Name: 전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 H9C2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9C2 심근 세포의 전압 의존적 칼륨 전류를 기록하는 방법을. 아코니틴의 심장독성 메커니즘을 이온 채널 관점에서 연구할 수 있습니다.

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중국 국립 자연 과학 재단 (82130113)과 칭하이 성 과학 기술부 (2020-SF-C33)의 핵심 R & D 및 혁신 프로그램의 재정 지원에 감사드립니다.

상업적으로 입수한 H9c2 래트 심근세포( 재료 표 참조)를 5%CO2 가습 분위기에서 37°C에서 10% 열불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 정상 H9c2 세포 및 4-AP- 또는 AC 처리 세포에서 IKb 의 변화를 감지했습니다 (그림 1 및 그림 2).
1. 용액 준비
<ol><li>10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 세포 배양 배지를 준비한다( 재료 표 참조).</li>
	<li>100μL의 DMSO 용액에 14.1165mg의 4-AP를 첨가하여 1.5 M 4-AP 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 세포외 용액을 첨가하여 1.5 M4-AP를 1.5 mM로 희석한다(단계 1.5).</li>
	<li>19.36μL의 DMSO 용액에 5mg의 AC를 첨가하여 400mM AC를 준비합니다( 재료 표 참조). 알림: 위의 모든 용액은 4°C 냉장고에 보관되었으며 DMSO의 최종 농도는 0.1%(v/v)를 초과해서는 안 됩니다.</li>
	<li>0.4100g의 KCl (110.0 mM), 0.0120 g의 MgCl 2 (1.2 mM), 0.1270 g의 Na2 ATP (5.0 mM), 0.1190 g의 HEPES (10.0 mM) 및 0.1900 g의 EGTA (10.0 mM)를 이중 증류수 50 mL에 첨가하여 50 mL의 세포 내 용액을 준비합니다 (표 1 및 재료 표 참조). 참고: 세포내 용액의 pH 값을 1M KOH를 사용하여 7.2로 조정하고 작은 부피(1.5-2mL)로 분취하여 -20°C에서 보관했습니다.</li>
	<li>이중 증류수 50mL에 KCl 0.0185g(5.0mM), NaCl 0.3945g(135.0mM), MgCl 0.0203g2·6H2O(2.0mM), hepes 0.0595g(5.0mM), D-포도당 0.0990g(10.0mM)을 첨가하여 세포외용액 50mL를 준비합니다(표 1 및 재료 표 참조). 알림: 세포 외 용액은 즉시 사용할 수 있도록 준비해야하며 pH 값은 7.4M NaOH를 사용하여 1로 조정해야합니다.</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>H9c2 배양 접시가 80% 합류하면 0.25% 트립신으로 세포를 30초 동안 소화합니다.</li>
	<li>5%CO2 분위기 및 70% - 80% 상대 습도로 37°C에서 24시간 동안 유리판으로 카펫이 깔린 35mm 접시에 일반 배지 또는 약물 함유 배지(25μM, 50μM, 100μM 및 200μM AC)로 2 x 105 cells/mL를 배양합니다(재료 표 참조).</li>
</ol>3. 마이크로 피펫 제작
<ol><li>마이크로피펫 풀러를 켜고( 재료 표 참조) 30분 동안 예열합니다.</li>
	<li>필라멘트(OD: 1.5mm, ID: 1.10mm, 길이 10cm)가 있는 붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러에 놓습니다. 3.3 단계에서 설정 한 프로그램을 선택하고 제어판에서 Enter 키를 클릭하십시오. 오른쪽 상단 모서리에 있는 램프 프로그램을 클릭하여 유리 모세관의 "열" 값을 결정합니다.</li>
	<li>"램프"테스트에 의해 결정된 값에 따라 전극을 당기는 프로그램을 작성하고 "열"값 = "램프"값, 풀 = 0, 벨 = 풀로드 이동 속도, 시간 = 200-250 단계를 사용하십시오. Pull( 당기기 )을 클릭하여 피펫 제작을 시작합니다. 알림: 사용하기 전에 마이크로피펫 풀러의 밀봉된 용기에 있는 건조제의 색상을 관찰하십시오. 색상이 파란색에서 분홍색으로 바뀌면 건조제를 교체해야합니다. 전극 팁의 오염을 방지하려면 피펫 준비 중에 유리 모세관의 중간 부분을 만지지 마십시오. 그런 다음 생산 된 피펫을 조심스럽게 제거하고 밀폐되고 밀봉 된 용기에 넣으십시오.</li>
</ol>4. 기기 설정
<ol><li>해당 기기를 디지털-아날로그 변환기, 신호 증폭기, 마이크로 매니퓰레이터, 현미경 및 카메라 순서로 켭니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>이미징 어플리케이션, 신호 증폭기 소프트웨어 및 데이터 수집 소프트웨어를 순차적으로 엽니다( 재료 표 참조). 알림: 기기는 순차적으로 켜야 합니다. 그렇지 않으면 소프트웨어를 연 후 "데모 디지타이저" 상태가 나타납니다.</li>
</ol>5. IKv 파라미터 설정
<ol><li>아래 단계에 따라 IKv 를 기록하기 위한 프로토콜을 편집합니다.<ol><li>Edit( 편집)를 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집을 선택합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>"파형"인터페이스에서 프로그램을 편집하십시오 : 에포크 A (첫 번째 레벨 = -60mV, 델타 레벨 = 0mV, 첫 번째 지속 시간 = 20ms 및 델타 지속 시간 = 0ms); 에포크 B(첫 번째 레벨 = -40mV, 델타 레벨 = 10mV, 첫 번째 지속 시간 = 150ms, 델타 지속 시간 = 0ms) 및 에포크 C(첫 번째 레벨 = -60mV, 델타 수준 = 0mV, 첫 번째 지속 시간 = 30ms, 델타 기간 = 0ms).</li>
		<li>그런 다음 모드/속도 인터페이스를 클릭하고 "시험 계층 구조" 데이터를 설정합니다: 시험 지연 = 0초, 실행 = 1, 스윕 = 11, 스윕 기간 = 0.22초22,23. 참고: 제어 조건에서 -60mV의 유지 전위에서 10mV씩 증가하여 -40mV에서 +60mV까지 150ms 탈분극 단계를 적용하여 IKv 채널 전류를 획득합니다. 프로토콜의 총 시간은 "파형"프로그램에 설정된 시간보다 커야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>P/N 누출 빼기 프로그램 편집: 프로토콜 편집을 클릭하여 자극 버튼을 선택하고 P/N 누출 빼 기 대화 상자에서 누출 빼기 프로그램을 설정합니다: 서브스윕 수 = 2-8(이 연구에서는 4), 안정화 시간 = 100-1,000ms(이 연구에서는 200), "극성" = "파형과 반대", 유지 레벨 = -80mV. 알림: P/N 누출 빼기는 "첫 번째 유지"(-60mV)보다 낮은 유지 수준을 가져야 합니다.</li>
</ol>6. 전압 클램프 모드에서 I Kv 의 전체 셀 패치 클램프 기록
<ol><li>데이터 저장 경로 설정: 파일을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일 이름 설정을 선택합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 Edit (Open Protocol)를 선택하고 Open Protocol을 클릭하여 설정된 IKv 프로토콜 (5.1 단계)을 엽니 다. 마지막으로 도구 옵션을 클릭하고 멤브레인 테스트를 선택하여 프로토콜 실행을 시작합니다.</li>
	<li>세포외 용액(단계 1.5)을 전체 세포 패치 클램프 장치( 재료 표 참조)의 세포 배스에 추가하고 H9c2 세포(단계 2.1에서 배양)와 함께 커버슬립을 수조에 위쪽으로 놓습니다.</li>
	<li>피펫(3단계에서 제작)의 30%를 세포외 용액으로 채우고 패치 클램프 장치에 통합된 기록 전극 홀더에 설치합니다. O-링 고무 가스켓과 플라스틱 와셔로 피펫을 조입니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터로 피펫을 욕조에 떨어 뜨립니다. 신호 증폭기 소프트웨어(재료 표 참조)의 파이펫 오프셋 인터페이스를 클릭하여 IKv 전류 기준선을 0pA로 유지합니다. 알림: 세포 내 용액(단계 1.4)은 은선의 AgCl/Ag 부분과 접촉해야 하며 은선은 피펫의 내벽에 가깝지 않아야 합니다. 피펫의 저항은 2-6 MΩ이어야합니다. 피펫 팁의 폐색을 방지하려면 플라스틱 튜브24를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0mL 주사기를 사용하여 연속 양압을 피펫에 전달해야 합니다.</li>
	<li>플라스틱 튜브를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0mL 주사기를 사용하여 적절한 양압을 수동으로 전달합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 3차원으로 조작하여 피펫을 약간 움직여 셀과 접촉합니다.</li>
	<li>피펫이 세포막에 닿은 후 막 테스트 구형파가 1/3에서 1/2로 떨어지면 양압을 제거하고 적절한 음압을 수동으로 전달합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 패치 인터페이스를 클릭하여 GΩ 씰을 형성합니다. 셀 밀봉 중에 "C p Fast" 및 "Cp Slow" 신호 증폭기 소프트웨어를 사용하여 빠르고 느린 정전 용량을 보상하십시오. 참고: 멤브레인 테스트가 ≥1GΩ이면 피펫 팁과 셀 사이에 셀 부착 구성이 형성됩니다.</li>
	<li>세포막의 패치를 파열시키기 위해 짧은 음압 펄스를 적용하십시오. 참고: 막 저항의 급격한 감소는 성공적인 전체 세포 기록 패턴을 특징짓습니다. 액세스 저항(Ra)이 ≥30MΩ이면, 셀들은 단계 6.3 내지 6.6을 위해 재선택되어야 한다. 기록된 IKv 데이터의 정확성을 보장하기 위해, 세포막이 파괴된 후에 음압이 제거되어야 한다.</li>
	<li>신호 증폭기 소프트웨어의 전체 셀 버튼을 클릭하여 전체 셀 멤브레인 커패시턴스 보상을 실행합니다. 마지막으로 데이터 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장하고 기록합니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어로 저장된 IKv 데이터를 엽니다. 전류-전압(I−V) 관계 저장: 분석을 클릭하여 통계를 선택하여 다음을 수행합니다: 데이터 분석을 위해 범위를 Cousors 1,2로 선택합니다. 피크 진폭 및 평균 버튼을 클릭한 다음 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 봅니다. 마지막으로, 추가 분석을 위해 IKv 평균 데이터의 열을 함수 그리기 소프트웨어(재료 표 참조)에 복사합니다.</li>
	<li>대표 IKv 현재 트레이스 저장: 편집을 클릭하여 트레이스 전송을 선택합니다. 그런 다음 전송할 지역에서 전체 추적을 선택합니다. 그런 다음 추적 선택에서 선택을 클릭하고 신호에서 IN 0 (pA)을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 "결과" 페이지에서 데이터를 보고 전체 데이터를 함수 그리기 소프트웨어에 복사하여 현재 추적을 그립니다.</li>
	<li>IKv 프로토콜 저장: 편집을 클릭하여 자극 파형 신호 생성을 선택하고 확인을 선택합니다. 그런 다음 "신호"에서 A0 # 0 (mA)을 선택하는 것을 제외하고 6.9 단계를 다시 실행하십시오.</li>
</ol>

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패치-클램프 전기생리학적 기술은 주로 세포막(25) 상의 이온 채널의 전기적 활성 및 기능적 특성을 기록하고 반영하는데 사용된다. 현재, 패치 클램프 기술의 주요 기록 방법은 단일 채널 기록 및 전체 셀 기록(26)을 포함한다. 전체 셀 모드의 경우, 유리 미세전극 및 음압은 세포막의 작은 영역과 피펫 팁(27) 사이에 고저항 밀봉을 형성하는데 사용된다. 지속적인 음압으로 인해 피펫의 팁이 세포막이 파열되고 막이 피펫의 내벽에 부착되면 피펫과 셀 사이에 형성된 완전한 전기 회로를 통해 세포막 표면에 개별 이온 채널의 전류 밀도를 기록할 수 있습니다(26,27). . 최근 몇 년 동안 전체 세포 패치 클램프 기술은 이온 채널 관련 질병을 표적으로 하는 약물 연구에 널리 사용되었습니다. 비록 그것이 조...

이온 채널은 세포막의 지질 이중층에 내장 된 특수 통합 단백질입니다. 활성화제의 존재 하에서, 이러한 특수 통합 단백질의 중심은 고도로 선택적인 친수성 기공을 형성하여, 적절한 크기 및 전하의 이온이 수동수송 방식으로 통과하도록 한다1. 이온 채널은 세포 흥분성과 생체 전기의 기초이며 다양한세포 활동에서 중요한 역할을 합니다2. 심장은 활동 전위3에 의해 시작된 흥분-수축 결합 과정으로 인한 규칙적인 수축을 통해 다른 기관에 혈액을 공급합니다. 이전 연구에 따르면 심근 세포의 활동 전위 생성은 세포 내 이온 농도의 변화로 인해 발생하며 인간 심근 세포에서 Na +,Ca 2+ 및 K + 이온 채널의 활성화 및 비활성화는 특정 시퀀스 4,5,6에서 활동 전위의 형성으로 이어집니다. 교란된 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널 전류(IKv)는 정상적인 심장 리듬을 변화시켜 주요 사망 원인 중 하나인 부정맥을 유발할 수 있습니다. 따라서 IKv를 기록하는 것은 생명을 위협하는 부정맥7을 치료하기위한 약물의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
Kv 채널은 칼륨 채널의 중요한 구성 요소입니다. Kv 채널의 배위 기능은 포유류 심장의 전기적 활동 및 심근 수축성에 중요한 역할을합니다 8,9,10. 심근 세포에서 활동 전위의 진폭과 지속 시간은 여러 Kv 채널 하위 유형11에 의한 외부 K + 전류의 공동 전도에 따라 달라집니다. Kv 채널 기능의 조절은 심장 활동 전위의 정상적인 재분극에 매우 중요합니다. Kv 전도도의 가장 작은 변화조차도 심장 재분극에 큰 영향을 미치고 부정맥12,13의 가능성을 증가시킵니다.
세포 전기생리학적 연구의 기본 방법을 나타내는 세포막의 작은 영역과 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 피펫 팁 사이의 고저항 밀봉은 음압을 적용하여 설정할 수 있습니다. 지속적인 음압은 세포막이 피펫 팁과 접촉하여 피펫의 내벽에 달라붙게 합니다. 결과적인 완전한 전기 회로는 세포막(14)의 표면을 가로지르는 임의의 단일 이온 채널 전류를 기록할 수 있게 한다. 이 기술은 세포막 이온 채널 전류에 대해 매우 높은 감도를 가지며 모든 이온 채널에서 전류를 감지하는 데 사용할 수 있으며 응용 분야는 매우 광범위합니다15. 또한, 형광 표지 및 방사성 표지와 비교하여, 패치 클램프는 더 높은 권위 및 정확도를 갖는다16. 현재 전체 셀 패치 클램프 기술은 Kv 채널 전류17,18,19에 작용하는 한의학 성분을 감지하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, Wang 등은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 연꽃 종자의 유효 성분이 활성화 된 상태 채널19를 차단함으로써 Kv4.3 채널의 억제를 달성 할 수 있음을 확인했습니다. Aconitine (AC)은 Aconitum carmichaeli Debx 및 Aconitum pendulum Busch와 같은 Aconitum 종의 효과적이고 활성 성분 중 하나입니다. 수많은 연구에 따르면 AC의 과다 복용은 부정맥과 심지어 심장 마비를 유발할 수 있습니다20. AC와 전압 게이트 이온 채널 사이의 상호 작용은 심장 독성21의 핵심 메커니즘 인 세포 내 이온 항상성의 파괴로 이어진다. 따라서이 연구에서는 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 심근 세포의 IKv에 대한 AC의 효과를 결정합니다.

<table><tbody><tr><td>4-아미노피리딘</td><td>시그마</td><td>MKCJ2184</td><td></td></tr><tr><td>Aconitine</td><td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td><td>DSTDW000602</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>축삭 기기</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius</td><td>124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>ATP Na2</td><td>Solarbio</td><td>416O022</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 붕규산 유리(O.D.: 1.5mm, I.D.: 1.10mm, 길이 10cm)&nbsp;</td><td>셔터 기기</td><td>163225-5</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (100mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (35mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>3012022</td><td></td></tr><tr><td>Clampex software</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>버전 10. 5</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 소프트웨어</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>버전 10. 6. 0. 13</td><td>데이터 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Rhawn</td><td>RH289133</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>Axon Instrument</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 modified eagle medium (1x)</td><td>Gibco</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Biofroxx</td><td>EZ6789D115</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>화염 / 갈색 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>모델 P-1000</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 세포</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0111</td><td></td></tr><tr><td>HCImageLive</td><td>Hamamatsu</td><td>4.5.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>쓰촨성 Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>2106081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td><td>20210221</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020082501</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020112601</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td><td>20160408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2021020101</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285A</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리(20 &times; 20 mm)</td><td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td><td>80340-0630</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>Milli-Q IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B 커맨더</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp 커맨더 2.0</td><td>신호 증폭기 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>OriginPro 8 소프트웨어</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>PH&nbsp; 미터&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>S201K</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25%(1x)</td><td>HyClone</td><td>J210045</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 h9c2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

심근 세포막의 칼륨 채널은 세포 전기 생리 학적 활동의 조절에 중요한 역할을합니다. 주요 이온 채널 중 하나인 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널은 약물로 인한 심근 손상 및 심근 경색과 같은 일부 심각한 심장 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 본 연구에서, H9c2 심근 세포에서 Kv 채널 전류 (IKv)에 대한 1.5 mM 4- 아미노 피리딘 (4-AP, 광범위 칼륨 채널 억제제) 및 아코 니틴 (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM)의 효과를 결정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하였다. 4-AP는 I Kv를 약 54% 억제한 반면, IKv에 대한 AC의 억제 효과는 용량 의존적 경향을 나타냄을 알 수 있었다(25μM에 대해서는 효과 없음, 50μM에 대해서는 30% 억제율, 100μM에 대해서는 46% 억제율 및 200μM에 대해서는 54% 억제율). 더 높은 감도와 정밀도의 특성으로 인해이 기술은 심장 독성 및 이온 채널을 표적으로 삼는 민족 의학의 약리학 적 효과에 대한 탐구를 촉진 할 것입니다.

이 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술에서 설정된 파라미터에 따라 IKv의 기록을 허용했습니다. IKv는 -60 mV의 유지 전위에서 -40에서 +60 mV까지 150ms의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다(그림 3A). H9c2 쥐 심근 세포의 IKv는 처음에는 -20 mV 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했다. IKv와 막 전위 사이의 평균 관계는 측정 된 전류 진폭으로부터 계산되었다. 결과는 대조군과 비교하여, 1.5 mM 4-AP로 5분 처리 후IKv 진폭이 눈에 띄게 감소되었음을 보여주었다(도 3B). 추가적으로, IKv는 24 시간 AC 처리 후 용량 의존적 방식으로 10 mV에서 60 mV까지 막 전위에서 유의하게 감소하였다 (<strong class="xfi...

본 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9c2 심근 세포에서 전압 게이트 칼륨 (Kv) 채널 전류의 실시간 및 동적 획득을위한 효율적인 방법을 설명합니다.

전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 H9C2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

이 프로토콜은 H9C2 세포의 IKv에 대한 아코 니틴의 효과를 성공적으로 기록합니다. 이온 채널의 관점에서 약물의 심장 독성 메커니즘을 조사하기위한 새로운 단계를 촉진합니다. 전체 세포 패치 클램프 기술은 고감도, 고정밀 및 높은 특이성을 갖춘 이온 채널 연구의 황금 표준입니다.전체 세포 패치 클램프 기술은 심혈관계 및 신경계와 같은 다기관 질환에 대한 특정 이온 채널을 병치하는 약리학적 또는 독성 메커니즘을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 H9C2 배양 접시가 80% 합류가 되면 30초 동안 0.25% 트립신으로 세포를 소화합니다. 5% 이산화탄소 분위기 및 70 내지 80% 상대 습도로 24시간 동안 유리판이 깔린 35mm 접시에 유리판이 깔린 35mm 접시에 일반 배지 또는 약물 함유 배지로 밀리리터당 10 내지 5번째 세포를 배양한다.마이크로 피펫 풀러를 켜고 30 분 동안 예열하십시오. 그런 다음 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트가있는 붕규산 유리 모세관을 놓습니다. 프로그램을 선택하고 제어판에서 Enter 키를 클릭하십시오.오른쪽 상단 모서리에 있는 램프 프로그램을 클릭하여 유리 모세관의 발열량을 결정합니다. 램프 테스트에 의해 결정된 값에 따라 전극을 당기는 프로그램을 작성하고 당기기를 클릭하여 피펫 제작을 시작합니다. 디지털 아날로그 변환기, 신호 증폭기, 마이크로 매니퓰레이터, 현미경 및 카메라를 켭니다.이미징 어플리케이션, 신호 증폭기 소프트웨어 및 데이터 수집 소프트웨어를 순차적으로 엽니다. 수집을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집을 선택합니다. 파형 인터페이스에서 프로그램을 편집합니다.epoch A, epoch B 및 epoch C에 대한 첫 번째 레벨, 델타 레벨, 첫 번째 기간 및 델타 기간에 대한 값을 입력합니다.그런 다음 모드 속도 인터페이스를 클릭하고 평가판 계층 구조 데이터를 설정합니다. 그런 다음 프로토콜 편집을 클릭하여 자극 버튼을 선택하고 PM 누출 빼기 대화 상자에서 누출 빼기 프로그램을 설정합니다. 데이터 스토리지 경로를 설정하려면 파일을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일 이름 설정을 선택합니다.그런 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 개방형 프로토콜 획득을 선택하고 클릭하여 설정된 lKv 프로토콜을 엽니다. 마지막으로 도구 옵션을 클릭하고 멤브레인 테스트를 선택하여 프로토콜 실행을 시작합니다. 세포 외 용액을 전체 세포 패치 클램프 장치의 세포 배스에 추가하고 커버 슬립을 H9C2 세포와 함께 위쪽으로 수조에 놓습니다.피펫의 30%를 세포외 용액으로 채우고 패치 클램프 장치에 통합된 기록 전극 홀더에 설치합니다. 기록 전극 홀더로 피펫을 조입니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터로 피펫을 욕조에 떨어 뜨립니다.신호 증폭기 소프트웨어의 파이펫 오프셋 인터페이스를 클릭하여 lKv 전류 기준선을 제로 피코암페어로 유지합니다. 플라스틱 튜브를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0 밀리리터 주사기로 적절한 양압을 수동으로 전달합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 3차원으로 조작하여 피펫을 약간 움직여 셀과 접촉합니다.피펫이 세포막에 닿은 후 멤브레인 테스트 구형파가 1/3에서 1/2로 떨어지면 양압을 제거하고 적절한 음압을 수동으로 전달합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 패치 인터페이스를 클릭하여 gigaseal을 형성하십시오. 셀 천장 동안 커패시턴스 보상 빠른 및 커패시턴스 보상 느린 신호 증폭기 소프트웨어를 사용하여 빠르고 느린 커패시턴스를 보상하십시오.세포막의 패치를 파열시키기 위해 짧은 음압 펄스를 적용하십시오. 신호 증폭기 소프트웨어의 전체 셀 버튼을 클릭하여 전체 셀 멤브레인 커패시턴스 보상을 실행합니다. 마지막으로 데이터 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장하고 기록합니다.데이터 분석 소프트웨어로 저장된 lKv 데이터를 엽니다. 현재 전압 관계를 저장합니다. 분석을 클릭하여 통계를 선택합니다.데이터 분석을 위해 범위를 커서 1 2로 선택하고 피크 진폭 및 평균 버튼을 클릭한 다음 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 봅니다. 마지막으로 추가 분석을 위해 lKv 평균 데이터의 열을 함수 그리기 소프트웨어에 복사합니다. 대표적인 lKv 전류 트레이스를 저장합니다.편집을 클릭하여 전송 추적을 선택한 다음 전송할 지역의 전체 추적을 선택합니다. 그런 다음 추적 선택에서 선택을 클릭하고 신호에서 IN 0을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 보고 전체 데이터를 함수 그리기 소프트웨어에 복사하여 현재 추적을 그립니다.lKv 프로토콜을 저장합니다. 편집을 클릭하여 자극 파형 신호 생성을 선택하고 확인을 선택합니다. 그런 다음 신호를 선택하지 않고 전류 트레이스를 그리는 단계를 반복합니다.lKv는 마이너스 60 밀리 볼트의 유지 전위에서 마이너스 40에서 플러스 60 밀리 볼트까지 150 밀리 초의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다. H9C2 쥐 심근 세포의 lKv는 처음에는 마이너스 20 밀리 볼트 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했습니다. 대조군과 비교하여, lKv 진폭은 1.5 밀리몰 4-AP로 5 분 처리 한 후에 관찰 가능하게 감소되었다.또한, lKv는 24 시간 AC 처리 후 용량 의존적 방식으로 10에서 60 밀리 볼트의 막 전위에서 크게 감소했습니다. 개별 세포는 이온 채널을 기록한 후, 단일 세포 유전체학, 전사체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 추가 단일 세포 체학 평가에 사용될 수 있습니다.

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이 프로토콜은 쥐 기저 동맥에서 평활근 세포를 분리하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 이러한 세포의 내부 정류 칼륨 채널 전류를 기록하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 연구는 기저동맥과 이온 채널을 연구하는 연구자들에게 새로운 접근법을 제공합니다.

Patch Clamp 기술에 의한 갓 분리된 기저 동맥 평활근 세포의 내부 정류 K+ 전류 기록

배우세요 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9C2 심근 세포의 전압 의존적 칼륨 전류를 기록하는 방법을. 아코니틴의 심장독성 메커니즘을 이온 채널 관점에서 연구할 수 있습니다.

전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 H9C2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록

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