접촉 모드 형태학적 관찰 및 박테리아 세포 손상 분석을 위한 신속한 기술로서의 원자력 현미경
2023년 6월 30일
여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.
이 프로토콜은 특정 질병이나 치료로 인한 세포 형태의 변화를 관찰하기 위해 접촉 모드 원자력 현미경을 사용하는 것을 보여줍니다. 이 절차에는 오염을 방지하고 노화를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 고정된 샘플을 분석하기 위해 밀봉된 용기를 사용하는 것이 좋습니다. 샘플이 마를 때까지 슬라이드를 화염 위에 여러 번 부드럽게 통과시켜 샘플을 슬라이드에 고정하는 것으로 시작합니다.
고정된 샘플을 페트리 접시에 넣고 관찰을 위해 원자력 현미경 장비로 운반합니다. 그런 다음 컴퓨터와 원자력 현미경을 켭니다. 그런 다음 소프트웨어에서 접촉 모드, ContAI-G 프로브 및 자동 슬로프 옵션을 선택합니다.
설정점을 20나노미터, P 게인을 10, 000, I 게인, D 게인을 0, 팁 전압을 0밀리볼트로 설정하여 Z 컨트롤러의 기본값을 설정합니다. 70마이크로미터 스캔 범위 헤드를 사용하여 샘플을 AFM 접촉 모드로 배치합니다. 스캔 헤드에 통합된 두 개의 렌즈에 장착된 카메라를 사용하여 프로브 아래 영역의 표면을 빠르게 볼 수 있습니다.
이제 XY 평면에서 수동으로 이동하여 원하는 영역을 선택합니다. 프로브가 전자적으로 접근하도록 허용amp접촉에 도달할 때까지 표면을 표면. XY 기울기 방향을 줄여 스캐너와 샘플 표면의 XY 측정 평면을 전자적으로 조정합니다.
소프트웨어의 표준 매개변수를 초당 한 줄, 한 줄에 256포인트로 설정합니다. 그런 다음 70 x 70 마이크로미터 영역의 전체 스캔 범위를 수행합니다. 확대/축소 도구를 사용하여 더 작은 영역을 선택합니다.
캔틸레버를 전자적으로 집어넣고 XY 평면을 따라 샘플을 이동하여 샘플에서 새 영역을 선택합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 새 스캔을 수행합니다. 그런 다음 필터 선택에서 이미지의 도구 메뉴에 있는 줄별 평준화를 사용하여 데이터 처리를 수행합니다.
색상 막대의 최대 및 최소 높이를 최적화하여 최상의 이미지 해상도를 얻습니다. 마지막으로 분석 메뉴를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 원하는 도구로 초기점과 끝점을 선택하여 길이와 거리를 결정합니다.
박테리아 배양에 대한 원자력 현미경 분석은 황색포도상구균 배양물이 구균 응집체가 있는 구역별로 분포되어 있음을 보여주었습니다. 증가된 척도는 인구 분포와 구균 형태에 대한 더 큰 인식이 있음을 보여주었습니다. AFM 접촉 모드 이미지를 통해 평균 너비가 1.25 마이크로 미터인 구균의 크기를 결정할 수있었습니다.
슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis)는 접착성 단층을 형성하는 전체 유리 지지체 표면 상에 균질한 분포를 나타내었다. 배양물은 길이 1.9 마이크로미터 및 너비 0.9 마이크로미터를 갖는 막대 형상이었다. 황색포도상구균의 산화마그네슘 나노입자의 미세 희석 노출은 심각한 세포 구조 열화로 인해 매끄러운 표면과 균질한 윤곽의 손실을 초래했습니다.
소포 형성 및 세포질 물질 방출은 MIC보다 더 높은 농도의 배양물에서 관찰되었다. E.coli 배양에서도 유사한 결과가 얻어졌으며 대조군은 매끄러운 표면을 보여 균질한 막대 모양 모양을 강조했습니다. 구조는 1, 000 PPM 나노 입자 노출에서 완전히 사라졌으며 구별 가능한 실루엣 만 남았습니다.
추가 분석에 필수적이므로 샘플 고정을 올바르게 수행하는 것이 중요합니다. 이미지 필터는 좋은 이미지 해상도와 샘플 세부 정보를 제공하는 데 도움이 됩니다. 고정 방법을 사용하면 AFM 비접촉 모드를 적용할 수 있어 기계적 특성 연구에 도움이 될 수 있습니다.
이 방법론은 박테리아 세포 손상 분석에 중점을 둔 의료 및 미생물학 연구에 저렴하고 유용한 도구가 될 수 있습니다.
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개요
이 연구는 원자력 현미경(AFM)을 활용하여 세균의 크기, 모양, 배양 생물막, 나노입자의 살균 효과에 초점을 맞춰 세균을 상세히 분석합니다. 본 프로토콜은 세균 세포의 형태 변화를 관찰하기 위한 신중한 샘플 준비 및 특정 이미징 기술을 강조합니다.
주요 연구 요소
연구 분야
- 미생물학
- 세균 특성화
- 나노입자 연구
배경
- 원자력 현미경은 세균 형태를 관찰하는 중요한 도구입니다.
- 세균 생물막 형성 및 살균제에 대한 반응을 이해하는 것은 의학 연구에 도움이 됩니다.
- 정확한 이미징 및 분석을 위한 샘플 준비는 매우 중요합니다.
사용된 방법
- 접촉 모드의 원자력 현미경
- Staphylococcus aureus 및 Pseudomonas hunanensis 배양
- 나노입자 노출 분석
주요 결과
- AFM 분석은 세균 세포의 크기와 분포를 밝혀내었으며, Staphylococcus aureus는 평균 폭이 1.25 마이크로미터임을 보여주었습니다.
- 마그네슘 산화물 나노입자 농도 증가는 세균 세포에 중요한 형태 변화를 초래했습니다.
- 이 연구는 세균 구조 완전성 분석에 AFM의 효과를 입증합니다.
결론
- 이 방법론은 특히 세균 손상 평가에 있어 AFM의 유용성을 강조합니다.
- 연구 결과는 치료 반응에 대한 세균의 더 넓은 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
