 반복한 후 오가노이드를 정상 배양 및 배지 변화로 되돌립니다. 원하는 간격으로 이미징을 반복합니다. 톨루엔으로 채워진 코플린 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 2분 동안 넣고 이 단계를 반복합니다.그런 다음 유리 슬라이드를 100% 에틸 알코올로 채워진 유리 코플린 슬라이드 염색 용기에 2분 동안 옮깁니다. 그리고 슬라이드를 2분 동안 물을 채운 코플린 항아리로 옮기기 전에 이 단계를 반복합니다. 물로 씻기를 반복하십시오.그런 다음 플라스틱 용기를 수조에 넣고 플라스틱이 수조 바닥에 닿지 않도록 합니다. 플라스틱 용기 안에 구연산염 완충액을 붓고 섭씨 95도에서 100도에 도달하도록 합니다. 버퍼가 원하는 온도에 도달하면 슬라이드를 버퍼 안에 넣고 뚜껑으로 용기를 느슨하게 덮고 슬라이드를 수조 안에 30-40분 동안 둡니다.배양 후 수조에서 플라스틱 용기를 꺼내 실온에서 20분 동안 식힙니다. PBS로 슬라이드를 각각 2분씩 세 번 세척합니다. 샘플을 만지지 않고 종이 티슈로 PBS를 제거합니다.투과화 완충액을 준비하고 유리 슬라이드 염색 용기를 채웁니다. 슬라이드를 투과화 완충액에 담그고 10분 동안 배양합니다. PBS를 각각 2분씩 3회 반복합니다.그런 다음 각 샘플을 덮을 염색 혼합물을 준비하고 오가노이드 슬라이드에 25마이크로리터를 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 후 PBS를 각각 2분 동안 세 번 세척하고 유리 슬라이드 염색 용기 안에 증류수로 슬라이드를 헹구어 염분을 제거합니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미징하기 전에 각 샘플에 10마이크로리터의 액체 마운트와 DAPI를 추가합니다.2X 담금질 완충액으로 반쯤 채워진 유리 코플린 염색 용기에 PBS 45ml를 넣고 이 용기 안에 슬라이드를 넣습니다. 항아리를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 염색 및 이미징을 반복하기 전에 형광단이 효과적으로 소멸되었는지 확인합니다.GFP 형광의 명확한 복용량 의존은 10, 000의 세포에 세포 헝겊 조각 탐지 플러스 일관된 EGFP와 더불어 입력 세포 수에, 출석했다. EGFP 양성을 위해 이미징된 주입된 오가노이드 및 대조군은 4개월의 추적 기간 동안 주입된 부위의 지속성을 보여주었습니다. 추가 EGFP 양성 세포 패치는 이식 후 9일 후에 나타났고 연구 종점까지 지속되어 세포의 이동과 새로운 부위에서의 통합을 나타냅니다.더 높은 배율에서는 오가노이드에 긴 돌출부로 명확한 신경 형태를 관찰할 수 있어 주입된 세포의 통합을 확인할 수 있었습니다. 초기 단일 라운드 염색에서 NPC 상태를 유지하는 세포와 신경 운명으로 분화한 세포의 혼합물을 포함하여 주사 부위에 EGFP 플러스 세포의 존재가 확인되었습니다. 대조군과 주입된 오가노이드의 경우, 네스틴과 NPC가 거의 관찰되지 않았으며, TUJ1과 미성숙한 성숙 뉴런이 대부분이었습니다.두 개의 원형 염색은 오가노이드의 바깥쪽 영역 대부분에 성숙한 뉴런을 드러내고 미성숙한 뉴런 영역은 중간을 향해 더 자세히 설명했습니다. 성상교세포(astrocyte)는 주입된 오가노이드와 대조군 오가노이드에 존재했으며, 바깥쪽 가장자리 주위에 산재되어 있었다. 주입된 오가노이드에서 두 개의 라운드 염색을 수행한 절편은 성숙한 뉴런의 표현형을 채택한 주입 부위에서 멀리 떨어진 EGFP 플러스 세포의 작은 위성 콜로니를 보여주었습니다.이 군집 중 일부는 성상교세포(astrocyte) 근처에 있는 것으로 보인다. 그러나, GFP 염색에 완전히 겹치는 EGFP 플러스 세포는 성상교세포를 생성하기보다는 오히려 인접해 있다는 것을 건의하지 않았습니다. 오가노이드를 주입할 때 오가노이드를 완전히 파괴할 수 있으므로 너무 많은 힘을 가하거나 너무 빨리 주입하는 것을 피해야 합니다.따라서 수명 추적 후 오가노이드를 연결하여 유세포 분석 또는 단일 세포 염기서열 분석 접근법에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 세포의 분자 상태를 알 수 있습니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환에 대한 세포 치료를 발전시키고 뇌종양이나 전이를 모델링하는 데 매우 유용할 수 있습니다.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Palma-Tortosa, S., et.al. 인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서 성인 인간 피질의 기관형 배양. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 줄기 세포 유래 신경 전구 세포를 인간 피질 조직 절편으로 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 기저막 기질에서 전구 세포를 분리하고 재현탁한 다음 트랜스웰 어셈블리에 배치된 피질 절편에 주입하는 작업이 포함됩니다. 기질 응고 및 신경 분화를 허용하기 위해 배양한 후 이식된 조직은 추가 분석을 위해 준비됩니다.

줄기 세포 유래 신경 전구 세포를 인간 피질 절편으로 이식

출처: Ibanez-Rios, M.I., et al., 신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 세포-기질 혼합물을 사용하여 형광 표지된 신경 전구 세포(NPC)를 인간 대뇌 오가노이드에 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 재현 가능하고 동물이 없어 오가노이드 중단을 최소화하면서 이식이 가능합니다. 이는 신경 이식 및 중추신경계(CNS) 질환을 모델링하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

이식 모델링을 위한 인간 대뇌 오가노이드에 형광 신경 전구 세포 주입

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 연구는 1) 인간 에서독점적으로 인간 신경 유기 체 내 인간 교모세포종 개발 및 2) 뉴런 도파민성 연구를 위한 관련 및 정확한 모델로 두 개의 특정 인간 신경 오르가노이드를 도출하는 프로토콜을 소개하고 기술합니다. 3차원 오르가노이드를 생성하는 분화.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.

체외에서 뇌 신경 노화를 모델링하기위한 피질 뇌 오가노이드의 강력하고 재현 가능한 생성

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

여기에서는 전기천공법에 의한 절쇄된 인간 피질 오가노이드의 급성 유전자 조작을 제시합니다. 이러한 피질 오가노이드 모델은 절단 후 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 특히 주입이 용이하여 인간의 피질 발달, 신경 발달 장애 및 피질 진화에 대한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

배우세요 인간 대뇌 오가노이드에 신경 세포를 이식하고 장기간 추적하는 방법을. iPSC 유래 신경 전구세포의 이식 및 형광 현미경을 활용하여 세포 기능과 약물 반응을 평가할 수 있습니다.

신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델

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