RPA-CRISPR/Cas12a-SPM 및 딥러닝 기반의 DNA 바이러스 검출 시스템

당사의 프로토콜은 개구리 바이러스 3에 대한 빠르고 매우 민감한 검출 시스템을 도입합니다. 중요한 것은 이 방법을 통해 DNA 바이러스의 현장 진단을 가능하게 하여 전염병 발생을 예방하는 데 중요한 역할을 한다는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 RPA와 CRISPR/Cas12a 시스템의 통합에 있으며, 휴대용 스마트폰 기반 현미경 및 AI 분류로 보완됩니다.

이 통합은 감지 효율성과 정확성을 크게 향상시키는 동시에 인적 요인으로 인한 오류를 줄입니다. 먼저 반응 버퍼에 4개의 주요 RPA 효소를 추가합니다. 그런 다음 미리 설계된 프라이머를 혼합물에 추가합니다.

혼합물을 철저히 소용돌이치십시오. 개구리 바이러스 3에서 얻은 타겟 DNA 1마이크로리터를 각 RPA 반응에 첨가하고 와류하여 잘 섞는다. 다음으로, 100 밀리몰 마그네슘 클로라이드 7 마이크로 리터를 피펫팅하여 반응을 시작합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 분석을 완료합니다. CRISPR RNA로 Lachnospiraceae 박테리아 CAS12a 단백질을 준비하여 기능 복합체를 형성합니다. 박테리아 단백질과 10 X CRISPR/Cas12a 반응 완충액을 혼합합니다.

이제 500 나노몰 단일 가닥 DNA 리포터 프로브를 추가합니다. CRISPR/Cas12a CRISPR RNA 반응 혼합물에 RPA 반응 산물 1마이크로리터를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

마이크로플레이트 리더로 형광 신호를 측정합니다. 스마트폰 현미경으로 검출하려면 먼저 준비된 반응 혼합물을 후퇴된 유리 슬라이드에 피펫팅합니다. 그런 다음 배양 전에 커버슬립으로 덮으십시오.

슬라이드를 스마트폰 현미경의 스테이지에 놓고 초점 거리와 선명도를 조정합니다. 형광 신호를 측정하기 위해 이미지를 캡처합니다. ImageJ를 사용하여 각 이미지의 평균 회색 값과 농도 그룹에서 평균 회색 값의 표준 편차를 측정합니다.

분류를 위해 딥러닝 모델 AlexNet 33을 채택합니다. 이제 Python을 사용하여 입력 이미지의 모양을 3개 채널로 224 x 224로 변경합니다. 마지막으로, ImageNet 데이터 세트와 함께 사전 훈련된 백본 네트워크를 사용하여 이미지 특징을 추출합니다.

여섯 번째 쌍의 프라이머는 최대 증폭 효율을 제공하고 선택되었습니다. CRISPR RNA-3는 측부 절단에 가장 효율적인 것으로 입증되었습니다. 엄선된 RPA 프라이머 및 CRISPR RNA와 함께 개발된 검출 시스템을 사용한 결과 10 aM FV3와 대조군 간에 상당한 차이가 발생했습니다.

기억해야 할 가장 중요한 점은 특정 CAS 12a 검출 단계입니다. 반응의 CRISPR RNA는 CAS 12a 검출을 기반으로 다른 DNA 바이러스를 표적으로 하도록 수정하거나 재설계할 수 있습니다. 제안된 방법은 표적 바이러스의 양에 대한 예비 평가에 도움이 될 수 있습니다.

이를 기반으로 qPCR과 같은 다른 방법을 사용하여 보다 정확한 바이러스 부하를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 DNA 바이러스의 휴대용 검출을 위한 예비 시도를 제공합니다. 이 프로토콜에 사용된 개구리 바이러스3의 경우, 적시에 검출하면 효과적인 보호 조치를 취할 수 있어 사육 산업의 손실을 줄일 수 있습니다.