디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

DMS-MaP는 RNA 구조의 스냅샷을 얻고 다양한 조건에서 어떻게 변하는지 배울 수 있는 시퀀싱 기반 방법입니다. 결정학 및 전자 현미경과 같은 기존의 구조 결정 방법과 달리 DMS-MaP는 세포 및 디콘볼루트 RNA 구조 앙상블에 사용할 수 있습니다. RNA 구조는 다양한 생물학적 현상에 영향을 미치기 때문에 우리의 방법은 거의 모든 생물학적 연구 분야에 대한 기계론적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

89 마이크로리터의 리폴딩 완충액을 100 마이크로리터의 최종 부피를 갖는 각 반응에 대해 지정된 1.5-밀리리터 튜브로 옮기는 것으로 시작한다. 화학 후드 아래에 있는 열통에서 튜브를 섭씨 37도로 예열합니다. 10 마이크로 리터의 뉴 클레아 제가없는 물을 PCR 튜브에 넣고 그 안에 1-10 피코몰의 RNA를 옮깁니다.

RNA를 변성시키기 위해 섭씨 95도의 열순환기에서 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 RNA가 잘못 접히지 않도록 즉시 튜브를 얼음 블록 위에 놓습니다. 이제 RNA를 다시 돌리려면 섭씨 37도에서 재 폴딩 버퍼가 들어있는 지정된 튜브에 샘플을 추가하고 잘 섞은 후 10-20 분 동안 배양합니다.

다음으로, RNA 샘플이 들어있는 튜브에 10.5 몰 농도의 100 % 디메틸 설페이트 또는 DMS 1 마이크로 리터를 첨가하고, 반응 혼합물을 분당 800 내지 1, 400 회전으로 흔들면서 5 분 동안 배양한다. 5 분 반응 후 60 마이크로 리터의 100 % 베타-메르 캅토 에탄올로 담금질하고 볼텍싱하기 전에 잘 섞어 즉시 RNA를 얼음에 놓습니다. 그런 다음 RNA를 청소하고 10 마이크로 리터의 뉴 클레아 제가없는 물에서 용리시킵니다.

분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량합니다. 마지막으로 변형 된 RNA를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 반응 혼합물을 PCR 튜브에 첨가한 후, 10 마이크로리터의 뉴클레아제-비함유 물에 적어도 100 나노그램의 용리된 변형된 RNA를 PCR 튜브로 옮긴다.

혼합물을 섭씨 57도에서 열순환기에서 30분 내지 1.5시간 동안 배양한다. 30 분이면 500 개의 뉴클레오티드를 함유 한 제품을 만들 수 있습니다. 다음으로, 4 몰 수산화 나트륨 1 마이크로 리터를 첨가하고 피펫으로 잘 섞은 다음 섭씨 95도에서 3 분 동안 배양하여 RNA를 분해하고 상보성 DNA에서 TGIRT를 방출합니다.

컬럼 기반 접근법을 사용하여 프라이머를 제거하고 상보적인 DNA를 청소합니다. 그리고 그것을 증폭시키기 위해 PCR을 수행한다. 라이브러리 준비를 진행하기 전에 아가로스 겔에서 2마이크로리터의 PCR 산물을 실행하여 PCR 성공을 확인합니다.

그런 다음 시퀀싱을 위해 단편을 인덱싱하기 전에 분광 광도계를 사용하여 추출 된 단편을 정량화합니다. 원하는 감염 단계까지 성장한 바이러스 감염 세포를 필요한 생물학적 안전성 수준을 가진 전용 흄 후드로 옮깁니다. 세포를 포함하는 배양 배지에 DMS의 2.5% 부피를 추가하고 파라필름으로 용기를 밀봉합니다.

용기를 섭씨 37도에서 5 분 동안 즉시 배양하십시오. 배양 후 조심스럽게 피펫팅하여 DMS 함유 배지를 적절한 화학 폐기물에 버립니다. 그런 다음 10 밀리리터의 정지 완충액을 세포에 부드럽게 추가하고 세포를 긁어 내고 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다.

튜브를 3, 000 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿 다운시킨다. 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 10 밀리리터의 PBS로 2회 세척한다. 세탁 후 가능한 한 잔여 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.

펠릿을 적절한 양의 RNA 분리 시약에 녹여 RNA 추출을 수행합니다. 다음으로, RNA 분리 시약의 균질화 된 세포 1 밀리리터에 200 마이크로 리터의 클로로포름을 첨가하고 세포 용액이 밝은 분홍색으로 변할 때까지 15-20 초 동안 와동시킵니다. 상 분리가 발생할 때까지 기다리십시오., 이는 바닥에 분홍색 지질 상이 정착하는 것으로 표시됩니다.

상부 수성 상을 새 튜브로 옮기기 전에 섭씨 4도에서 15 분 동안 약 20, 000g의 속도로 튜브를 회전시킵니다. RNA를 청소하고 충분한 양의 뉴클레아제가 없는 물에서 용리합니다. 그런 다음 바람직한 접근법을 사용하여 리보솜 RNA 고갈을 수행한 후 적절한 양의 뉴클레아제가 없는 물에서 RNA를 용리하고 분광 광도계를 사용하여 정량화합니다.

정제된 RNA는 RT-PCR에서 다시 사용할 수 있다. 언급된 웹 서버를 이용하여 DMS-MaP 데이터를 편리하게 분석할 수 있습니다. 읽기는 참조에 매핑되고 기본 변형당 계산됩니다.

결과 모집단 평균 파일은 잘 알려진 RNA 구조 예측 소프트웨어에서 제약 조건으로 사용할 수 있습니다. 결과 최소 자유 에너지 구조는 VARNA와 같은 소프트웨어를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현재로서는 DREAM의 안정 버전만이 RNA 구조 앙상블을 디컨볼루션할 수 있습니다.

그러나 전체 커뮤니티에서 이 기능에 더 쉽게 액세스할 수 있도록 하는 작업이 진행 중입니다. T7 중합효소 프로모터의 부착에 의해 길쭉한 gBlock 단편의 시험관내 전사는 관심 RNA를 생성하여, 1%아가로스 겔 상의 300개 뉴클레오티드에서 단일 밴드로서 나타난다. DMS 변형 RNA에 대해 수행된 유전자 특이적 RT-PCR의 성공은 2%아가로스 겔 상의 300개 염기쌍에서 단일 밴드에 의해 나타내었다.

인덱싱된 조각은 예상대로 약 150 염기쌍 더 높게 나타났습니다. DMS 처리는 바이러스 감염 4일 후 세포변성 효과를 나타내는 HCT-8 세포에 대해 수행되었습니다. 추출 된 총 RNA는 40S 및 60S 서브 유닛을 차지하는 두 개의 밝은 밴드로 아가 로스 겔에 나타났습니다.

리보솜 RNA 고갈 후 두 개의 밝은 밴드가 사라지고 해당 차선에 얼룩이 남았습니다. 라이브러리 준비 후, 샘플은 다양한 크기 분포를 가지며 얼룩으로 나타났습니다. 밴드를 200 내지 500 뉴클레오티드 사이에서 절제하고, 어댑터 이량체를 분리하였다.

SARS-CoV-2 게놈의 구조 모델은 개방 형태를 가진 염기가 염기 쌍에 관여하는 염기에 비해 반응성이 더 높다는 것을 보여주었습니다. 염기의 반응성 프로파일은 우라실 및 구아닌이 반응성 값이 낮고 DMS에 의해 변형되지 않았 음을 나타내었다. 우리의 방법을 사용하면 크기 제약 없이 높은 처리량 방식으로 세포의 구조를 예측할 수 있습니다.

제어 메트릭은 구조 예측의 정확성에 대한 통찰력을 제공하기 때문에 매우 중요합니다. 예측의 정확성을 추가로 확인하려면 구조를 방해하거나 변경하는 더 많은 실험을 수행해야합니다.