Name: 기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 배우세요 기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포(RPE)를 분리하는 효율적인 방법을. 이 기술은 고품질 RNA 샘플을 확보하여 유전자 발현 분석 및 망막 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 일본 과학 진흥 협회 해외 연구 펠로우십(S.G.), Loris and David Rich 박사후 연구원(S.G.) 및 국립 보건원 국립 안과 연구소(R01EY012392; C.F.W.)입니다.

이 연구에 사용된 모든 동물 관리 및 치료는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 실험 프로토콜은 University of California, Berkeley의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 기니피그 눈의 적출술
<ol><li>마취하에 전달되는 나트륨 펜토바르비탈의 심장 내 주사로 기니피그를 안락사시킵니다(산소 중 5% 이소플루란).</li>
	<li>집게와 가위를 사용하여 눈을 적출하고 즉시 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 든 10cm 페트리 접시에 옮겨 세척합니다. 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다. 참고: 웰당 6mL의 용액이 들어 있는 4웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 안구 후방 안구 및 RPE/맥락막/공막 복합체의 분리
<ol><li>해부 현미경의 도움으로 18G 바늘을 사용하여 윤부 경계(즉, 각막과 공막 사이) 뒤 약 1.0mm의 공막에 초기 작은 절개를 합니다(그림 1A). 그런 다음 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 전방 부분을 제거합니다.</li>
	<li>다음으로, 나머지 후방 안구 분절 안구 컵으로 작업하여 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리합니다. 집게를 사용하여 먼저 Zinn의 구역을 잡은 다음 부드럽게 잡아당긴 다음 조각화 없이 망막을 점진적으로 벗겨냅니다(그림 1B). 참고: 망막 단편화 및 불완전한 망막 조직 분리를 피하기 위해 망막을 직접 파악해서는 안 됩니다. 이 해부 단계에는 현미경을 사용하는 것이 필수적입니다.</li>
</ol>3. 맥락막에서 RPE 분리
<ol><li>망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 조직 보관 시약에 5분 동안 담그십시오( 재료 표 참조). 참고: 각각 12mL의 조직 저장 시약으로 채워진 식별된 웰이 있는 2웰 플레이트를 사용합니다.</li>
	<li>아이컵을 4mL의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2mL의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.</li>
	<li>최종 RPE 격리 단계를 위해 PBS로 채워진 1mL 주사기에 30G 바늘을 부착합니다. 주사기를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 먼저 이 스트림을 RPE에 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만든 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 향하게 하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다(그림 1C). 알림: RPE를 시트로 분리하면 가장 큰 RPE 샘플이 생성됩니다. 다시 말하지만, 이 단계에서는 현미경을 사용하는 것이 필수적입니다.</li>
	<li>맥락막에서 RPE를 분리한 후(그림 1D) 바늘이 없는 1mL 주사기에 RPE 조직을 수집한 다음 수집된 샘플을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>수집된 RPE를 1.5 mL 튜브와 함께 8,000 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다(도 2A).</li>
	<li>PBS 용액을 버리고, RNA 분리 키트에 포함된 바와 같이 350 mL의 용해 완충액으로 대체한다 ( 재료 표 참조); 피펫 20x를 사용하여 혼합하여 샘플의 품질을 보존합니다. 장기 보관 및 보존을 위해 샘플을 -80°C 냉동고로 옮깁니다. 참고: 용해 완충액은 RNA 분리 및 동시 RNA/DNA/단백질 분리 전 세포 및 조직 용해를 위한 RNA 분리 키트의 독점 구성 요소입니다. 용해물에서 RNAses를 비활성화하려면 용해 완충액에 β-메르캅토에탄올을 추가해야 합니다(용해 완충액 1mL당 β-메르캅토에탄올 10μL).</li>
</ol>4. RPE-RNA 추출
<ol><li>RNA 분리 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 제공된 제조업체의 지침에 따라 RPE 샘플에서 RNA를 분리하고 수집합니다. 전기영동을 통해 시료의 품질을 평가합니다. 참고: 설명된 프로토콜은 양질의 산물(즉, 8.0 이상의 RNA 무결성 수[RIN])을 생성했습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358(2018).</li>
<li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li>
<li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+the+retina%3A+Choroidal+modulation+of+refractive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li>
<li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+%28OPN5%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).</li>
<li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+Relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+choroid%2FRPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li>
<li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li>
<li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional%2C+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li>
<li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li>
<li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 기사에서는 어린 색소 기니피그의 눈에서 RPE 유전자 발현 분석에 적합한 RPE를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 RNA가 RNA 특이적 분석에 적합하게 보존되어 상대적으로 오염이 없는 고품질 RPE 샘플을 생성하면서도 비교적 간단하고 효율적이라는 것입니다. 여기에 제공된 예에서 RPE 샘플은 어린(2주령) 기니피그의 눈에서 수집되었지만 프로토콜은 나이가 많은(젊은 성인) 동물로부터 RPE 샘플을 수집하는 데에도 성공적으로 사용되었습니다.
안과 수술 또는 해부에 대한 사전 경험이 거의 없는 연구자의 경우 프로토콜 2.1단계 및 2.2단계가 어려울 수 있습니다. 2.1 단계의 중요한 세부 사항은 공막의 초기 절개 위치이며, 전방 부분을 분리 할 때 홍채와 수정체가 각막과 함께 제거되도록 윤부 뒤쪽 1.0mm에 정확하게 배치해야합니다. 대신 홍채가 후방 안구 분절에 붙어 있으면 다음 단계에서 망막을 성공적으로 분리하는 데 중요한 Zinn의 구역을 찾기가 어렵습니...

RPE는 신경 망막과 혈관 맥락막 사이에 위치한 색소 세포의 독특한 단층으로 구성되며, RPE는 광형질도입 1,2을 포함하여 정상적인 망막 기능의 발달 및 유지에 잘 알려진 역할을 합니다. 최근에, RPE는 눈 성장 조절3 및 근시 4의 발달에 추가적인 핵심 역할을 할당받았다. 이 할당은 망막과 맥락막 사이에 개재된 RPE의 중요한 위치와 눈의 성장과 굴절 이상이 국소적으로 조절된다는 현재 널리 받아들여지고 있는 것을 기반으로 합니다5. RPE는 성장 조절 신호의 원천으로 추정되는 망막을 중계 신호의 두 표적인 맥락막과 공막에 연결하는 신호 중계자로서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨집니다(6,7,8).
대부분의 근시를 특징짓는 축 길이의 증가는 양성으로 간주될 수 없으며, 망막, 맥락막 및/또는 공막과 관련된 병태생리학적 변화는 과도한 안구 신장의 피할 수 없고 현재 잘 알려진 결과를 나타냅니다 7,9. 이러한 맥락에서 RPE는 비유사분열 조직이기 때문에 개별 세포의 스트레칭 및 얇아짐에 의해서만 확장되는 유리체실을 수용할 수 있기 때문에 아마도 가장 취약할 것입니다. 근시성 황반변성과 같은 근시 관련 병리에서의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았지만, RPE는 망막, RPE 및 맥락막의 문서화된 이상과 관련된 실명의 주요 원인 중 하나인 지리적 위축을 포함한 여러 다른 망막 질환의 발병기전과 관련이 있습니다10,11, 12.
인접한 안구 조직의 오염이 없는 RPE 세포의 성공적인 분리는 잠재적으로 다양한 눈/망막 질환의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 많은 연구 기회를 열어줍니다. 그러나 RPE의 분리는 어려운 것으로 입증되었으며, 이러한 이유로 결합된 망막/RPE 또는 RPE/맥락막 샘플을 사용하는 많은 발표된 연구에서 13,14,15. 분자 생물학 연구에 적합한 품질의 RPE의 성공적인 분리와 관련된 연구는 병아리와 생쥐의 눈으로 제한되었다16,17. 예를 들어, Wang et al.18에 의해 기술된 동시 RPE 분리 및 RNA 안정화 (SRIRS) 방법. 생쥐에서 RPE 세포를 분리하는 것은 기니피그 눈에서 잘 작동하지 않는 것으로 보입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 저자 중 한 명(M.F.)이 처음에 나무 뒤쥐 눈으로 프로토타입을 만든 접근 방식을 개선한 것으로, 어린 색소 기니피그의 눈에서 RNA 및 기타 분자 생물학 분석에 적합한 고품질 RPE 샘플을 산출하는 것으로 입증되었습니다19.

<table><tbody><tr><td>슬립 팁이 있는 1mL 주사기</td><td>Bd Vacutainer Labware Medical</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 6웰 조직 배양 플레이트, 평평한 바닥, 멸균</td><td>펙트럼 Chemical Mfg. Corp</td><td>970-95008</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 12 웰 조직 배양 플레이트, 개별, 멸균 Thomas</td><td>Scientific LLC</td><td>1198D72</td><td></td></tr><tr><td>RNA 품질을 확인하기 위한 Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td><td></td><td>자동 전기영동</td></tr><tr><td>Balanced Salt Solutions</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11083-07</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 겸자 번호 5</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>피하 일회용 바늘</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26419</td><td></td></tr><tr><td>피하 일회용 바늘</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>540108</td><td>Max. 속도: 8,000 g</td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td>조직 보관 시약</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA 분리 키트</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>년

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

이 프로토콜은 유전자 발현 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 잠재적으로 적용하기 위해 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포를 분리하는 것을 설명합니다. 눈 성장 조절 및 근시의 맥락에서 RPE는 망막과 맥락막 및 공막과 같은 눈의 두 벽 사이에 위치하기 때문에 성장 조절 신호에 대한 세포 중계자 역할을 할 가능성이 높습니다. RPE를 분리하기 위한 프로토콜은 병아리와 생쥐 모두를 위해 개발되었지만 이러한 프로토콜은 중요하고 널리 사용되는 포유류 근시 모델이 된 기니피그로 직접 번역할 수 없는 것으로 입증되었습니다. 이 연구에서는 분자 생물학 도구를 사용하여 특정 유전자의 발현을 검사하여 샘플에 인접 조직의 오염이 없는지 확인했습니다. 이 프로토콜의 가치는 근시를 유발하는 광학 디포커스에 노출된 어린 색소 기니피그의 RPE에 대한 RNA-Seq 연구에서 이미 입증되었습니다. 눈 성장 조절 외에도 이 프로토콜은 RPE가 연루된 근시 실명의 주요 원인 중 하나인 근시 황반병증을 포함하여 망막 질환 연구에 다른 잠재적인 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 일단 완성되면 RNA 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다.

위의 프로토콜을 사용하여 수집된 RPE 샘플의 분석은 눈당 240.2ng ± 35.1ng(n = 8, NanoDrop, 그림 2B)으로 잘 보존된 RNA(RIN(RIN)&gt;8.0, 그림 2B)를 보여주었습니다. 분리된 RPE 샘플의 품질, 특히 맥락막 및 공막 오염 물질의 부재를 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 RPE 샘플19에서 후자의 조직 각각에 대한 대표 유전자의 발현을 조사하였다. RPE 샘플은 맥락막 및 공막에서 Rpe65 발현 수준과 비교하여 Rpe65(RPE 특이적 유전자)의 발현이 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다(표 1 및 그림 2C). 대조적으로, RPE 샘플은 선택된 맥락막 공막 특이적 유전자인 Col1a1의 최소 발현...

우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

망막 색소 상피 또는 RPE는 망막 건강에 매우 중요합니다. 그리고 분리된 RPE를 연구하는 것은 망막 질환에 매우 중요합니다. 인기 있는 근시 모델인 기니피그에서 RPE를 분리하는 이 방법은 어려운 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 RPE 분석을 포함한 생물학적 분자 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다. 시연 된 기술을 완벽하게 따르고 해부 도구를 조작하는 방법을 관찰함으로써 약간의 연습으로이 절차를 빠르게 마스터 할 수 있습니다. 기니피그를 인도적으로 안락사시키고 동물의 눈을 적출 한 후 즉시 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어있는 10cm 페트리 접시에 옮겨 눈을 씻으십시오.세척 후 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 해부 현미경으로 작업하면서 18 게이지 바늘을 사용하여 각막과 공막 사이의 윤부 경계에서 약 1mm 뒤에있는 한쪽 눈의 공막에 초기 작은 구멍을 만듭니다. 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 앞쪽 부분을 제거합니다.그런 다음 나머지 후방 안구 분절로 작업하여 집게를 사용하여 Zinn의 구역을 잡고 부드럽게 잡아당긴 다음 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리하고 단편화 없이 망막을 벗겨냅니다. 망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 2밀리리터의 조직 저장 시약이 들어 있는 12웰 플레이트의 웰 중 하나에 담그고 5분 동안 담그십시오. 보관 시약을 헹구기 위해 아이컵을 4밀리리터의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2밀리리터의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.최종 RPE 격리 단계를 진행하기 전에 PBS로 채워진 1밀리리터 주사기를 준비하고 30게이지 바늘을 부착합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 현미경으로 작업하면서 먼저 이 PBS 스트림을 RPE로 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만듭니다.그런 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 유도하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다. 맥락막에서 RPE를 분리한 후 바늘이 없는 1밀리리터 주사기에 RPE 세포를 수집하고 수집된 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수집된 RPE를 8, 000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다.RNA 분석에 사용할 샘플의 경우 상층액, 즉 PBS 용액을 버리고 RNA 분리 키트에 포함된

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 토끼 모델에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 절차를 보여줍니다. 이 세포는 망막 퇴행성 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

IPE 및 RPE 세포 분리: 토끼 눈에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 기술

이 비디오에서는 돼지의 눈에서 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하여 in vivo 및 ex vivo 연구를 위한 기본 배양을 얻는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 색소 세포는 안구 질환을 치료하기 위한 재생 접근법을 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.

IPE 및 RPE 세포의 분리: 분리된 돼지 눈에서 색소 상피 세포를 얻는 기술

이 동영상은 채취한 소의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포와 홍채 색소 상피(IPE) 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 분리된 세포를 배양하여 안구 질환 치료에서 자신의 역할을 연구할 수 있습니다.

소의 눈에서 RPE 및 IPE 세포 분리: 소 1차 색소 상피 세포를 수확하고 배양하는 절차

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.

In vitro 모델링을 위한 Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells의 분리

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

배우세요 기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포(RPE)를 분리하는 효율적인 방법을. 이 기술은 고품질 RNA 샘플을 확보하여 유전자 발현 분석 및 망막 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

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