Name: 변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 변형된 ELISA를 사용하여 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 방법을. 고형상 추출과 차단 버퍼를 적용하여 비특이적 결합을 제한하고 정확한 측정이 가능합니다.

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이 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해주신 Robert N. Cole, Lauren R. DeVine, Marcos Iglesias에게 감사드립니다. 이는 미국 이비인후과 학회(Fellowship Grant, PSK), 미국 청력 연구 재단(90066548/90072266, JPC), 국립 보건원(NIH)의 구성 요소인 국립 중개 과학 발전 센터(NCATS) 및 NIH 의학 연구 로드맵(UL1 TR003098, NSF)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 Johns Hopkins ICTR, NCATS 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

이 프로토콜은 Johns Hopkins Institutional Review Board(NA_00092491)의 승인을 받아 동의한 개인의 인간 혈장 샘플을 사용하여 개발되었습니다.
1. 시료 채취 및 준비
<ol><li>표준 정맥 천자 방법34를 통해 전주복 정맥에서 5mL의 전혈을 6mL 진공 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수집 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>표적 펩티드의 용해를 막기 위하여 수집 후에 관에 aprotinin (10,000 KIU/mL)의 aprotinin (10,000 KIU/mL) 경쟁적인 세린 프로테아제 저해제의 0.5 mL를 추가하십시오. 아프로티닌이 혈액과 적절하게 섞일 수 있도록 튜브를 10번 뒤집습니다. 그런 다음 다음 단계까지 튜브를 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>혈액 수집 후 60분 이내에 4°C에서 4분 동안 튜브를 604 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫으로 혈장 분획을 제거하고 2mL 둥근 바닥 멸균 극저온 생물로 옮깁니다.</li>
	<li>극저온 난자를 즉시 -80°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.</li>
</ol>2. 혈장 시료 추출
<ol><li>추출 카트리지를 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브 안에 넣고 카트리지의 외부 돌출부가 튜브의 외부 돌출부로 지지되도록 합니다.</li>
	<li>먼저 5mL의 100% 메탄올을 통과시킨 다음 10mL의 초순수를 카트리지에 통과시켜 카트리지를 활성화합니다.<ol><li>유체가 중력 구동 흐름을 통해 카트리지를 통과하면 튜브에 모입니다.</li>
		<li>액체가 카트리지를 삼키지 않도록 과도한 액체가 쌓이면 버리십시오.</li>
		<li>실험 과정에서 카트리지가 마르지 않는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>혈장 250μL를 4% 아세트산 750μL로 희석합니다.</li>
	<li>1mL의 혈장과 아세트산 용액을 카트리지에 천천히 통과시킵니다. 알림: 이 단계는 통과된 각 밀리리터에 대해 중력 구동 흐름을 통해 약 30초가 소요됩니다.</li>
	<li>카트리지를 4% 아세트산 10mL로 세척합니다. 이전과 마찬가지로 액체가 카트리지를 삼키지 않도록 축적된 초과 유체를 버리십시오.</li>
	<li>카트리지에서 마지막 아세트산 한 방울을 제거한 후 튜브에서 카트리지를 꺼내 새 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>4% 아세트산 2.7mL와 100% 메탄올 0.3mL를 혼합하여 100% 메탄올과 4% 아세트산의 10:1 용액을 준비한다. 이 용액을 한 번에 1mL의 카트리지에 통과시켜 CGRP를 용출시키는 데 사용하십시오. 통과 된 각 밀리리터의 용액 사이에 25 분 동안 일시 중지하십시오. 용리액을 버리지 마십시오.</li>
	<li>튜브에는 메탄올과 아세트산 용액의 마지막 밀리리터가 통과한 후 25분 후에 용출된 유체 3mL가 들어 있습니다. 각 1mL의 용리액을 1.7mL 미세원심분리기 튜브에 넣습니다. 알림: 이렇게 하면 각 카트리지에서 3개의 미세 원심분리기 튜브가 생성됩니다.</li>
	<li>각 튜브를 미니 원심분리기에 1초 동안 넣어 모든 용리액이 각 튜브의 바닥에 오도록 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 진공 원심 분리로 모든 샘플을 건조시킵니다 (수용액의 경우 1,400 rpm에서 농축기 기능으로 설정, g- 힘은 튜브의 위치에 따라 달라 지므로 130-250 x g 범위). 알림: 진공 원심분리기가 샘플을 건조하는 데 걸리는 시간은 사용되는 미세 원심분리기 튜브의 유형에 따라 다릅니다.</li>
	<li>분석 절차(단계 4.1)를 진행하기 직전에, 실온(RT) 또는 20°C로 해동된 효소면역분석법(EIA) 완충액( 재료 표 참조)으로 이전에 건조된 샘플을 재구성한다. 알림: 건조된 샘플을 재구성하는 데 사용되는 EIA 버퍼의 부피는 원래 샘플과 같아야 합니다.amp부피 또는 250μL.</li>
</ol>3. ELISA 플레이트의 제조 - 비특이적 결합을 제한하기 위한 차단
<ol><li>플레이트의 각 웰에 250μL의 트리스 완충 식염수(TBS)/생선 젤라틴 차단 완충액을 추가합니다.</li>
	<li>플레이트 위에 커버 시트를 놓고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>커버 시트를 제거하고 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인으로 플레이트를 비웁니다. 그런 다음 종이 타월로 접시를 닦아 액체의 흔적을 버립니다.</li>
	<li>플레이트를 층류 후드에 10분 동안 그대로 두어 플레이트를 건조시킵니다.</li>
	<li>플레이트가 눈에 띄게 건조되면 실리카겔 건조제 봉지와 함께 그립 밀봉 호일 파우치에 넣고 파우치를 -20°C에서 24시간 동안 보관합니다. 참고: 플레이트는 플레이트 배양 후 4주 이내에 사용해야 합니다.</li>
</ol>4. 분석 절차 전
<ol><li>키트 지침에 따라 시약 (EIA 버퍼, CGRP 표준, CGRP 품질 관리, CGRP 추적기, 세척 버퍼)을 준비하십시오. 16-20 시간 배양 기간이 끝난 후에 만 Ellman의 시약을 준비하십시오.</li>
	<li>모든 샘플을 해동하고 나머지 프로토콜을 수행하기 전에 RT로 시약을 투여합니다.</li>
</ol>5. 분석 절차
<ol><li>키트에서 제공하는 세척 완충액(300μL/웰)으로 차단된 플레이트의 각 웰을 5회 헹굽니다. 각 헹굼에 대해 세척 버퍼를 웰에 넣은 후 30초 동안 일시 중지한 다음 액체를 버리거나 다중 채널 피펫을 사용하여 흡인합니다.</li>
	<li>최종 헹굼 후, 반전(웰 내의 액체를 배출하기 위해 플레이트 반전) 또는 다중 채널 피펫을 사용한 흡인에 의해 웰에서 모든 완충액을 제거합니다. 마지막 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거 될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다.</li>
	<li>"블랭크" 웰로 알려진 시약이나 완충액이 없는 웰을 최소 2개 이상 따로 보관하십시오. 그런 다음 비특이적 결합(NSB)을 위해 적어도 두 개의 다른 웰을 따로 보관하십시오.</li>
	<li>100μL의 EIA 버퍼를 각 NSB 웰에 분배합니다.</li>
	<li>100 μL의 CGRP 표준물질을 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.</li>
	<li>100 μL의 시료(EIA 완충액에서 재구성됨)와 품질 관리를 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.</li>
	<li>100 μL의 CGRP 추적자 (아세틸 콜린 에스테라아제에 부착 된 항 -CGRP 항체)를 NSB, CGRP 표준물질, 샘플 및 품질 관리가 포함 된 각 웰에 분배합니다. "블랭크" 웰에 추적기를 분배하지 마십시오.</li>
	<li>투명 커버 시트를 사용하여 플레이트를 덮고 각 웰의 샘플과 시약이 크게 증발하지 않도록 각 웰을 밀봉합니다. 플레이트를 4°C에서 16-20시간 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>배양이 완료된 후 키트 지침에 따라 Ellman의 시약을 재구성합니다.</li>
	<li>플레이트를 뒤집어 모든 액체를 제거합니다. 각 웰(위에서 설명한 대로)을 300μL의 세척 완충액으로 3회 헹굽니다.</li>
	<li>세 번째 헹굼 후 플레이트에서 액체를 제거하고 플레이트를 셰이커 플레이트에 놓고 120rpm에서 2분 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>접시를 세 번 더 씻으십시오. 최종 헹굼 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인에 의해 웰로부터 모든 완충액을 제거한다. 마지막 액체 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다. 알림: ELISA 마이크로플레이트 세척기를 사용하는 경우 이 단계에서 설명한 추가 3회 세척이 필요하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>Ellman의 시약 200μL을 각 웰에 분주합니다("블랭크" 웰 제외).</li>
	<li>새 커버 시트로 플레이트를 덮고 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출되지 않도록 합니다. RT에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>마른 종이 타월로 뒷면을 닦아 분광 광도계 판독을 혼란스럽게 할 수 있는 플레이트 뒷면에 액체가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>플레이트의 405nm(노란색)에서의 흡광도를 판독합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>각 "Blank", NSB, 표준물질, 품질 관리 및 샘플에 대한 평균 흡광도를 계산합니다.</li>
	<li>표준물질, 품질 관리 및 시료 흡광도 값에서 NSB 평균 흡광도 값을 뺍니다.</li>
	<li>y축에 흡광도를, x축에 농도를 표시합니다. 4개 매개변수 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 표준 곡선을 구성합니다.</li>
	<li>곡선이 구성되면 곡선의 방정식을 사용하여 품질 관리 및 샘플에 대한 보간된 농도를 결정하며, 이는 x축에서 읽을 수 있습니다. 알림: 표준 곡선은 품질 관리를 위해 계산된 보간 농도가 예상 농도의 25% 이내인 경우에만 검증됩니다(일반적으로 125pg/mL이지만 품질 관리 바이알의 라벨 참조).</li>
</ol>

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이 기사에서는 인간 혈장에서 CGRP의 검출 및 정량화를 허용하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상용 CGRP ELISA 키트가이 분자를 정확하게 정량화하지 못하는 것으로 밝혀진 후에 합성되었습니다. 샘플 준비 프로토콜과 유효한 표준 곡선을 확립한 후, 희석 실험의 스파이크 및 회수율 및 선형성은 회수율이 예상보다 훨씬 낮다는 것을 보여주었다. 상이한 상용 CGRP ELISA 키트를 사용하여 유사한 결과가 발견되었다(표 4). 참고로 널리 인정되는 표준 회수율은 80-120%36입니다. 이러한 결과는 CGRP에 결합하는 다른 분자 인 CGRP21,22,23,24를 분해하는 프로테아제 활성의 존재를 시사하여 플레...

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 혈관주위 국소화가 있는 뉴런 섬유와 비뉴런 조직에 존재하는 37개 아미노산 뉴로펩타이드입니다. CGRP의 두 가지 형태 인 α-CGRP와 β-CGRP는 90 % 이상의 상 동성을 공유하고 생리 기능을 공유합니다. 그러나 αCGRP는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 발견되는 반면 βCGRP는 장 신경계에서 발견됩니다 1,2. 통각 수용체 활성화 및 칼슘 의존성 엑소 사이토 시스시, CGRP는 뉴런에서 방출되어 동맥 혈관 확장 및 혈장 단백질 유출을 포함하는 무균 신경 인성 염증을 유도합니다 3,4,5,6,7. 여기에서 CGRP는 모세 혈관 후 혈관에 나타나며 편두통 8,9,10,11과 같은 구 심성 통각 수용 활성화를 유발하는 질병에 대한 바이오 마커 일 수 있습니다. 참고로, CGRP는 혈관 신생 및 면역 조절에서의 역할을 통해 COVID-19와 관련이 있으며 바람직하지 않은 질병 진화를 예측할 수 있습니다12,13. 따라서, 인간 혈장에서 CGRP의 정확한 정량화를위한 프로토콜은 광범위한 가치를 가질 수있다.
편두통에서 CGRP의 역할에 가장 많은 관심을 기울였을 것입니다. 전임상 및 임상 연구를 기반으로 CGRP는 편두통에 대한 가능한 바이오 마커 및 치료 표적으로 제시되었습니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 일부 연구에서는 대조군 참가자10,14,15에 비해 일시적인 편두통이 있는 코호트에서 CGRP의 상승을 발견했습니다. 편두통 치료를위한 임상 시험에서 CGRP 억제제의 성공은 편두통의 원인 인자로서 CGRP 상승을 암시하는 것으로 보인다. 그러나 모든 조사자가 이러한 결과를 확증한 것은 아닙니다(16,17,18,19). 또한, 편두통의 비 두통 증상에서 CGRP의 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 현재의 연구는 편두통의 전정 증상에서 CGRP의 역할을 이해하고자하는 열망에 의해 동기가 부여되었습니다.
문헌에서 일관되지 않은 CGRP 면역 분석 데이터는 몇 가지 이유 때문일 수 있습니다. 첫째, 말초 맥관 구조에서 CGRP의 반감기는 세린 프로테아제 21, 인슐린 분해 효소 및 기타 메탈로 프로테아제 22, 중성 엔도 펩티다아제 23 및 엔도 텔린 전환 효소 -1 24의 활성으로 인해 6.9 분 20이다. 둘째, CGRP를 정량화하는 데 사용되는 면역 측정법의 다양한 기술적 세부 사항은 그러한 연구에서 완전히 설명되지 않았습니다. 마지막으로, 면역 분석 방법론의 표준화 부족은 그림을 더욱 복잡하게 만듭니다.
이 기사에서는 인간 혈장에서 α- 및 βCGRP의 정제 및 정확한 정량화를 허용하는 수정된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜에 대해 설명합니다. 키트의 항체는 아밀린, 칼시토닌 또는 물질 P와 교차 반응하지 않습니다. 이 프로토콜은 스파이크 및 회수 및 희석의 선형성과 같은 필요한 검증 실험을 거쳤으며, 이에 대한 데이터는 여기에 제시되어 있습니다. 검증을 거친 이러한 CGRP ELISA 프로토콜은 이전에 문헌에 완전히 설명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 편두통뿐만 아니라심장 2,25, 피부과 26, 산부인과 27, 류마티스28,29, 근골격계30,31, 내분비 32,33 및 바이러스 성 질환12,13의 맥락에서 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL Safeseal 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sorenson Bioscience, Inc.</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>99% 메탄올</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13255.0F</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>2mL 둥근 바닥 멸균 cryovials</td><td>CRYO. S</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>4% 아세트산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>035572.K2</td><td></td></tr><tr><td>6.0mL Vacutainer EDTA 수집 튜브</td><td>BD</td><td>367863</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 64R 탁상용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>367586</tr><tr><td>아프로티닌</td><td>VWR</td><td>76344-814</td><td></td></tr><tr><td>CGRP(인간) ELISA 키트</td><td>Bertin 바이오시약</td><td>A05481</td><td></td></tr><tr><td>CGRP 재고</td><td>Bertin 바이오시약</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EIA 버퍼</td><td>Bertin 바이오시약</td><td>A07000</td><td></td></tr><tr><td>Ellman의 시약</td><td>Bertin 바이오시약</td><td>A09000_49+1</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 3 cc Vac 카트리지</td><td>Waters</td><td>WAT094226</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Bellco</td><td>7744-01010</td><td></td></tr><tr><td>정밀 마이크로피펫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F144055MG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M 시리즈 멀티모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>부품 번호 M2</td><td></td></tr><tr><td>TBS/ 피</td><td>셔 사이언티픽</td><td>50-199-167</td><td></td></tr><tr><td>초순수 ELISA 등급</td><td>Bertin 생물 시약</td><td>A07001</td><td></td></tr><tr><td>진공 버섯 플러스 - 원심 분리기</td><td>농축기 Eppendorf</td><td>22820109</td><td></td></tr><tr><td>세척 버퍼</td><td>Bertin 생물 시약</td><td>A17000</td><td></td></tr></tbody></table>

변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(cgrp)의 검출 및 정량화

Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 편두통의 병태생리학에서 추정되는 역할을 하는 혈관활성 신경펩타이드이며 바이오마커 상태의 후보가 될 수 있습니다. CGRP는 활성화시 신경 섬유에서 방출되어 삼차 원심성 신경 분포를받는 혈관 구조에서 멸균 신경 인성 염증 및 동맥 혈관 확장을 유도합니다. 말초 맥관 구조에서 CGRP의 존재는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 단백질체 분석을 사용하여 인간 혈장에서이 신경 펩티드를 검출하고 정량화하기위한 연구에 박차를 가했다. 그러나 6.9분의 반감기와 종종 완전히 설명되지 않은 분석 프로토콜의 기술적 세부 사항의 가변성으로 인해 문헌에서 일관되지 않은 CGRP ELISA 데이터가 생성되었습니다. 여기서, 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정량화를위한 수정 된 ELISA 프로토콜이 제시된다. 절차적 단계에는 시료 수집 및 준비, 정제 수단으로 극성 흡착제를 사용한 추출, 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계, ELISA를 통한 정량화가 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성으로 검증되었습니다. 이 검증 된 프로토콜은 이론적으로 편두통뿐만 아니라 CGRP가 역할을 할 수있는 다른 질병이있는 개인의 혈장에서 CGRP 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜에는 강조해야 할 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 세린 프로테아제 억제제 인 아프로티닌은 CGRP의 추가 효소 분해를 방지하기 위해 수집 즉시 전혈 샘플에 첨가되어야합니다. 세린 프로테아제는 CGRP 대사에 중요한 역할을하는 것으로 나타 났으며, 이전 연구에서는 인간21,35에서 CGRP를 정량화하는 데 아 프로 티닌을 사용했습니다. 프로테아제 억제제를 사용하지 않고 샘플 준비가 60 분 이상 걸리면 ELISA를 수행 할 때 CGRP 수치가 감소 할 것으로 예상 할 수 있습니다. 둘째, ELISA 이전의 고체상 추출은 용리액에 CGRP를 농축시키고 혈장 매트릭스에서 잠재적으로 간섭하는 분자를 제거합니다. 이 추출 단계는 스파이크 및 회수 실험에서 CGRP의 수율을 증가시킵니다 (다음 섹션에서 자세히 설명). 추출 후 냉장실에서의 진공 원심 분리는 CGRP의 손실을 더욱 제한합니다. 셋째, ELISA 전에 차단 ...

인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 농도와 관련된 발표된 데이터는 일관성이 없습니다. 이러한 불일치는 이 신경펩티드를 정량화하기 위한 표준화되고 검증된 방법론이 없기 때문일 수 있습니다. 여기에서는 인간 혈장에서 CGRP를 정제하고 정량화하기 위한 검증된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜을 설명합니다.

변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) is a vasoactive neuropeptide that plays a putative role in the pathophysiology of migraine headaches and may be a ...

이 수정 된 ELISA 프로토콜은 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정확한 정량화를 가능하게합니다. 필요한 검증 실험을 거쳤으며 향후 정량화 방법론을 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 상당한 프로테아제 분해 전에 샘플 처리, 고체상 추출을 통한 정제 및 마이크로타이터 플레이트에 차단 완충액을 적용하여 비특이적 결합을 제한하는 이점을 제공합니다.CGRP는 편두통의 병태생리학에서 징벌적 역할을 하며 아마도 바이오마커 상태의 후보일 수 있습니다. 또한 심장학적, 피부과적, 바이러스, 심지어 COVID-19 관련 질병 과정에도 연루되어 있습니다. 시작하려면 표준 정맥 천자 방법을 통해 전주복 정맥에서 5 밀리리터의 전혈을 6 밀리리터 진공 청소기 EDTA 튜브로 수집합니다.표적 펩티드의 용해를 차단하기 위해, 0.5 밀리리터의 아프로티닌 경쟁적 세린 프로테아제 억제제를 첨가한다. 튜브를 10번 뒤집고 다음 단계까지 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 4분 동안 600 4g에서 원심분리합니다.혈장 분획을 2 밀리리터 둥근 바닥 멸균 저온 바이알에 옮긴다. 극저온 바이알을 섭씨 영하 80도에서 최대 2주 동안 즉시 보관하십시오. 혈장 샘플을 추출하려면 추출 카트리지를 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브 안에 넣습니다.5 밀리리터의 100 % 메탄올을 통과시킨 다음 10 밀리리터의 초순수를 카트리지에 통과시켜 활성화합니다. 유체는 중력 구동 흐름에 의해 카트리지를 통과할 때 튜브에 수집됩니다. 축적된 초과 유체가 카트리지를 삼키는 것을 방지하고 실험 중에 건조되지 않도록 폐기하십시오.250 마이크로 리터의 플라즈마를 750 마이크로 리터의 4 % 아세트산에 희석하고 천천히 카트리지를 통과시킵니다. 그런 다음 카트리지를 10 밀리리터의 아세트산으로 세척하십시오. 여분의 액체가 제거되면 카트리지를 새 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.3 밀리리터의 메탄올 아세트산 용액을 준비하여 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 또는 CGRP를 용출시킵니다. 카트리지에 1 밀리리터를 통과시키고 각 용출 사이에 25 분 동안 기다리십시오. 마지막 용출 후, 튜브는 3 밀리리터의 총 용리액을 함유한다.용리액 1ml를 1.7 milliliter 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 미니 원심분리기에서 1초 동안 회전시켜 용리액을 침전시킵니다. 그런 다음 진공 원심 분리기에서 1, 400 RPM 및 섭씨 4도에서 샘플을 건조시킵니다. 분석 직전에 건조된 샘플을 해동된 효소 면역분석법 또는 EIA 완충액으로 재구성합니다.플레이트 차단을 위해, 250 마이크로리터의 TBS 피쉬 젤라틴 블로킹 버퍼를 각 웰에 첨가한다. 플레이트 위에 커버 시트를 놓고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 커버 시트를 제거하고 뒤집어서 플레이트를 비우십시오.그런 다음 종이 타월로 판을 닦아 미량의 액체를 버리고 층류 후드에서 10분 동안 건조시킵니다. 플레이트가 눈에 띄게 건조되면 실리카겔 건조제 봉지와 함께 그립 밀봉 호일 파우치에 넣습니다. 섭씨 영하 20도에서 24시간 동안 보관하세요.분석을 수행하기 전에 모든 샘플과 준비된 시약을 실온에서 해동합니다. 블록 플레이트의 웰을 헹구려면 300마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 30초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 세척 버퍼를 버리고 헹굼을 5회 반복합니다.마지막 헹굼 후 이전에 설명한대로 플레이트를 닦아냅니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 EIA 버퍼를 전용 2개의 비특이적 결합 또는 NSB 웰에 분배한다. 100 마이크로 리터의 CGRP 표준을 추가 한 다음 재구성 된 샘플과 품질 관리를 적절한 웰에 복제합니다.빈 웰을 제외한 각 웰에 100 마이크로 리터의 CGRP 추적자를 추가하십시오. 마지막으로 투명 커버 시트를 사용하여 플레이트를 밀봉하여 샘플과 시약이 증발하지 않도록 하고 섭씨 4도에서 16-20시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 Ellman의 시약을 준비하십시오.접시가 기울어지면 앞에서 설명한 대로 각 우물을 세 번 씻습니다. 마지막 헹굼 후 플레이트를 120RPM에서 2분 동안 흔듭니다. 다시 접시를 세 번 헹구고 물기를 닦아냅니다.액체가 웰에서 눈에 띄게 제거될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 Ellman 시약을 빈 웰을 제외한 각 웰에 추가합니다. 플레이트가 덮이면 알루미늄 호일로 싸서 빛 노출을 방지하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양한 후 흡광도를 기록합니다.본 연구는 블로킹 단계를 추가하면, 각 CGRP 스파이크 샘플에서의 회수율이 허용 범위 내에 있음을 입증하였다. 그러나, 차단 단계가 배제되었을 때, 비특이적 결합은 125 %의 상한을 초과하는 회수율을 초래했다CGRP 분해를 제한하기 위해 수집 직후 혈액 샘플을 보유하기 위해 아프로 티닌을 첨가하는 것이 중요하다. 추가적으로, 블로킹 완충액은 비특이적 결합을 더욱 감소시키기 위해 ELISA 전에 마이크로타이터 플레이트에 첨가되어야 한다.따라서 이 프로토콜은 편두통 및 전정 편두통이 있는 혈장 환자와 대조군의 CGRP 수준을 정량화하여 전정 편두통의 바이오마커로서 CGRP의 후보를 탐색하는 데 활용될 수 있습니다.

detection-quantification-calcitonin-gene-related-peptide-cgrp-human

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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여기서 우리는 CGRP 및 phalloidin을 이용한 면역형광 및 형광 히스토화학을 사용하여 두개골 듀라 메이트에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)-면역반응성 신경 섬유 및 혈관의 공간 상관관계를 시각화하는 프로토콜을 각각 제시한다. 또한, 이러한 신경 섬유의 기원은 형광 신경 추적자로 역행하였다.

면역 형광 및 신경 추적을 가진 쥐 두개골 듀라 마터의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 면역 반응성 내적 내부 발산 시각화

본 프로토콜은 생체 외 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 방출 모델 및 설치류의 삼차 혈관계에서 방출되는 CGRP의 양에 대한 약리학 적 제제의 효과를 정량화하는 전략을 설명합니다.

생체 외 설치류의 삼차 혈관 시스템에서 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드의 방출

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

새로운 anti-HER2 단클론 항체를 사용하여 검증된 샌드위치 ELISA 분석을 제시합니다. 이 분석을 통해 체외 배양 세포 및 혈액 및 조직을 포함한 기타 샘플에서 세포 결합 및 방출 HER2 단백질을 정밀하게 정량화할 수 있습니다.

세포에서 방출되고 세포에 결합하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2의 포괄적인 측정을 위한 검증된 면역화학 분석

이 프로토콜은 경쟁력 있는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 고형 조직의 고리형 구아노신 일인산염(cGMP) 농도를 측정합니다. 이 프로토콜은 고형 조직을 처리하고, 경쟁력 있는 ELISA를 수행하고, 흡광도를 밀리리터당 피코몰 단위의 cGMP 농도로 변환하고, 최종 농도를 조직 그램당 cGMP 나노몰로 계산하는 방법을 설명합니다.

ELISA(Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 사용한 고형 조직의 cGMP(Cyclic Guanosine Monophosphate) 측정

배우세요 변형된 ELISA를 사용하여 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 방법을. 고형상 추출과 차단 버퍼를 적용하여 비특이적 결합을 제한하고 정확한 측정이 가능합니다.

변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화

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