Name: 젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 과립형 하이드로겔 스캐폴드의 제조 및 3D 바이오프린팅 방법을. 동결건조와 화학 조립을 통해 세포 침투가 우수한 조직 공학용 바이오잉크를 개발합니다.

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저자는 펜실베니아 주립 대학 (Penn State)의 화학 공학과의 연구 지원 전문가 인 T. Pond, Penn State의 Nanofabrication Lab 직원 및 Partillion Bioscience의 J. de Rutte 박사에게 나노 제조 공정에 대한 도움과 토론에 감사드립니다. A. Sheikhi는 Materials Research Institute (MRI) 및 College of Engineering Materials Matter at the Human Level 종자 보조금, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) 및 Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-Autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program 및 Penn State의 창업 기금. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R56EB032672로 NIH(National Institutes of Health)의 NIBIB(National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)에서 부분적으로 지원했습니다.

<ol><li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgel+assembly%3A+Fabrication%2C+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).</li>
<li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+together%3A+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115(2022).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122(2022).</li>
<li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational%22%5BJournal%5D)">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability%2C+strong+adhesion%2C+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076(2022).</li>
<li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390(2022).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li>
<li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
<li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity%3A+Microfluidic+fabrication+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li>
<li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).</li>
<li>Claaßen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl%3A+best+practice+and+current+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li>
<li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li>
<li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

젤라틴과 그 유도체는 HMP 제조에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 기반 생체 재료입니다. 처리량 대 입자 크기 단분산 절충의 문제는 스텝 유화 미세유체 장치를 사용하여 극복할 수 있습니다. 이 장치는 시간당 4천만 개 이상의 물방울을 형성할 수 있으며 변동 계수는 5%27 미만입니다. 이 기사에서는 GelMA 용액을 포함하는 액적의 미세 가공에 대해 논의한 후 GelMA HMP, 분말, GHS 및 NGB로 변환했습니다.
GelMA의 열반응성은 미세유체 지원 HMP 제조 및 안정화를 용이하게 합니다. UCST보다 높은 온도(예를 들어, 37°C)에서, GelMA는 수용액에 용해되어, 스텝-유화 장치에서 유중수 에멀젼 형성에 적합한 수성 유체를 생성한다. 온도를 낮추면(예: 4°C) 액적 형성 후 물리적 가교를 통해 GelMA HMP 형성이 가능합니다. GelMA HMP는 다양한 접근 방식을 통해 GHS 제조를 위한 빌딩 ...

조직 공학 스캐폴드를 형성하기 위해 HMP 빌딩 블록을 조립하는 것은지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았습니다1. HMP 어셈블리를 통해 제작된 GHS는 개별 빌딩 블록 사이의 빈 공간에서 발생하는 셀 규모의 미세 다공성을 포함하여 벌크 대응 제품에 비해 고유한 특성을 가지고 있습니다. 주입성, 모듈성, 다공성에서 분리된 강성과 같은 추가 특성으로 인해 GHS는 조직 복구 및 재생을 향상시키는 유망한 플랫폼이 되었습니다2. 합성 PEG 기반 폴리머3,4 및 알 지네이트5 및 히알루론산 6,7과 같은 다당류를 포함하여 다양한 생체 재료가 GHS 제조에 사용되었습니다. 천연 유래 고분자 중에서 GHS 제조를 위한 가장 일반적인 단백질 기반 생체 고분자는 가교성, 생체적합성, 생체접착성 및 생분해성 생체재료인 GelMA 8,9,10,11 입니다12,13.
HMP는 배치 유화(batch emulsification)(8), 유동-포커싱(flow-focusing)(14, 15) 또는 스텝-유화(step-emulsification)(9,11) 미세유체 장치, 블렌딩(blending)(16), 또는 복합 코아세르베이션(complex coacervation)(17, 18)을 통해 제조될 수 있다. 일반적으로 제조 처리량과 HMP 단분산성 사이에는 절충점이 있습니다. 예를 들어, 블렌딩 기술은 불규칙한 모양의 고도로 분산된 HMP를 생성합니다. 배치 유화 또는 복합 코아세르베이션을 통해 대량의 다분산 구형 HMP를 생산할 수 있습니다. 유동 집속 미세유체 장치는 <5%의 변동 계수를 갖는 고도로 단분산된 액적을 제조하는 데 사용되었지만 처리량은 상당히 낮습니다. 스텝-유화 미세유체 장치에서, 고도로 병렬화된 스텝들은 단분산HMPs(19)의 고-처리량 제조를 가능하게 한다.
메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA) HMP 빌딩 블록은 열에 반응하고 (광)화학적으로 가교 결합이 가능하여 GHS 제조가 용이합니다20. 상부 임계 용액 온도(UCST)21 이하로 냉각되면(예: 4°C에서) GelMA 용액을 포함하는 액적이 물리적으로 가교된 HMP로 전환됩니다. 그런 다음 이러한 HMP 빌딩 블록은 걸린 마이크로겔 현탁액을 생성하기 위해 외부 힘(예: 원심분리를 통해)을 사용하여 패킹됩니다. (광)화학적 가교를 통해 인접한 HMP 사이에 입자 간 결합이 형성되어 기계적으로 견고한 GHS14를 형성합니다. GHS의 가장 중요한 특성 중 하나는 미세 다공성으로, 시험관 내 세포 침투를 용이하게 하고(11) 생체 내에서 조직 내 성장을 강화합니다(22). HMP의 3차원(3D) 바이오프린팅은 통상적으로 밀집된 마이크로겔 현탁액을 사용하여 수행되며, 미세 다공성을 손상시킨다23.
우리는 최근 이질적으로 하전된 나노 입자의 흡착을 통해 GelMA 마이크로 젤의 계면 나노 엔지니어링을 기반으로 한 새로운 종류의 과립 바이오 잉크를 개발 한 후 나노 입자 가역적 자기 조립을 개발했습니다. 이 전략은 느슨하게 포장된 마이크로젤을 전단 항복 및 압출 3D 바이오프린팅이 가능하게 하여 적층 제조된 GHS11의 미세 다공성을 보존합니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 액적 제조 방법, 이러한 액적을 물리적으로 가교된 HMP로 변환, 재현탁 가능한 분말을 사용하여 GelMA HMP 제조, GelMA GHS 형성, GelMA 나노 공학 과립 바이오잉크(NGB) 준비 및 3D 바이오프린팅을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td><td>Alfa Aesar, MA, USA</td><td>B20156-18</td><td>98%</td></tr><tr><td>순도 생검 펀치</td><td>Integra Miltex, NY, USA</td><td>33-31A-P/25</td><td>1.5mm 생검 펀치(플런저 시스템 포함</td></tr>) <tr><td>무딘 바늘</td><td>SANANTS</td><td>30-002-25</td><td>25G</td></tr><tr><td>Bruker Avance NEO 400MHz</td><td>400MHz Bruker NEO, MA, USA</td><td></td><td>NMR 장치</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5415 C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Celltreat, MA, 미국</td><td>229423</td><td></td></tr><tr><td>커피 필터</td><td>BUNN, IL, USA</td><td>20104.0006</td><td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Thermo Scientific</td><td>5311-0250</td><td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm</td></tr><tr><td>OD Deuterium oxide</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>투석막 (12-14 kDa)</td><td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS, 1x)</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>56064C-10L</td><td>건조 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크</td><td>Corning, NY, USA</td><td>4980</td><td>Corning PYREX&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR, PA, USA</td><td>89125-188</td><td>Koptec 200 proof</td></tr><tr><td>외부 스레드 극저온 바이알 (cryovials)</td><td>Corning, NY, USA</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>Labconco, MO, USA</td><td>71042000</td><td>진공 펌프 장착 (카탈로그 # 7587000)</td></tr> <tr><td>젤라틴 분말</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>G1890-5100G</td><td>돼지 껍질의 A 형, 젤 강도 ~ 300g 블룸</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>VWR, PA, USA</td><td>82027-788</td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>FOUR E'S SCIENTIFIC</td><td></td> MI0102003 <td>5인치 마그네틱 핫플레이트 교반기 최대 온도 280°C; C/536 &deg; 에프&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fischer scientific, MA, USA</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1000 네거티브 포토레지스트 시리즈</td><td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td><td>121619</td><td>KMPR1025 및 KMP1035 포함</td></tr><tr><td>LAPONITE XLG</td><td>BYK USA Inc., CT, USA</td><td>2344265</td><td></td></tr><tr><td>리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>900889-1G</td><td>>95%</td></tr><tr><td>Luer-Lok 커넥터</td><td>BD, NJ, 미국</td><td>BD 302995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MA/BA Gen4-Serie 마스크- 및 본드 얼라인너</td><td>S&Uuml; SS MicroTeck, 독일</td><td></td><td>나노 제조 장치</td></tr><tr><td>메타실레이트 무수물</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>276685-100ML</td><td>은 2,000&nbsp를 포함합니다; 억제제로서의 ppm 토판올 A, 94%</td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore Corporation, MA, USA</td><td>ZRQSVR5WW</td><td>전기 저항 &asymp; 18 M&Omega; at 25 &deg; C, Direct-Q 5 UV 원격 정수 시스템</td></tr><tr><td>Novec 7500 엔지니어링 플루이드</td><td>3M, MN, USA</td><td></td><td>3M ID&nbsp; 7100003723</td></tr><tr><td>오븐</td><td>VWR, PA, USA</td><td>VWR-1410</td><td>1410 진공 오븐</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fischer scientific, MA, 미국</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR, PA, USA</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR, PA, USA</td><td>25384-092</td><td>폴리스티렌</td></tr><tr><td>Pico-Surf</td><td>Sphere Fluidics, UK</td><td>C022</td><td>(Novec 7500에서 5%(w/w))</td></tr><tr><td>피펫</td><td>VWR, PA, USA</td><td>89079-970</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>VWR, PA, USA</td><td>87006-060</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너 챔버</td><td>Harrick Plasma, NY, USA</td><td>PDC-001-HP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산</td><td>다우코닝, 미시건, 미국</td><td>&nbsp; 2065623</td><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td></tr><tr><td>양성 변위 피펫</td><td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td><td>M100E</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>UniversityWafer, MA, USA</td><td>452/1196</td><td>4인치 기계식</td></tr><tr><td>등급 스파튤라</td><td>VWR, PA, USA</td><td>231-0104</td><td>일회용</td></tr><tr><td>SU-8&nbsp;</td><td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus, MA, USA</td><td>70-2001</td><td>PHD 2000</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Millipore Sigma, MA, USA</td><td>448931-10G</td><td>97%</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Saint-globain, PA, USA</td><td>AAD04103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자외선&nbsp;</td><td>QUANS</td><td></td><td>전압 : 85 V-265 V AC / 전원 : 20 W</td></tr><tr><td>진공 여과 장치</td><td>VWR, PA, USA</td><td>10040-460</td><td>0.20 &micro; m</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fischer scientific, 미국</td><td>14-955-151</td><td>미니 볼텍스 믹서</td></tr></tbody></table>

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3d 바이오프린팅

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

하이드로겔 미세입자(HMP) 조립을 통해 제작된 입상 하이드로겔 스캐폴드(GHS)의 출현으로 현장에서 미세 다공성 스캐폴드 형성 이 가능해졌습니다. 기존의 벌크 하이드로겔과 달리 GHS의 상호 연결된 마이크로 스케일 기공은 분해와 무관한 세포 침투와 산소, 영양소 및 세포 부산물 전달을 촉진합니다. 메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA)은 세포 접착성 및 생분해성 부분을 포함하는 (광)화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자로 세포 반응성/지시성 생체 재료로 널리 사용되었습니다. 벌크 GelMA를 GHS로 전환하면 조직 공학 및 재생을 위한 많은 기회가 열릴 수 있습니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 마이크로겔 제조, 재현탁 가능한 건조 마이크로겔(마이크로 에어로젤)로의 전환, 마이크로젤의 화학적 조립을 통한 GHS 형성 및 압출 바이오프린팅을 위한 과립형 바이오잉크 제조 절차를 보여줍니다. 냉각 및 광가교를 통한 순차적인 물리화학적 처리가 기계적으로 견고한 GHS를 형성하는 방법을 보여줍니다. 빛에 접근할 수 없는 경우(예: 심부 조직 주입 중), 개별적으로 가교된 GelMA HMP는 트랜스글루타미나제를 사용한 효소 가교를 통해 생체직교적으로 조립될 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 HMP 패킹 밀도에서 미세 다공성 GHS의 3차원(3D) 바이오프린팅은 이질적으로 하전된 나노입자의 계면 자가 조립을 통해 입증됩니다.

GelMA는 그림 1A에 제시된 바와 같이 젤라틴과 MA의 반응을 통해 합성되었습니다. MA 농도와 같은 반응 조건을 조정함으로써, 상이한 MA 치환도가 얻어졌다. MA 치환 정도를 정량화하기 위해, GelMA를 1H NMR 분광법을 통해 평가하였다(도 1B). ~5-6 ppm의 화학적 이동에서 대표적인 피크를 갖는 비닐 작용기는 젤라틴으로부터 성공적인 GelMA 합성을 확인시켜 주었다. 투석 및 멸균 여과 후의 반응 수율은 &gt;70%(GelMA mg/젤라틴 mg)였다. 액적/마이크로겔 제조 수율은 ~100%였다. 치환 정도를 정량화하기 위해 상이한 방법들이 사용될 수 있다24. 우리는 라이신 아미노산(1차 아민)의 감소를 평가했으며, 식(1)에 기초하여 영향을 받지 않는 방향족 산 양성자를 사용하여 정규화했습...

이 기사에서는 미세유체 장치를 사용한 고처리량 젤라틴 메타크릴로일 마이크로겔 제조, 마이크로젤을 부유 가능한 분말(마이크로 에어로젤)로 변환, 마이크로겔의 화학적 조립을 위한 입상 하이드로겔 스캐폴드, 3D 바이오프린팅을 위한 미세 다공성이 보존된 입상 하이드로겔 바이오잉크 개발에 대해 설명합니다.

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

세포외 기질 또는 ECM 수치 하이드로겔 미세입자는 스캐폴드 제조를 위한 빌딩 블록으로 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 젤라틴 메타크릴로일 또는 GelMA 하이드로겔 미세입자의 제조, 정제, 동결건조, 사진 조립 및 3D 바이오프린팅을 보여줍니다. GelMA는 세포 반응성 및 유익한 생체 재료로 널리 사용되어 온 세포 접착제 및 생분해성 부분을 포함하는 광화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자입니다.기존의 벌크 하이드로겔과 비교하여 GelMA 과립형 하이드로겔 스캐폴드는 미세 다공성이므로 빌딩 블록 크기에 따라 맞춤화할 수 있는 빠른 세포 침투가 가능합니다. GelMA 과립형 하이드로겔 스캐폴드는 저렴한 플랫폼과 재생 엔지니어링에서 두꺼운 조직, 장기 및 질병의 3D 바이오프린팅을 위한 새로운 기회를 열 수 있습니다. 시작하려면 10밀리그램의 LAP를 10밀리리터의 DPBS에 첨가하여 0.1% 광개시제 용액을 준비합니다.알루미늄 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하고 라벨을 붙입니다. 다음으로, 원하는 양의 GelMA를 광개시제 용액에 용해시킨다. 알루미늄 호일로 감싼 용액을 섭씨 37도 오븐에 1시간 동안 넣어 투명한 용액을 얻습니다.유상을 준비하려면 엔지니어링 유체에 2% 생체 적합성 계면활성제 용액을 만드십시오. Tygon 튜브를 PDMS 장치의 입구와 출구에 삽입한 다음 Tygon 튜브의 다른 쪽 끝에 25게이지 무딘 바늘을 삽입하여 입구를 만듭니다. 장치를 현미경 아래에 놓고 헤어드라이어나 스페이스 히터를 사용하여 섭씨 약 40도에서 환경을 따뜻하게 유지합니다.장치에 연결된 별도의 주사기에 수용액과 오일 용액을 넣습니다. 분당 160 마이크로 리터의 유속으로 오일 상 용 주사기 펌프를 시작하십시오. 오일이 채널을 채운 후 분당 80 마이크로 리터에서 수성상을 시작하십시오.현미경으로 물방울 형성을 확인하십시오. 용기에 물방울을 모으고 광학 현미경 이미징으로 이미징 챔버에서 평가합니다. 물방울을 밤새 섭씨 4도에서 유지하면서 빛으로부터 보호하여 GelMA 마이크로젤의 물리적 가교를 시작하고 물방울을 안정적인 마이크로젤로 전환합니다.미세 공학 에멀젼-분말(MEtoP) 방법을 구현하려면 내열성 미세 원심분리기 튜브 또는 극저온 유체를 사용하여 엔지니어링 유체에서 물리적으로 가교된 마이크로젤을 수집합니다. 열린 튜브를 실험실 물티슈와 테이프로 밀봉합니다. 물리적으로 가교된 마이크로젤을 액체 질소에서 10분 동안 급속 동결하여 동결건조를 진행한다.동결건조 후, 고체 분말이 얻어질 것이다. 섭씨 4도에서 냉각된 0.1% 광개시제 용액 1밀리리터를 동결건조된 분말에 첨가하여 마이크로겔 현탁액을 만듭니다. 와동된 혼합물을 3, 000g에서 15초 동안 원심분리한다.상층액을 버린 후, 포지티브 치환식 피펫을 이용하여 충진된 마이크로겔 현탁액을 몰드에 옮기고, 400나노미터 파장에서 제곱센티미터당 15밀리와트의 강도로 60초 동안 노출시켜 과립형 하이드로겔 스캐폴드 또는 GHS를 형성한다. 400 마이크로 리터의 마이크로 겔 현탁액의 경우, 물리적으로 가교 된 GelMA 마이크로 젤에 동일한 양의 얼음처럼 차가운 PFO 용액, 20 %의 엔지니어링 유체를 첨가하십시오. 이어서, 와동된 혼합물을 300g에서 15초 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 GelMA 마이크로겔로부터 오일상을 제거하였다.그런 다음 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 0.1 % 광 개시제 용액을 마이크로 겔 현탁액에 첨가하십시오. 볼텍싱된 용액을 300g에서 15초 동안 원심분리한 후, 오일을 버린다. 광개시제 용액 첨가 및 원심분리의 단계를 반복하되 이번에는 3, 000g에서 원심분리하고 충진된 GelMA 마이크로겔의 상층액을 버린다.포장된 GelMA 마이크로젤을 몰드에 옮긴 다음 빛에 노출시켜 GHS를 형성합니다. 3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 초순수에 100 밀리그램의 나노 혈소판 분말을 첨가하여 3.33 % 나노 입자 분산액을 형성한다. 분산액을 섭씨 4도의 냉장고 내부에서 15분 동안 격렬하게 소용돌이치게 하여 응집된 나노입자를 각질 제거합니다.적절하게 각질 제거 된 나노 입자는 명확한 분산을 생성합니다. 50 밀리그램의 LAP를 5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 초순수에 녹여 1 % 광 개시제 원액을 준비합니다. 그런 다음 박리된 나노입자 분산액에 333마이크로리터의 1% 광개시제 용액을 추가하고 주변광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다.상기 혼합물을 1분 동안 와동시켜 나노입자 분산액과 광개시제를 혼합하였다. 얼음처럼 차가운 PFO, 20%in 엔지니어링 유체를 물리적으로 가교된 GelMA 마이크로젤에 1:1 부피비로 첨가합니다. 와동된 혼합물을 300g에서 15초 동안 원심분리한 후, 계면활성제가 포함된 유상을 버린다.얼음처럼 차가운 LAP 보충 나노 입자 분산액을 세척 된 GelMA 마이크로 겔에 첨가하십시오. 3, 000g에서 15초 동안 원심분리한 후, 바닥에 남아 있는 오일을 버리고 상등액을 분산시켰다. 현탁액을 섭씨 4도에서 보관하고 하루 동안 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하면 GelMA 나노 공학 과립 바이오 잉크 또는 NGB 제품을 얻을 수 있습니다.다음날 NGB를 3 밀리리터 주사기에 넣습니다. 적재된 주사기를 캡과 파라필름으로 밀봉하고 200g에서 펄스 원심분리를 수행하여 갇힌 공기를 제거합니다. 암-암 루어 잠금 커넥터를 사용하여 바이오잉크를 3밀리리터 카트리지로 옮깁니다.카트리지를 다시 200g에서 잠시 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 NGB를 섭씨 4도로 유지한 후 사용합니다. 다음으로, 제조된 쥐 섬유아세포 현탁액을 3-밀리리터 주사기에 로딩한다. 암-암 루어 잠금 커넥터를 사용하여 NGB와 셀 로드 주사기를 결합하고 앞뒤로 40회 밀어 내용물을 부드럽게 혼합합니다.노즐을 3 밀리리터 프린트 헤드에로드하여 표준 원추형 노즐이있는 적절한 바이오 프린터를 사용하여 NGB 또는 셀 함유 NGB를 인쇄하십시오. 인쇄 베드 온도를 섭씨 10도 미만으로 유지하고 속도 및 배압과 같은 매개변수를 최적화합니다. 원하는 gcode 또는 STL 파일을 선택합니다.그런 다음 표준 원추형 노즐이 장착 된 공압 3 밀리리터 주사기의 기판과 노즐 유형을 선택하십시오. 장치 지침을 사용하여 바이오 프린터를 보정하고 인쇄를 시작하여 3D 구조를 얻습니다. MEtoP 기술은 저압 동결 건조를 통해 재현 가능한 건조 마이크로 겔 분말을 생성하면서 마이크로 겔을 응집 및 심한 변형으로부터 보호했습니다.SEM 이미지는 이 기술을 사용하여 건조된 GelMA 미세입자가 기존의 동결건조에서 관찰된 응집과 비교하여 동결건조 후에도 구형 모양을 유지한다는 것을 보여주었습니다. 고분자량 형광 염료를 사용한 GelMA, GHS 및 NGB의 미세 기공 특성 분석은 상호 연결된 마이크로 스케일 빈 공간을 보여주었습니다. 또한 사용자 지정 작성 MATLAB 스크립트를 사용하여 평가한 형광 이미지는 기공을 감지했습니다.공극 분율 및 중앙 기공 등가 직경 측정은 NGB를 사용하여 3D 프린팅된 스캐폴드에서 마이크로 스케일 기공의 가용성과 상호 연결성을 증명하는 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다. 매달린 필라멘트 길이 측정에 의해 단단하고 느슨하게 포장된 GelMA 마이크로겔에 대한 NGB 스캐폴드의 우월성은 NGB가 패킹된 마이크로겔보다 더 긴 길이를 갖는 것으로 나타났습니다. 느슨하게 포장된 마이크로젤은 필라멘트를 생성하지 못했습니다.속이 빈 실린더를 3D 프린팅하고 전체 구조물을 광가교를 위해 빛에 노출시켰습니다. 인쇄된 구조는 모양, 충실도 및 구조적 무결성을 보여주기 위해 물리적으로 유지되었습니다. 예를 들어 스캐폴드가 생물학적 평가에 사용되는 경우(예: 세포 함유 바이오프린팅) 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 특정 조건에서 모든 단계를 수행해야 합니다.우리는 세분화 된 하이드로 겔 스캐 폴드의 사용을 생물 의학에서 새롭게 등장한 생체 재료 플랫폼으로 탈시장화하기를 희망합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

UV crosslinkable hydrogels 처리 첨가제 제조 전략 개발 되었습니다. 이 전략 ﹙ 하이드로 겔 구조의 레이어, 레이어 조립 뿐만 아니라 저조한 자석 회전에 반응 하는 움직이는 구성 요소를 포함 하는 통합된 장치 독립적인 구성 요소, 어셈블리 허용 한다.

첨가제 제조 기술은 자석으로 응답 구성 요소와 히드로 기반 Micromachines의 손쉬운 고 빠른 제작을 위해

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

이 작업은 압출 단편화로 마이크로 젤을 제조하고, 마이크로 젤을 주사용 과립 하이드로 젤로 처리하고, 과립 하이드로젤을 생물 의학 응용 분야를위한 압출 인쇄 잉크로 적용하는 간단하고 적응력이 뛰어나며 저렴한 방법을 설명합니다.

대량 하이드로젤을 단편화하고 생물 의학 응용 분야를 위한 입상 하이드로젤로 처리

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

이 프로토콜은 다양한 재생 의학 응용에 사용될 수 있는 미세다공성 어닐링된 입자 스캐폴드를 위한 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를위한 마이크로 겔 빌딩 블록의 미세 유체 합성

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

배우세요 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 과립형 하이드로겔 스캐폴드의 제조 및 3D 바이오프린팅 방법을. 동결건조와 화학 조립을 통해 세포 침투가 우수한 조직 공학용 바이오잉크를 개발합니다.

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

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