Name: 트랜스포존 활성에 대한 IS200/IS605 계열 관련 TnpB의 영향에 대한 실시간 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: 학습하세요 Escherichia coli 단세포에서 TnpB 단백질이 트랜스포존 활성을 4~5배 증가시키는 역할을 실시간 형광 현미경으로 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 내 유전자 동역학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구에 대한 재정 지원은 캘리포니아 대학의 창업 자금으로 제공되었습니다.

1. 세균 배양의 제조
<ol><li>플라스미드 트랜스포존 구축물(Kim et al.8에 이전에 기술됨)로 대장균 균주 MG1655를 LB에서 적절한 항생제(카나마이신 25μg/mL, 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 밤새 성장시킵니다. 참고: 사용된 구축물의 서열 및 관련 서열은 GenBank20 수탁 번호 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 및 OP717085로서 입수가능하다.</li>
	<li>정상 상태 기하 급수적 인 성장을 달성하기 위해, 탄소원 (0.5 % w / v 포도당 여기) 및 적절한 항생제 (재료 표 참조)가 보충 된 M63 배지 (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4] 2SO 4, 0.5 μg / mL 티아민 [비타민 B1])로 배양물을 희석 ≥100 배).</li>
	<li>37nm(OD600)의 광학 밀도가 ~0.2에 도달할 때까지 600°C에서 배양물을 성장시킵니다. 문화는 사용할 준비가되었습니다.</li>
</ol>2. 슬라이드 준비
<ol><li>마이크로파에서 M63을 0.5% w/v 포도당과 1.5% w/v 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹이고 완전히 녹고 잘 혼합되도록 합니다.</li>
	<li>항생제와 유도제 (25 μg / mL 카나마이신 및 10 ng / μL 무수 테트라 사이클린 [aTc], 재료 표 참조)를 추가하기 전에 혼합물을 ~ 55 ° C로 식히십시오.</li>
	<li>작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 첫 번째 슬라이드에 수직으로 두 개의 슬라이드를 더 쌓고 아래쪽 슬라이드와 평행하게 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 슬라이드 두께 1개와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물의 ~1 mL를 슬라이드 사이의 이 틈에 천천히 넣어 작은 젤 사각형을 만듭니다.</li>
	<li>젤이 굳어지면(~10-15분) 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다. 면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 배양물 2.5 μL를 피펫팅한 다음(단계 1.3) 커버슬립을 그 위에 올려놓는다.</li>
	<li>슬라이드와 커버슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오( 재료 표 참조). 에폭시를 건조시키고 세포를 37°C에서 최소 1시간 동안 아가로스 패드 상에 침전시킨다.</li>
</ol>3. 타임랩스 형광 현미경
<ol><li>준비된 샘플(단계 1.3)을 37°C로 가열 및 유지되는 환경에서 형광 현미경( 재료 표 참조) 상에 놓습니다.<ol><li>이미지 획득에 사용되는 카메라에 적합한 노출 시간을 설정합니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 조명 강도를 조정합니다. 참고: 각 파장에 대해 2초의 노출 시간이 본 연구에 사용되었습니다.</li>
		<li>각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야(FOV)를 찾습니다. 배경 빼기를 위해 분석 중에 사용할 이미지를 획득합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다.<ol><li>타임랩스 사진을 프로토콜로 인코딩합니다. 획득 빈도를 원하는 시간 간격(여기서는 20분)으로 설정하고 총 타임랩스 기간을 원하는 길이(24시간)로 설정합니다.</li>
		<li>적절한 파장을 프로토콜로 인코딩합니다(사용된 구성에 따라 다름). 참고: mCherry 여기 피크는 587nm이고 방출 피크는 610nm21입니다. mVenus는 515nm 및 527nm12에 있는 반면 mCerulean3은 433nm 및 475nm11에 있습니다.</li>
		<li>원하는 FOV 수 사이에서 캡처할 그리드 크기를 설정합니다. 참고: 여기에 표시된 대표 데이터는 8 x 8 FOV를 사용했습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>3.1.2단계에서 획득한 각 배경 이미지를 사용하여 각 색상 채널에서 배경 빼기를 수행합니다. 모든 분석 단계에서 오픈 소스 플랫폼 Fiji22 의 표준 모듈을 사용합니다 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>mCerulean 채널을 임계값화하고 임계값 영역을 평균 셀 영역으로 나누어 각 시점의 총 모집단을 근사화합니다.</li>
	<li>고유한 절제 이벤트를 계산하려면 mCerulean3 채널의 시간 미분을 취하십시오. mCerulean3 채널에서 연속 이미지를 빼서 이 작업을 수행합니다. 절제 이벤트는 시간 미분에서 형광의 밝은 섬광으로 감지됩니다.<ol><li>원치 않는 형광을 제거하기 위해 절제 이벤트의 스택을 임계값으로 설정합니다. 이 과정은 절제 자체의 일부를 임계 값으로 표시합니다. 이 문제를 해결하려면 이미지를 확장하여 절제를 원래 크기로 복원하십시오. 참고: 유사한 임계값 및 이미지 분석 기술을 사용하는 분석은 다른 형광 채널에서도 수행할 수 있습니다(예: 절제 이벤트를 트랜스포아제 TnpA[노란색 금성 형광] 및 TnpB[빨간색 mCherry 형광] 수준과 상관 관계).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

살아있는 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 위해 여기에 제시된 고유한 방법은 살아있는 세포에서 실시간으로 전이를 직접 감지하고 이 활성을 보조 단백질의 발현과 연관시킬 수 있는 민감한 분석입니다. 처리량은 벌크 방법으로 달성할 수 있는 것보다 낮지만 이 방법은 개별 살아있는 세포에서 TE 활성 및 단백질 발현을 자세히 측정합니다.
실시간 이미징을 위해 현미경에서 직접 세포를 성장시키기 위해 다양한 도구와 기술을 사용할 수 있습니다. 여기에서 사용된 아가로스 패드 상의 세포 성장 방법은 빠르고 저렴하며 수행하기 쉽다는 장점이 있습니다. 관심있는 세포 성장 상태에 따라 가능한 단점은 아가 로스 패드에서 세포 성장을 지원할 수있는 자원이 제한되어 있으므로 세포가 자연적으로 이러한 자원을 소진하고 비교적 짧은 기간 (12-24 시간) 후에 성장을 멈춘다는 것입니다. 결과적으로, 세포를 정상 상태 성장으로 준비하고 충분한 측정 시간을 줄 수 있을 만큼 충분히 낮은 밀도로 ...

전치 가능한 요소(TE)는 절제 또는 촉매 복제에 이어 게놈 재통합에 의해 숙주 게놈 내에서 동원되는 유전 요소입니다. TE는 생명의 모든 영역에 존재하며, 전위는 숙주 게놈을 재구성하여 코딩 및 제어 영역을 돌연변이시킵니다1. 이것은 진화 2,3, 발달 4,5 및 암7을 포함한 여러 인간 질병6에서 중요한 역할을 하는 돌연변이와 다양성을 생성합니다.
전위 활성의 측면을 형광 리포터와 결합하는 새로운 유전자 구조를 사용하여 이전 연구에서는 광범위한 IS200/IS605 TE제품군을 대표하는 박테리아 TE IS608을 기반으로 개별살아있는 세포8에서 전이를 실시간으로 시각화할 수 있는 실험 시스템의 개발에 대해 설명했습니다(그림 1). TE 시스템은 그림 1A에 표시되어 있습니다. TE는 TnpA에 대한 인식 및 절제 부위인 좌측 말단(LE) 및 우단(RE) 불완전 회문 반복(IP)에 의해 측면에 있는 트랜스포아제 코딩 서열 tnpA를 포함한다. tnpA는 프로모터 PLTetO1을 사용하여 발현되며, 이는 tet 억제 자에 의해 억제되고 안하이드로 테트라 사이클린 (aTc)9로 유도 될 수 있습니다. TE는 청색 리포터 mCerulean3 11에 대해 구성적PlacIQ1 프로모터 10의 -10 및 -35 서열을 분할한다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, tnpA의 생산이 유도될 때, TE는 절제될 수 있고, 프로모터 재구성을 유도할 수 있다. 생성 된 세포는 mCerulean을 발현합니다.3 그리고 청색 형광. TnpA의 N- 말단은 황색 리포터 Venus12에 융합되어 황색 형광으로 TnpA 수준을 측정 할 수 있습니다.
IS608 및 트랜스포존의 IS200/IS605 패밀리의 다른 구성원은 또한 전형적으로 지금까지 알려지지 않은 기능의 제2 유전자인 tnpB13을 암호화한다. TnpB 단백질은 엄청나게 풍부하지만 불완전하게 특성화된 뉴클레아제 계열이며, 이는 종종 tnpB16으로만 구성되는 여러 박테리아 및 고고학 TEs14,15에 의해 암호화됩니다. 또한, 최근 연구는 TnpB가 다양한 조건에서 dsDNA 또는 ssDNA 절단을 생성하는 CRISPR / Cas와 같은 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도 뉴 클레아 제로서 기능한다는 것을 발견함으로써 TnpB에 대한 관심을 새롭게했습니다17,18. 그러나 TnpB가 전치를 조절하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지는 불분명합니다. IS608 전치에 대한 TnpB의 효과에 대한 실시간 시각화를 수행하기 위해 적색 형광 단백질 mCherry에 대한 N- 말단 융합을 갖는 TnpB의 코딩 영역을 포함하는 트랜스포존 버전이 생성되었습니다.
Kuhlman 실험실19에 의해 수행된보다 상세한 벌크 레벨 연구를 보완하여, 트랜스포존 활성의 실시간 이미징이 TnpB 또는 다른 보조 단백질이 전위 역학에 미치는 영향을 정량적으로 밝힐 수있는 방법을 보여줍니다. TnpB를 mCherry에 융합시킴으로써, 개별 전위 사건은 청색 형광에 의해 식별되고 TnpA (황색 형광) 및 TnpB (적색 형광)의 발현 수준과 상관 관계가 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2 톤 클리어 에폭시</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>아가로 스</td><td>시그마-알드리치</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>안하이드로 테트라사이클린 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>아르곤 레이저</td><td>멜레스 그리엇</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>블루 필터 큐브</td><td>크로마</td><td>예: Z457/10X, Em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>단종</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS 상자 및 리필 트레이, 용량: 0.1 to 10 &micro; L, 길이: 3.4 cm, 1.33 in., PP (폴리프로필렌)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS 박스 및 리필 트레이, 용량: 50 - 1000 &마이크로; L, 길이: 7.1 cm, 2.79 인치, PP (폴리프로필렌)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr>피<td>지</td><td></td><td></td><td>(imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Broth, Miller (Granulated)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>현미경 히터</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Stage</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레드 필터 큐브</td><td>크로마</td><td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>사파이어 561 LP 레이저</td><td>코히런트</td><td>1170412</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드, 현미경</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>시그마-알드리치(SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 레이저 발사</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>옐로우 필터 큐브</td><td>크로마</td><td>예: Z514/10X, Em: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

트랜스포존 활성에 대한 is200/is605 계열 관련 tnpb의 영향에 대한 실시간 정량화

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

여기서, 프로토콜은 전치에 결합된 형광 리포터 제품군을 사용하여 살아있는 박테리아 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 수행하는 것으로 요약됩니다. 특히, 실시간 이미징을 사용하여 보조 단백질 TnpB가 전치 가능한 요소의 IS200/IS605 제품군에 속하는 전치 가능한 요소 IS608의 활성에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. IS200/IS605 전치 가능한 요소 계열은 자연에서 발견되는 가장 무수한 유전자 중 하나인 tnpB와 연결된 풍부한 이동 요소입니다. 서열 상동성은 TnpB 단백질이 CRISPR/Cas9 시스템의 진화적 전구체일 수 있음을 시사한다. 또한, TnpB는 Cas-유사 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용하는 것으로 밝혀져 새로운 관심을 받았다. IS608의 전이 속도에 대한 TnpB의 효과가 정량화되고, IS608의 TnpB의 발현이 TnpB 발현이 부족한 세포에 비해 ~ 5 배 증가 된 트랜스포존 활성을 초래한다는 것이 입증되었다.

형광 현미경으로 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 시각화하는 이 방법은 벌크 형광 측정보다 처리량이 낮기 때문에 개별 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 직접 시각화할 수 있습니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여(그림 1), 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 받는 세포를 식별할 수 있습니다(그림 2, TnpB+: 보충 영화 1 및 TnpB-: 보충 영화 2). 
보조 단백질 TnpB (그림 3, 주황색)를 발현하는 세포는 그렇지 않은 세포에 비해 4-5 배 더 높은 수준의 트랜스포존 활성을 경험하는 것으로 나타났습니다 (그림 3, 파란색), 보다 상세한 벌크 수준 연구...

보조 단백질 TnpB가 개별 살아있는 대장균 세포의 전이 역학에 어떻게 영향을 미치는지 정량화하기 위해 실시간 이미징을 수행하는 프로토콜이 요약되어 있습니다.

트랜스포존 활성에 대한 IS200/IS605 계열 관련 TnpB의 영향에 대한 실시간 정량화

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

이 프로토콜을 사용하면 대량 거동을 보는 대신 단일 세포 기준으로 절제 통계를 정량화할 수 있습니다. 이 수준에서 우리는 소비하는 세포와 그렇지 않은 세포에 대한 TnpA 및 TnpB 수준을 포함하여 시간 경과에 따른 개별 세포의 행동을 추적할 수 있으며, 이를 통해 예를 들어 확인된 돌연변이 사건이 성장률에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 돌연변이 역학을 측정하는 간단하고 저렴한 방법입니다.일반적인 접근 방식은 라이브 셀 형광 이미징이 필요한 모든 시스템에 적용할 수 있습니다. M63을 전자레인지에 0.5% 포도당과 1.5% 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹입니다. 배지가 완전히 녹고 잘 혼합되었는지 확인하십시오.항생제와 유도제를 추가하기 전에 혼합물을 섭씨 55도까지 식히십시오. 작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 슬라이드를 첫 번째 슬라이드에 수직으로 쌓습니다.아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 한 슬라이드 두께와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물 1 밀리리터를 슬라이드 사이의 틈새에 천천히 피펫팅하여 작은 젤 사각형을 만듭니다. 젤이 굳어지면 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다.면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 이어서, 2.5 마이크로리터의 박테리아 배양물을 피펫팅하고 그 위에 커버 슬립을 놓는다. 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오.에폭시를 건조시키고 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 아가로스 패드에 정착시킵니다. 준비된 샘플을 섭씨 37도로 가열되고 유지되는 환경에서 형광 현미경에 놓습니다. 각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야를 찾으십시오.서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 겪는 세포를 식별할 수 있습니다. TnpB는 트랜스포존 절제 속도를 향상시킵니다.보조 단백질 TnpB를 발현하는 세포는 TnpB 음성 세포에 비해 4-5배 더 높은 수준의 트랜스포존 활성을 경험합니다. TnpB 양성 세포에서 트랜스포존 절제 이벤트를 겪는 세포는 일반 집단보다 mCherry TnpB의 발현 수준이 더 높습니다. 또한, 절제 사건을 겪는 세포의 경우, TnpB 양성 세포는 TnpB 음성 세포보다 약간 더 높은 수준의 정맥 TnpA- 트랜스 포제 만 발현하며, 이는 일반 집단의 황색 형광보다 높습니다.어려움을 겪을 가능성이 가장 높은 곳은 실험을위한 세포 배양 준비입니다. 세포가 기하 급수적으로 성장하고 슬라이드에 적절한 수의 세포가 접종되었는지 확인해야합니다. 슬라이드를 밀봉할 때 기포가 생기지 않도록 주의하여 아가로스 젤이 마르지 않도록 하십시오.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.

라그리아 빌로사 딱정벌레의 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 세균 식민지 요인을 해명하는 도구로 트랜스포슨 삽입 시퀀싱

학습하세요 Escherichia coli 단세포에서 TnpB 단백질이 트랜스포존 활성을 4~5배 증가시키는 역할을 실시간 형광 현미경으로 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 내 유전자 동역학 연구에 활용됩니다.

트랜스포존 활성에 대한 IS200/IS605 계열 관련 TnpB의 영향에 대한 실시간 정량화

더 많은 동영상 탐색