Name: Palmitic Acid-Induced In Vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 연구를 위한 팔미트산 유도 AML-12 세포 모델에서 Platycodin D의 보호 효과를 확인하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 생존율, 산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능을 평가하여 전통 중의학의 치료 가능성을 탐구합니다.

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이 연구는 충칭 과학 기술위원회 (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 및 jbky20210029)와 중국 박사후 과학 재단 (No. 2021MD703919)의 보조금으로 지원됩니다.

AML-12 세포(정상 마우스 간세포 세포주)는 세포 기반 연구에 사용됩니다. 세포는 상업적 공급원으로부터 얻어진다 ( 재료 표 참조).
1. 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위한 AML-12 세포의 전처리
<ol><li>세포를 정상 세포 배양 배지 (0.005 mg/mL 인슐린, 5 ng/mL 셀레늄, 0.005 mg/mL 트랜스페린, 40 ng/mL 덱사메타손, 및 10% 소 태아 혈청 [FBS]를 함유하는 DMEM 플러스 Ham's F12 [1:1], 재료 표 참조)를 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다.</li>
	<li>2.8 x 105 cells/well의 밀도로 12웰 플레이트(1mL/well)에 세포를 시딩합니다. 참고: 모든 세포 분해 및 배지 교환 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.</li>
	<li>하룻밤 배양(~10시간) 후 세포의 배양 배지를 제거한 다음 1mL의 무혈청 배지(웰당)로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>12웰 세포 플레이트를 (1) 대조군, (2) PD 처리군, (3) PA 처리군, (4) PA+PD 처리군을 포함하여 왼쪽에서 오른쪽으로 4개의 다른 처리군으로 나눕니다. 참고: 각 실험 처리 그룹의 3회 반복이 동일한 12웰 세포 플레이트에 위에서 아래로 배열됩니다.</li>
	<li>정상세포배양액(1mL/웰)을 대조군과 PD처리군에 추가하고, PA처리군과 PA+PD처리군에 300μM의 PA가 보충된 정상세포배양액(1mL/웰)을 추가한다.</li>
	<li>배양 24시간 후 세포의 배양액을 제거하고, 세포를 1 mL의 무혈청 배지(웰당)로 2회 세척하였다.</li>
	<li>비히클(디메틸 설폭사이드, DMSO, 0.1% v/v)이 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 대조군에 추가합니다. 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PD 처리군에 추가합니다. PA 처리군에 300μM PA가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 추가합니다. 300μM PA 및 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PA + PD 처리군에 추가합니다.</li>
	<li>추가 24시간 동안 배양한 후 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색(2단계), JC-1 염색(3단계) 및 웨스턴 블로팅(4단계)을 사용하여 세포에 대한 PD의 보호 효과를 조사합니다. 참고: 모든 배양 작업은 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 수행됩니다.</li>
</ol>2. ROS 생산의 변화 측정
참고: 세포의 세포 내 ROS 수준은 DCFH-DA 염색 분석을 기반으로 평가됩니다.
<ol><li>처리 기간(단계 1.8)이 끝날 때, 웰당 1 mL의 인산염 완충 식염수(1x PBS, pH 7.4)로 세포를 3회 세척한 다음, 웰당 10 μM의 10 μM DCFH-DA로 세포를 염색한다( 재료 표 참조). 세포를 어둠 속에서 30분 동안 배양한다. 참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).</li>
	<li>세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고( 재료 표 참조) 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).</li>
	<li>여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대해 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다. 알림: 여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널이 DCFH-DA를 감지하는 것이 좋습니다. 추가적으로, DCFH-DA는 형광 현미경35,36에서 GFP 및 FITC에 대한 파라미터 설정으로 검출될 수 있다.</li>
	<li>마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어( 재료 표 참조)로 이미지를 처리한 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다. 참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.</li>
</ol>3. 미토콘드리아 막 전위의 변화 측정
참고: 미토콘드리아 막 전위의 변화는 JC-1 염색 분석에 의해 모니터링됩니다.
<ol><li>처리 기간(단계 1.8)이 끝나면 웰당 1mL의 1x PBS로 세포를 3회 세척한 다음 5μg/mL JC-1 작업 용액 100μL( 재료 표 참조)로 암실에서 37°C에서 30분 동안 세포를 염색합니다. 참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).</li>
	<li>세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).</li>
	<li>여기 및 방출 파장이 각각 485nm 및 535nm인 녹색 형광 채널과 여기 및 방출 파장이 각각 550nm 및 600nm인 적색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대한 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다. 참고 : 여기 파장이 485nm이고 방출 파장이 535nm인 녹색 형광 채널은 탈분극된 미토콘드리아 39,40,41로 취급되는 JC-1 단량체를 검출하는 데 사용되며, 여기 파장이 550nm이고 방출 파장이 600nm인 적색 형광 채널은 JC-1 이량체를 검출하는 데 사용됩니다. 이는 편광된 미토콘드리아 39,40,41로 취급됩니다.</li>
	<li>마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어로 이미지를 처리한 다음 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다. 참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.</li>
</ol>4. LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현량 측정
<ol><li>처리 후(단계 1.8), 4°C에서 예냉각된 1x PBS(1mL/웰)로 세포를 3회 세척합니다.</li>
	<li>프로테아제와 포스파타제 억제제 칵테일(1x)( 재료 표 참조)이 보충된 RIPA 용해 완충액(100μL/웰)을 12웰 플레이트에 넣고 얼음에서 5분 동안 용해합니다.</li>
	<li>세포 용해물을 1.5mL 미세원심분리 튜브에 수집하고, 4°C에서 20분 동안 12,000 x g 로 원심분리한다. 상청액의 단백질 농도를 표준 절차42에 따라 BCA 방법에 의해 결정한다.</li>
	<li>SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(5x, 재료 표 참조)를 세포 용해물 상층액(부피 비율 = 1:4)에 추가합니다.</li>
	<li>와동(~15초 동안 고속으로)으로 혼합하고 혼합된 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.</li>
	<li>12-well-prepared 12% SDS-PAGE gel을 전기영동조에 넣은 후, 초순수로 희석한 SDS up-sample buffer(1x)를 높이한계 위치에 올려 놓는다. 알림: SDS-PAGE 젤은 제조업체의 지침에 따라 상업용 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 준비됩니다.</li>
	<li>단백질 마커(5μL/웰)와 샘플(20μg/웰)을 SDS-PAGE 젤의 다른 웰에 추가합니다.</li>
	<li>안정전압 모드를 100V로 설정하고 80분 동안 전기영동을 수행합니다.</li>
	<li>SDS-PAGE 전기영동 후, 이전에 발표된 보고서 43,44에 따라 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(0.45 μM, 재료 표 참조)으로 단백질의 전기전달을 수행합니다.</li>
	<li>단백질의 전전 후 PVDF 멤브레인을 TBST(1x TBS, 0.1% 트윈 20) 10mL로 실온의 셰이커에서 2회(5분/회) 세척합니다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 5mL의 소혈청알부민(BSA, 5%)으로 실온에서 1시간 동안 쉐이커로 차단합니다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 10mL의 TBST로 세 번(10분/회) 세척합니다. 이어서, 4°C에서 밤새 LC3(마우스 mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1(이하 p62, 마우스 mAb, 1:2,000) 및 β-액틴(마우스 mAb, 1:2,000)( 재료 표 참조)에 대한 블로킹 완충액에 희석된 특정 1차 항체 5mL에 PVDF 멤브레인을 배양합니다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 이어서, PVDF 멤브레인을 실온에서 블로킹 완충액(1:10,000)( 재료 표 참조)에 희석된 토끼 항-마우스 IgG(HRP) 2차 항체와 함께 인큐베이션하고 2시간 동안 빛으로부터 보호하였다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 그런 다음 플라스틱 랩에 PVDF 멤브레인을 놓고 적절한 양의 ECL 작업 용액(200μL/멤브레인)을 추가하고( 재료 표 참조) 2분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 ECL 작업 용액을 제거하고 이미지 현상을 위해 이미징 시스템에 PVDF 멤브레인을 노출시킵니다. 마지막으로 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 밴드의 회색 값을 분석합니다. 참고: 이미징 작업에 사용된 웨스턴 블로팅 및 이미지 J 소프트웨어의 기술적 세부사항은 이전에 설명되었습니다45,46.</li>
</ol>5. 통계 분석
<ol><li>실험 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 통계 소프트웨어 도구를 사용하여 유의성 분석을 수행합니다47.</li>
	<li>t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 통계적 차이를 계산합니다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

연구에 따르면 NAFLD는 지방간에서 NASH에 이르는 임상 병리학 적 증후군으로 간경변 및 간암으로 진행될 수 있습니다51. 고지방 식단과 비활동적인 생활 방식은 NAFLD의 전형적인 위험 요소입니다. NAFLD 치료를 위한 비약물 요법과 약물 요법 모두 연구되었다51,52,53. 그러나 NAFLD의 발병기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 여기에 설명된 방법은 PA 자극 AML-12 세포에 의해 확립된 NAFLD의 시험관내 모델을 포함합니다. 우리는 이 모델에서 NAFLD에 대한 PD의 보호 효과를 조사했으며 PD가 PA에 의해 유도된 ROS 증가를 약화시킨다는 것을 발견했습니다. 게다가, PD는 또한 PA에 의해 유도된 MMP 탈분극을 개선하였다. 또한, PD는 p62의 단백질 발현 수준을 현저히 감소...

Platycodon grandiflorus (PG)는 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.는 중국 전통 의학(TCM)에서 사용됩니다. 주로 중국의 북동부, 북부, 동부, 중부 및 남서부 지역에서 생산됩니다1. PG 성분에는 트리테르페노이드 사포닌, 다당류, 플라보노이드, 폴리페놀, 폴리에틸렌 글리콜, 휘발성 오일 및 미네랄이 포함됩니다2. PG는 아시아에서 식품 및 약초로 사용되어 온 오랜 역사를 가지고 있습니다. 전통적으로이 약초는 폐 질환에 대한 약을 만드는 데 사용되었습니다. 현대 약리학은 또한 다른 질병을 치료하기 위한 PG의 효능에 대한 증거를 제공합니다. 연구에 따르면 PG는 다양한 약물 유발 간 손상 모델에서 치료 효과가 있습니다. PG 또는 platycodin 추출물의 식이 보충제는 고지방 식단으로 인한 비만 및 관련 대사 질환을 개선할 수 있습니다 3,4,5. PG의 다당류는 생쥐의 LPS/D-GalN에 의한 급성 간 손상 치료에 사용할 수 있다6. 또한 PG 뿌리의 사포닌은 고지방 식단으로 유발된 비알코올성 지방간염(NASH)을 개선합니다.7. 또한, PG의 가장 중요한 치료 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 인간 간세포 암종(HepG2) 세포에서 저밀도 지단백 수용체 발현과 저밀도 지단백 흡수를 향상시킬 수 있다8. 또한, PD는 또한 세포자멸사를 유도하고 HepG2 세포에서 부착, 이동 및 침윤을 억제할 수 있다 9,10. 따라서 본 연구에서는 마우스 간암 AML-12 세포를 시험관 내 모델 구축에 사용하고 이 모델에서 PD의 약리학적 효과 및 기본 메커니즘을 추가로 연구합니다.
비알코올성 지방간장(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방증, NASH, 간경변증, 간세포암종 등을 포함하는 간 질환을 일컫는 일이다11. NAFLD의 발병기전은 불완전하게 이해되었지만 고전적인 "2히트" 이론에서 현재의 "멀티플 히트" 이론에 이르기까지 인슐린 저항성은 NAFLD12,13,14의 발병기전에서 핵심적인 것으로 간주됩니다. 연구에 따르면 간세포의 인슐린 저항성은 유리 지방산을 증가시켜 간에 축적되는 트리글리세리드를 형성하고 간을 지방으로 만들 수 있음이 입증되었습니다15,16. 지방의 축적은 지방 독성, 산화 스트레스로 인한 미토콘드리아 기능 장애, 소포체 스트레스 및 염증성 사이토카인 방출을 유발하여 NAFLD17,18의 발병 및 진행을 초래할 수 있습니다. 또한, 자가포식은 세포 인슐린 감수성, 세포 지질 대사, 간세포 손상 및 선천성 면역 조절에 관여하기 때문에 NAFLD의 발병기전에도 중요한 역할을 합니다 19,20,21.
NAFLD22,23의 발병기전 및 잠재적 치료 표적을 탐색하기 위한 기초를 제공하기 위해 다양한 동물 모델 및 세포 모델이 확립되었습니다. 그러나 단일 동물 모델은 NAFLD24의 모든 병리학적 과정을 완전히 모방할 수 없습니다. 동물 간의 개인차는 병리학 적 특징을 다르게 유도합니다. NAFLD의 시험관 내 연구에서 간 세포주 또는 일차 간세포를 사용하면 실험 조건에서 최대 일관성을 보장합니다. 간 지질 대사 조절 장애는 NAFLD25에서 더 높은 수준의 간세포 지질 액적 축적으로 이어질 수 있습니다. 올레산 및 팜유와 같은 유리 지방산은 고지방 식단으로 인한 NAFLD를 모방하기 위해 시험관 내 모델에서 사용되었습니다26,27. 인간 간모세포종 세포주 HepG2는 시험관 내에서 NAFLD 모델을 구축하는 데 자주 사용되지만, 종양 세포주로서 HepG2 세포의 대사는 정상적인 생리학적 조건에서 간 세포의 대사와 크게 다르다28. 따라서, 약물 스크리닝을 위한 시험관내 NAFLD 모델을 구축하기 위해 원발성 간세포 또는 마우스 일차 간세포를 사용하는 것이 종양 세포주를 사용하는 것보다 더 유리하다. 동물 모델과 시험관 내 간세포 모델 모두에서 약물 효과와 치료 표적의 시너지 조사를 비교하면 마우스 간세포를 사용하여 시험관 내 NAFLD 모델을 구성하는 것이 더 나은 응용 가능성을 갖는 것으로 보입니다.
간으로 들어가는 유리 지방산은 산화되어 에너지를 생성하거나 트리글리세리드로 저장됩니다. 중요한 것은, 유리지방산은 특정 지방독성을 가지고 있으며, 세포사멸 장애와 세포자멸사를 유발할 수 있다는 것이다12. 팔미트산(Palmitic acid, PA)은 인간 혈장에 가장 풍부한 포화 지방산이다29. 비지방 조직의 세포가 고농도의 PA에 장시간 노출되면 활성 산소종(ROS)의 생성을 자극하고 산화 스트레스, 지질 축적, 심지어 세포자멸사를 유발합니다30. 따라서 많은 연구자들은 PA를 유도제로 사용하여 간 세포가 ROS를 생성하도록 자극하여 시험관 내 지방간 질환 모델을 구성하고 세포에 대한 특정 활성 물질의 보호 효과를 평가합니다31,32,33,34. 이 연구는 PA에 의해 유도된 NAFLD의 세포 모델에 대한 PD의 보호 효과를 조사하기 위한 프로토콜을 소개합니다.

<table><tbody><tr><td>5% BSA 차단 완충액</td><td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12(알파 마우스 간 12) 세포주</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd, 중국</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&nbsp; 플러스</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>바이오 안전 캐비닛</td><td>Esco Micro Pte Ltd, 싱가포르</td><td>AC2-5S1 A2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>1.8</td><td></td></tr><tr><td>Culture CO2 Incubator</td><td>Esco Micro Pte Ltd, 싱가포르</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone,&nbsp; 로건,&nbsp; 유타,&nbsp; 미국</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Hyclone, Tauranga, New Zealand</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Software</td><td>Inc., San Diego, CA, USA</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>ABclonal, Wuhan, China</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic PVDF Transfer Membrane</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 용액, 100회;</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&beta; 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 도립 현미경 IX53</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>팔미트산</td><td>시그마, 독일</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액(100x)</td><td>하이클론,&nbsp; 로건,&nbsp; 유타,&nbsp; 미국</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐&nbsp; 불소</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Hyclone,&nbsp; 로건,&nbsp; 유타,&nbsp; USA</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Platycodin D</td><td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, 중국</td><td>CSA: 58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>범용 프로테아제 억제제 칵테일, 100x</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>단백질 마커</td><td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>반응성 산소 종 분석 키트</td><td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>리파&nbsp; 리시스&nbsp; 버퍼</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 젤 빠른 준비 키트</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>P0012AC</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼, 5x</td><td>Beyotime, 상하이, 중국</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>시그마 원심분리기</td>, <td>독일</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1/p62 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>테칸 인피니트 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, 오스트리아</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>WB Transfer Buffer,10x</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>D1060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin Mouse mAb</td><td>ABclonal, 우한, 중국</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

palmitic acid-induced in vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 platycodin d의 보호 효과 조사

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 발생은 전 세계적으로 놀라운 속도로 증가하고 있습니다. Platycodon grandiflorum 은 다양한 질병의 치료를위한 전통적인 민족 의학으로 널리 사용되며 일상 식단에 포함될 수있는 대표적인 기능성 식품입니다. 연구에 따르면 Platycodon grandiflorum의 주요 활성 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 생체이용률이 높고 NAFLD의 진행을 크게 완화하지만 이에 대한 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 시험관 내에서 NAFLD에 대한 PD의 치료 효과를 조사하는 것을 목적으로 한다. AML-12 세포는 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위해 24시간 동안 300μM 팔미트산(PA)으로 전처리되었습니다. 이어서, 세포를 PD로 처리하거나 24시간 동안 PD 치료를 받지 않았다. 활성 산소종(ROS)의 수준은 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 분석되었으며, 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염색 방법으로 측정되었습니다. 또한, 세포 용해물에서 LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 ROS 및 미토콘드리아 막 전위 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 한편, PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 LC3-II/LC3-I 수준을 증가시키고 p62/SQSTM1 수준을 감소시켰습니다. 결과는 PD가 산화 스트레스를 줄이고 자가포식을 자극하여 시험관 내에서 NAFLD를 개선한다는 것을 나타냅니다. 이 시험관 내 모델은 NAFLD에서 PD의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

세포의 세포 내 ROS AML-12 세포를 24시간 동안 300μM PA로 유도하고 NAFLD 세포 모델을 확립했습니다. 이어서, 세포를 24시간 동안 PD로 처리하였다. 세포를 DCFH-DA 형광 프로브로 표지하고, 형광현미경으로 ROS 생성을 관찰하였다. 세포내 ROS의 DCFH-DA 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 결과는 PD가 300μM의 PA(P &lt; 0.01)로 배양된 세포에서 세포내 ROS 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 PD가 세포 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.
세포의 미토콘드리아 막 전위 미토콘드리아는 내인성 세포 사멸 경로48,49,50<sup class...

이 프로토콜은 팔미트산 유발 시험관 내 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사합니다.

Palmitic Acid-Induced In Vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

이 방법은 모델 구성을 허용하고 NAFLD에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사할 수 있는 AML-12 세포의 사용을 보여줍니다. 동물 모델의 사용에 대한 과도한 의존은 치료 약물 개발의 부담을 증가시킵니다. NAFLD 약물 개발의 초기 단계에서 세포 모델을 사용하는 것이 더 실용적이고 비용 효율적입니다.이 TCM 모델은 platycodin D의 생물학적 기능에 대한 이해를 높이고 NAFLD 치료를 위한 다른 TCM의 사용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 12웰 플레이트에 웰당 1밀리리터의 AML-12 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 12웰 플레이트를 4개의 다른 처리 그룹으로 나누고 대조군, PD 처리, PA 처리 및 PA 플러스 PD 처리 그룹으로 표시합니다.웰 당 정상 세포 배양 배지 1 밀리리터를 대조군 및 PD 처리군에 첨가한다. 300 마이크로몰 팔미트산이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 PA 처리 및 PA 플러스 PD 처리 그룹에 추가합니다. 24시간 배양 후, 세포의 배양액을 제거한 다음, 1밀리리터의 무혈청 배지로 세포를 2회 세척하였다.다음으로, 비히클이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 대조군에 추가하고, 1마이크로몰 플라티코딘 D가 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 PD 처리군에 추가합니다. PA 처리군에 300 마이크로몰 팔미트산이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 추가하고, PA 플러스 PD 처리군에 300 마이크로몰 팔미트산과 1 마이크로몰 플라티코딘 D가 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 추가합니다. 세포를 24시간 동안 처리한 후, 웰 당 1 밀리리터의 1X PBS로 세포를 3회 세척한다.그런 다음 웰 당 10 마이크로 몰 DCFH-DA의 100 마이크로 리터로 세포를 염색합니다. 세포를 어둠 속에서 30분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 1X PBS 1밀리리터를 각 웰에 첨가한다.12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20X 대물렌즈를 사용하여 200X 배율에서 세포의 형태를 관찰합니다. 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, 이전에 준비된 처리된 세포를 웰 당 1 밀리리터의 1X PBS로 3회 세척한다. 그런 다음 밀리리터 JC-1 작업 용액 당 5 마이크로 그램의 100 마이크로 리터로 세포를 염색하고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양합니다.그런 다음 세포를 1X PBS로 세 번 세척하고 각 웰에 1 밀리리터의 1X PBS를 첨가합니다. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20X 대물렌즈를 사용하여 200X 배율에서 세포의 형태를 관찰합니다. 처리된 세포를 용해하고 세포 용해물을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 수집합니다.튜브를 섭씨 4도에서 20분 동안 12, 000G에서 원심분리합니다. 그런 다음 5X SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 1:4의 부피비로 세포 용해물 상청액에 추가합니다. 다음으로, 12 웰을 가진 준비된 12 % SDS-PAGE 젤을 전기 영동 탱크에 넣고 1X SDS up 샘플 버퍼를 초순수로 희석하여 권장 높이 한계까지 추가합니다.SDS-PAGE 전기영동 후, 0.45 미크론 PVDF 멤브레인으로 단백질의 전기전사를 수행한다. 차단막을 차단 완충액에 희석된 1차 항체의 5밀리리터에서 배양한다. LC-III, p62 및 베타-액틴에 특이적인 항체를 사용하십시오.섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 그 다음 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충액에서 10, 000으로 희석한 토끼 항마우스 LGG HRP 2차 항체와 함께 배양한다. 2 시간 동안 빛으로부터 보호 된 실온에서 멤브레인을 배양합니다.배양 후 PVDF 멤브레인을 플라스틱 랩에 놓습니다. 적절한 양의 ECL 작업 용액을 추가하고 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 ECL 작업 용액을 제거하고 이미지 현상을 위해 이미징 시스템에 PVDF 멤브레인을 노출시킵니다.DCFH-DA 염색은 platycodin D가 ALM-12 세포에서 세포 내 ROS 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 이 치료가 세포 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 나타냅니다. 또한, JC-1 단량체 또는 탈분극된 미토콘드리아를 나타내는 녹색 형광은 처리되지 않은 세포보다 팔미트산 처리된 세포에서 더 높았으며, JC-1 이량체 또는 편광 미토콘드리아를 나타내는 적색 형광은 처리되지 않은 세포보다 팔미트산 처리된 세포에서 더 낮았으며, 이는 팔미트산 유도 MMP 탈분극을 나타냅니다. 또한, 모델군과 비교하여, JC-1 단량체 대 이량체의 비율은 플라티코딘 D 처리군에서 감소하여, 팔미트산 유도 MMP를 개선할 수 있음을 나타낸다.자가포식 관련 단백질 LC-III 및 p62의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 조사하였다. LC-32 대 LC-31의 비율은 유의하게 감소하였고 p62의 단백질 발현 수준은 팔미트산으로 처리된 후 증가하였다. 한편, platycodin D는 p62의 단백질 발현 수준을 유의하게 감소시키고 LC-32 대 LC-31의 비율을 증가시켜 팔미트산에 의해 유도된 자가포식 플럭스의 회복을 나타냅니다.음성 대조군에서 세포의 형광 값이 상대적으로 높으면 형광 프로브의 작동 농도를 필요에 따라 조정할 수 있습니다.

investigating-protective-effects-platycodin-d-on-non-alcoholic-fatty

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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배우세요 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 연구를 위한 팔미트산 유도 AML-12 세포 모델에서 Platycodin D의 보호 효과를 확인하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 생존율, 산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능을 평가하여 전통 중의학의 치료 가능성을 탐구합니다.

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