Name: 확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 배우세요 쥐 콜로노이드 분리 및 3D 배양 기술을 활용한 장 상피 염증 반응 연구 방법입니다. 이 프로토콜은 염증성 장 질환의 장벽 기능과 질병 상태를 정확하게 모델링하여 새로운 치료 전략 개발에 기여합니다.

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확립된 쥐 대장에 대한 장 염증의 상피 효과

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%3A+The+epithelial+barrier+and+its+relationship+with+mucosal+immunity+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
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<li>Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+and+ex+vivo+systems+used+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Models%22%5BJournal%5D)">In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease.</a> In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).</li>
<li>Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammopharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease: A review.</a> Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).</li>
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<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Dotti, I., Salas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+human+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+niche%3A+Homeostasis+and+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations.</a> Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li>
<li>Wilson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+culture+conditions+for+improved+growth+and+functional+differentiation+of+mouse+and+human+colon+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).</li>
<li>Cunningham, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B3+coactivator+1-%CE%B1+%28PGC1%CE%B1%29+protects+against+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Julian, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelium+is+more+susceptible+to+cytopathic+injury+and+altered+permeability+than+the+lung+epithelium+in+the+context+of+acute+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).</li>
<li>Haberman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis+mucosal+transcriptomes+reveal+mitochondriopathy+and+personalized+mechanisms+underlying+disease+severity+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response.</a> Nature Communications. 10, 38(2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+plays+opposite+roles+in+the+initiation+and+progression+of+colitis-associated+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer.</a> Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).</li>
<li>Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+CMV+in+the+gut+of+HIV-infected+individuals+and+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).</li>
<li>Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+Intestinal+mucosal+defense+and+inflammation%3A+Learning+from+clinical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).</li>
<li>Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+stem+cells+are+indispensable+for+radiation-induced+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+reprogramming+of+colonic+epithelium+links+ECM+remodeling+to+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Komiya, Y., Habas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signal transduction pathways.</a> Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).</li>
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오가노이드 개발은 과학계가 접시에 담긴 동물이나 인간의 세포 구조와 기능을 부분적으로 요약할 수 있는 능력으로 체외에서 장기 시스템을 연구하는 방식에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 질병이 있는 인간에게서 파생된 오가노이드 시스템은 치료 의사 결정을 안내할 수 있는 개인화된 의학을 위한 유망한 도구를 제공합니다. 여기에서는 잘 작동하는 크립트 격리 프로토콜에 대해 설명하고 도금 전에 격리에서 과도한 파편을 청소할 수 있는 주요 단계를 소개합니다. 또한 이 과정에서 종종 간과되는 주요 세부 사항, 즉 도금을 위한 크립트를 정확하게 계산하는 능력에 대해 설명합니다. 결장세포가 확립되면 IBD 동안 장 상피의 변화를 연구하는 능력을 향상시킬 수 있는 세포 분화 또는 단층 형성을 허용하는 주요 조작에 대해 간략하게 설명합니다.
포유류의 결장 상피에 있는 crypt-villus 축은 서로 다른 기능을 가진 서로 다른 세포 유형으로 구성된 복잡한 구조입니다. 이 축의 유지는 내...

염증성 장 질환(IBD)은 염증 및 임상적 정지 에피소드를 특징으로 하는 만성, 완화 및 재발성 질환입니다. IBD의 병인은 다인성이지만, 이 질환의 주요 특징은 상피 구획 내에서 활성화된 전염증성 신호 캐스케이드 외에도 장벽 기능 결함과 장 상피의 투과성 증가를 포함한다 1,2. 염증의 세포 배양 및 쥐 모델을 포함하여 IBD 동안 상피 반응을 요약하기 위해 여러 시험관 내 및 생체 내 모델이 사용되었습니다3. 그러나, 이들 모든 시스템은 IBD4 동안 상피 변화를 요약하는 능력을 제한하는 중요한 단점을 가지고 있다. IBD 연구에 사용되는 대부분의 세포주는 형질전환되고, 단층을 형성할 수 있는 능력을 가지며,3개를 분화시킬 수 있지만 숙주에서 형질전환되지 않은 장 상피 세포와 본질적으로 다르게 증식합니다. 염증의 여러 다른 쥐 모델이 IBD를 연구하는 데 사용되며, 그 중 일부는 녹아웃 모델, 감염성 모델, 화학적 염증 모델 및 T 세포 전달 모델 5,6,7,8을 포함합니다. 각각은 유전적 소인, 장벽 기능 장애, 면역 조절 완화 및 미생물군집과 같은 IBD의 특정 병인학적 측면을 연구할 수 있지만 질병의 다인성 특성을 연구하는 능력에는 한계가 있습니다.
엔테로이드 및 콜로노이드를 포함한 장 오가노이드는 지난 10년 동안 장 줄기 세포의 역학뿐만 아니라 장 항상성 및 질병에서 장 상피의 역할, 장벽 무결성 및 기능을 연구하기 위한 유용한 시험관 내 모델로 확립되었습니다. 이러한 실체는 IBD9의 발병기전에 대한 우리의 이해에 크게 기여했으며 개인화된 의학을 위한 새로운 기회를 열었습니다. 대장에서 줄기 세포 유래 자가 조직화 배양물인 콜로노이드(Colonoids)는 쥐와 인간 조직 모두에서 개발되어 장 선와(intestinal crypt) 내에 위치한 줄기세포가 번식하고 무기한 유지될 수 있도록 하는 과정이다10. 생체 내 줄기 세포 틈새는 성장을 지원하기 위해 세포외 인자, 특히 표준 Wnt 신호 전달 및 뼈 형태 형성 단백질 신호 전달 경로에 의존합니다11. 이러한 인자의 추가는 콜로노이드의 건강과 수명을 촉진할 뿐만 아니라 자가 재생 세포와 말단 분화 세포 모두로 구성된 생체 내 상피 세포 구조를 반영하지 않는 줄기 세포와 유사한 상태로 배양을 유도합니다12,13. 장 상피의 기능은 줄기 세포 구획과 분화된 세포 사이의 지속적인 누화에 의존하지만, 결장 배양 시스템에서 둘 다를 갖는 능력은 상당히 제한적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 오가노이드 배양 시스템은 생체 외 상피의 고유 특성을 연구하기 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 당면한 과학적 질문에 답하기 위해 대안적 문화 전략을 고려해야 할 수도 있습니다.
덱스트란 황산나트륨(DSS)을 7일 동안 지속적으로 투여한 쥐는 상피 염증과 장벽 기능 장애를 모두 발생시키는 것으로 나타났다14. 또한, 인간 IBD에서 명백한 것으로 밝혀진 장 상피 내의 미토콘드리아 생물 발생 실패 및 대사 재프로그래밍도 대장염의 DSS 모델에서도 포착되었습니다15. 그러나 우리의 예비 데이터는 미토콘드리아 생물 발생 실패의 특성이 DSS 처리 동물의 선와에서 파생된 콜로노이드에서 유지되지 않는다는 것을 보여줍니다(보충 그림 1). 따라서 쥐 장 염증 동안 염증이 상피 변화를 유발하는 방법을 조사할 때 대체 배양 방법을 사용해야 합니다. 여기에서 우리는 1) 쥐 콜로노이드의 확립을 위해 전체 결장 조직에서 선와를 분리하는 방법, 2) 생체 내 세포 집단을 반영하기 위해 이 세포 집단을 최종적으로 분화하는 방법, 3) 이 시험관 내 모델에서 염증을 유도하는 방법. 염증이 있는 상피 내에서 약물 상호작용을 연구하기 위해 우리는 염증 매개체로 기저적으로 치료하고 약물 요법으로 정점으로 치료할 수 있는 쥐 결장에서 2-디멘소날(2D) 단층을 설정하는 프로토콜을 개발했습니다.

<table><tbody><tr><td>0.4-&뮤; M 투명 트랜스웰, 24-웰</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662-641</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50-mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>70-&뮤; M 세포 여과기</td><td>VWR</td><td>76327-100</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>재고 농도(1x); 최종 농도 (1x)</td></tr><tr><td>B-27 보충제&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>주가 농도 (50x); 최종 농도 (1x)</td></tr> <tr><td>젓가락 전극 세트 EVO</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel GFR 멤브레인 믹스</td><td>Corning</td><td>354-230</td><td>재고 농도 (100 %); 최종 농도 (100 %)</td></tr> <tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>재고 농도 (1m); 최종 농도 (1.5 mM); 용제(초순수)</td></tr><tr><td>DMEM 고포도</td>당 <td>Thermo Fisher</td><td>11960-069</td><td>재고 농도(1x); 최종 농도 (1x)</td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14190-144</td><td>재고 농도 (1x); 최종 농도 (1x)</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(ETDA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7889</td><td>원료 농도(0.5 m); 최종 농도 (30 mM)</td></tr> <tr><td>소 태아 혈청</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150H</td><td>재고 농도 (100 %); 최종 농도 (1%)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드, 흰색, 25 x 75 mm</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-ga-1</td><td>최종 농도 (400 &마이크로; g/&마이크로; L)</td></tr> <tr><td>겐타마이신 시약</td><td>Gibco/Fisher</td><td>15750-060</td><td>스톡 농도(50mg/mL); 최종 집중 (250 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>재고 농도(100x); 최종 농도 (1x)</td></tr> <tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>재고 농도 (1 M); 최종 농도 (10 mM)</td></tr><tr><td>hIFN&gamma;</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td><td>스톡 농도(1000ng/&마이크로; L); 최종 농도 (10 ng / mL); 용매 (초순수)</td></tr> <tr><td>hIL-1&beta;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td>재고 농도(10ng/&마이크로; L); 최종 농도 (20 ng / mL); 용제 (초순수)</td></tr> <tr><td>hTNF &alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA</td><td>스톡 농도(10ng/&마이크로; L); 최종 농도 (40 ng / mL); 용제(초순수)</td></tr><tr><td>과산화수소&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>주식 집중도 (30%); 최종 농도 (0.003 %); 용제(마우스 세척 매체)</td></tr><tr><td>Hygromycin B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td>최종 농도(400 &마이크로; g/&마이크로; L)</td></tr><tr><td>L-WRN 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Novus</td><td>NBP2-35176</td><td>재고 농도 (0.5 &micro; g/&마이크로; L); 최종 농도 (50 ng / mL); 용매(D-PBS + 1% BSA)</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>스톡 농도(100x); 최종 농도 (1x)</td></tr> <tr><td>N- 아세틸 -L- 시스테인</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A9165-5G</td><td>재고 농도(500mM); 최종 농도 (1 mM); 용제 (초순수)</td></tr> <tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>재고 농도 (0.1 ng/&micro; L); 최종 농도 (100 ng / mL); 용제(초순수 + 0.1% BSA)</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td>스톡 농도(100x); 최종 농도 (1x)</td></tr> <tr><td>페트리 접시 (멸균, 100mm x 15mm) 폴리스 트렌 일회용</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로 플레이트, 24 웰 조직 배양 처리, 멸균</td><td>Greiner Bio-one</td><td>5666-2160</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>R & D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>재고 농도 (0.25 &micro; g/&마이크로; L); 최종 농도 (500 ng / mL); 용제(D-PBS + 1% BSA)</td></tr><tr><td>Tryp LE Express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604-013</td><td>스톡 농도(10x); 최종 농도 (1x); 용제(1mM EDTA)</td></tr><tr><td>초순수&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>재고 농도 (1x); 최종 농도 (1x)</td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드드로클로라이드&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td>재고 농도(10mM); 최종 농도 (10 &micro; M); 용제(초순수)</td></tr></tbody></table>

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

장 상피는 인체 건강에 필수적인 역할을 하며 숙주와 외부 환경 사이에 장벽을 제공합니다. 이 매우 역동적인 세포층은 미생물과 면역 집단 사이의 첫 번째 방어선을 제공하고 장 면역 반응을 조절하는 데 도움이 됩니다. 상피 장벽의 파괴는 염증성 장 질환(IBD)의 특징이며 치료 표적화에 관심이 있습니다. 3차원 결장 배양 시스템은 IBD 발병기전에서 장 줄기 세포 역학 및 상피 세포 생리학을 연구하는 데 매우 유용한 시험관 내 모델입니다. 이상적으로는 동물의 염증이 있는 상피 조직에서 콜로노이드를 확립하는 것이 질병에 대한 유전적 및 분자적 영향을 평가하는 데 가장 유익할 것입니다. 그러나, 우리는 생체 내 상피 변화가 급성 염증이 있는 마우스에서 확립된 콜로노이드에서 반드시 유지되는 것은 아니라는 것을 보여주었습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 IBD 동안 일반적으로 상승하는 염증 매개체의 칵테일로 콜로노이드를 치료하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 시스템은 다양한 배양 조건에 유비쿼터스로 적용될 수 있지만, 이 프로토콜은 차별화된 콜로노이드와 확립된 콜로노이드에서 파생된 2차원 단층 모두에 대한 처리를 강조합니다. 전통적인 배양 환경에서 콜로노이드는 장내 줄기 세포가 풍부하여 줄기 세포 틈새를 연구하기에 이상적인 환경을 제공합니다. 그러나 이 시스템은 장벽 기능과 같은 장 생리학의 특징을 분석할 수 없습니다. 또한, 전통적인 콜로노이드는 전염증성 자극에 대한 말단적으로 분화된 상피 세포의 세포 반응을 연구할 기회를 제공하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위한 대체 실험 프레임워크를 제공합니다. 2차원 단층 배양 시스템은 또한 생체 외에서 치료 약물 스크리닝을 위한 기회를 제공합니다. 이 편광된 세포층은 세포의 기저부에 있는 염증 매개체로 치료할 수 있으며 IBD 치료에서의 유용성을 결정하기 위해 정점적으로 추정 치료제와 병행할 수 있습니다.

3D 장 결장 배양 시스템은 장 점막 항상성에 대한 상피의 본질적인 기여를 연구하는 데 매우 중요한 도구입니다. 설명된 프로토콜은 8주령에 C57BL/6J(WT) 마우스에서 크립트를 분리하고 여러 다운스트림 애플리케이션을 위해 조작할 수 있는 장기 콜로노이드 배양 시스템을 구축하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 기저막 매트릭스에서 크립트를 분리하고 도금할 때, 크립드는 명시야 현미경으로 시각화할 때 구조가 조밀하고 다세포로 나타납니다. 그것들은 모양이 구형이거나 길쭉하고 원통형일 수 있으며, 생체 내 장 구조 내에서 일반적으로 관찰되는 단일 선와와 같은 구조와 유사합니다(그림 1A). 1일차까지 대부분의 선와가 조밀한 구형 구조를 형성하고 몇 개의 콜로노이드가 상피 세포가 없는 내부 내강(빈 공간)을 발달시키기 시작합니다(그림 1B). 다음 며칠 동안 계속 성장함에 따라 콜로노이드의 직경은 계속 증...

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

우리의 연구를 통해 우리는 쥐 콜로노이드가 기존의 콜로노이드 배양 시스템에서 어떻게 변형될 수 있는지 탐구하고, 장 생리학의 특정 측면과 염증이 있는 질병 상태가 있는 경우 그 변화를 연구하는 것을 목표로 합니다. 염증성 장 질환과 같은 질병 상태에서 장벽 기능 및 장 생리학을 연구하는 것은 줄기 세포 생리학만을 반영하는 전통적인 쥐 결장 배양 시스템을 사용할 때 제한적입니다. 우리의 프로토콜은 염증 매개체가 장 상피에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 수 있는 여러 기술을 독자에게 제공한다는 점에서 유리합니다.앞으로 우리 연구실은 장 생리학 및 질병, 특히 염증성 장 질환의 다양한 측면을 조사하기 위해 인간 대장 배양 시스템을 어떻게 변경할 수 있는지 이해하는 데 집중할 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

작은 동물 이미징 기술은 직렬 진단 시험 및 생체 내에서 치료 적 개입을 허용한다. 최근, 응용 프로그램의 범위가 크게 확대하고 현재 대장 종양 발생의 평가, 상처 치유 및 염증의 모니터링이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 내시경 검사의 이러한 다양한 응용 가능성을 보여줍니다.

에 대한 쥐의 내시경 생체 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

배우세요 쥐 콜로노이드 분리 및 3D 배양 기술을 활용한 장 상피 염증 반응 연구 방법입니다. 이 프로토콜은 염증성 장 질환의 장벽 기능과 질병 상태를 정확하게 모델링하여 새로운 치료 전략 개발에 기여합니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

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