Name: 쥐 모델에서 합자와 지질다당류 주입의 조합을 통한 치주염 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 학습하세요 쥐 모델에서 합자 배치와 지질다당류 주입을 결합하여 치주염을 유도하는 방법을. 이 기법은 치주 질환 진행 연구와 치료법 평가에 유용한 플랫폼을 제공합니다.

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이 작업은 Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (개념 증명 전화 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, ESF 유럽 사회 기금 및 ERDF 유럽 지역 개발 기금 (M.M.B; FI18/00104) 및 Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear(M.M.F.C; FPI/040/2020)을 참조하십시오. 저자는 IdISBa의 실험적 수술 및 플랫폼에서 도움을 준 Anna Tomás 박사와 Maria Tortosa에게 감사드립니다. 마지막으로 CBCT 스캐너에 액세스할 수 있는 ADEMA School of Dentistry에 감사드립니다.

참고: 연구의 실험 프로토콜은 발레아레스 제도 보건 연구소의 동물 실험 윤리 위원회(CEEA-UIB, 참조 번호 163/03/21)의 승인을 받았습니다.
1. 동물 마취 및 시술 준비
<ol><li>수술 전 모든 수술 기구(알루미늄 입 개그, 치과 탐험가, 다이아몬드 랜스, 수술용 가위, 미세 수술용 펜치, 마이크로 바늘 홀더, 홀렌백 조각기, 골막 미세 수술 엘리베이터, 미세 수술 가위)(135°C에서 5분)를 소독합니다.</li>
	<li>설명 된대로 멸균 상태에서 절차에 필요한 모든 용액을 준비하십시오.<ol><li>인산염 완충액(PBS)/식염수에 희석한 60mL의 케타민과 8mL의 케타민과 1.6mL의 자일라진을 혼합하여 케타민(1mg/mL)과 자일라진(1mg/mL)의 혼합물을 준비합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>아티파메졸을 PBS/식염수에 0.25mg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>부프레노르핀을 PBS/식염수에 0.03mg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>멸균 식염수에 Pg-LPS(1mg/mL) 1mL를 준비합니다. 스톡을 -20 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 위해 수술 당시 12 주령과 체중 210-350g의 암컷 및 수컷 Wistar 쥐를 사용하십시오. 적절한 환경과 일정한 조건(20-24°C, 하루 명암 주기당 12시간)에서 동물을 그룹으로 수용하고 음식과 표준 물을 임의로 제공하십시오.</li>
	<li>마취를 유도하기 위해 쥐의 체중을 측정하고 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 80/10mg/kg 농도의 케타민/자일라진 혼합물을 복강내(IP) 투여합니다.</li>
	<li>쥐를 마취시킨 후, 동물을 가열 된 수술 플랫폼에 등을 대십시오. 시술 과정에서 열 손실을 막기 위해 동물의 몸을 덮으십시오. 참고: 마취 깊이는 시술 중 페달 반사의 상실과 활력 징후를 모니터링하여 평가됩니다. 필요한 경우 작은 노즈 콘을 사용하여 100% 산소에 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 마취유도 후 양쪽 눈에 멸균 안과용 연고를 발라 각막을 보호하고 건조를 방지한다.</li>
	<li>시술 중 작은 노즈콘을 이용하여 100% 산소를 투여하고 맥박산소측정기로 맥박수와 산소포화도를 모니터링한다. 알림: 산소 포화도와 맥박수가 각각 95% 및 190bpm 미만으로 떨어지면 절차를 중단하고 정상 값에 도달할 때까지 동물을 측면 욕창 위치에 놓습니다.</li>
	<li>앞니(상하)에 알루미늄 입 개그를 사용하여 쥐 입을 열고 혀를 집어넣고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정화하여 하악 어금니에 접근할 수 있도록 합니다. 참고: 동물을 측면 데쿠비투스에 배치해야 하는 경우 회복을 위해 위치를 변경하기 전에 입 개그를 제거하십시오. 동물이 마취되면 수술 전에 치은 열구액(GCF)을 수집합니다(기저 조건의 샘플)(0일).</li>
	<li>다음 단계에 설명된 대로 GCF를 수집합니다.<ol><li>동물을 수술 플랫폼에 등을 대고 알루미늄 입 개그로 열린 자세로 상악과 하악을 안정시킵니다.</li>
		<li>총 4개(각 M1에 대해 2개)의 흡수성 종이 점 nº 30(직경 0.03cm x 길이 3cm)을 사용하여 GCF를 M1의 근심구개 주위의 치은 틈새(치은 상피와 인접한 법랑질 사이의 공간)에 삽입하여 수집합니다. 용지 포인트를 총 30초 동안 동일한 위치에 유지한 후 즉시 제거하십시오.</li>
		<li>수집 후 종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 보유 합자 기술 및 치은 연내 Pg-LPS 주입
참고: 합자 모델은 미세 수술 기구를 사용하여 치은 고랑 내 M1 주위에 양측으로 멸균 편조 실크 합자(5/0)를 배치하고 구개 표면에 외과의의 매듭으로 고정하여 생성되었습니다(0일). 사용된 미세 수술 기구는 미세 수술용 펜치, 마이크로 바늘 홀더, 홀렌백 조각기, 골막 미세수술 엘리베이터 및 미세 수술 가위였습니다. LED 광원이 있는 수술용 확대경도 사용되었습니다(3.6배 배율).
<ol><li>봉합사의 원위 꼬리를 치열의 구개 쪽에 놓고 M1과 제2 상악 어금니(M2)의 접촉 사이에 근위 부분을 삽입합니다.</li>
	<li>골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 고랑 내에 봉합사를 삽입합니다. 이 수준의 조직은 부착된 치은의 좁은 영역을 나타내므로 M1의 협측 표면 주위에 합자를 매우 조심스럽게 감쌉니다. 구개 측면에서는 봉합사가 잇몸 고랑으로 들어가도록 양쪽 끝이 조여졌는지 확인하십시오. 알림: M1과 M2 사이에 봉합사를 삽입할 때 저항이 관찰되면 치과용 탐색기와 다이아몬드 랜스 모양의 버를 사용하여 접점을 약간 열 수 있습니다.</li>
	<li>봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 짧게 자릅니다. 고랑에 매듭을 삽입하십시오. 알림: 수술 기구의 팁은 구강 외상과 출혈을 유발할 수 있습니다. 구강에서 혈액을 제거하기 위해 작은 부분의 거즈 또는 면봉을 준비하고 출혈을 멈추기 위해 압력을 가하십시오. 미세 수술 접근법을 통한 신중한 연조직 관리는 수술 합병증을 최소화하고 조직 외상을 줄입니다.</li>
	<li>합자 위치 지정 후, 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 멸균 식염수에 40μL의 Pg-LPS를 M1의 근위-구개 쪽에 있는 치은연하 조직(치아의 뿌리 또는 목과 잇몸 가장자리 사이)에 양측으로 주입합니다(0일).</li>
</ol>3. 절차 종료
<ol><li>결찰 위치 지정 및 Pg-LPS 적용 후 수술 상태에서 쥐를 풀어주고 열 램프 아래의 깨끗한 개별 케이지에 넣습니다.</li>
	<li>길항제 아티파메졸(0.5mg/kg 피하(SC))에 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 주사합니다.</li>
	<li>통증 완화를 위해 0.03mg/kg 부프레노르핀, SC를 주사하십시오.</li>
	<li>수술의 효과가 완전히 바뀔 때까지 동물의 회복을 모니터링하십시오. 일정한 조건(20-24°C, 하루 명암 주기당 12시간)에서 적절한 환경에 각 쥐를 개별적으로 수용합니다. 음식과 탈이온수를 임의로 제공하십시오.</li>
	<li>시술 후 처음 2일 동안 동물의 체중을 측정하고 통증 완화를 위해 Buprenorphine SC를 하루에 두 번 주사합니다. 참고: 와인드업 효과를 제거하기 위해 절차를 시작하기 전에 부프레노르핀을 투여할 수 있습니다.</li>
	<li>실험 시간 동안, 일주일에 한두 번 체중 및 일반적인 행동 평가에 의해 동물을 모니터링한다.</li>
</ol>4. 시술 후 후속 조치
참고: PD의 유도는 박테리아 생물막의 축적과 그에 따른 염증을 촉진하기 위해 14일 동안 유지되었습니다. 합자를 검사하고 조정해야 하며 Pg-LPS는 일주일에 세 번(2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일) 주사됩니다.
<ol><li>합자(2일차, 4일차, 6일차, 8일차, 10일차, 12일차)를 다음과 같이 검사하고 조정합니다.<ol><li>마취 유도 챔버를 사용하여 100% 산소에 2% 이소플루란으로 마취합니다.</li>
		<li>쥐를 마취 한 후, 동물을 등에 대고 동물 마취 유지를 위해 100 % 산소에 1 % 이소 플루 란을 사용하여 시술 중에 작은 코 콘을 사용하십시오.</li>
		<li>앞니(상하) 주위의 알루미늄 입 개그를 사용하여 쥐 입을 열고 혀를 수축시키고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정화하여 합자에 접근할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 치은에 대한 합자를 조이고 합자의 봉합사가 삽입되어 치은 주위에 염증을 유발하는지 확인합니다. 참고: 수술 후 7-10일이 지나면 합자가 손실될 수 있습니다. 이 경우 Pg-LPS 주입에 대해 설명된 프로토콜을 따르십시오(2.4단계).</li>
	</ol></li>
	<li>합자 조정 후, M1의 중구개 쪽에 있는 치은연하 조직에 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기가 있는 Pg-LPS 40μL를 양측 주사합니다(2일, 4일, 6일, 8일, 10일 및 12일).</li>
	<li>마취를 위해 코 콘을 제거하고 쥐를 새장에 넣으십시오. 마취 효과가 완전히 바뀔 때까지 동물의 회복을 모니터링하십시오.</li>
</ol>5. 동물 희생과 분석
참고: PD의 진행을 평가하기 위한 다양한 옵션이 있습니다. 여기에서 설명된 분석은 치은 열구액(GCF)에서 전염증성 사이토카인의 평가와 치조골의 손실 평가로 구성됩니다.
<ol><li>연구의 14일째(14일째)에, 동물을 이산화탄소 챔버에서CO2로 희생시켰다. 설치류의 경우 챔버 부피/분의 30%에서 70%의 변위 비율을 권장합니다. 참고: 안락사를 확인하려면 페달 반사에 대한 동물 반응의 부족과 활력 징후의 부재를 확인해야 합니다.</li>
	<li>다음 단계에 설명된 대로 GCF를 수집합니다. 참고: GCF는 PD 유도 전(수술 전)(0일) 및 PD 유도 후(희생 후)(14일)에 수집됩니다.<ol><li>동물을 수술 플랫폼에 등을 대고 알루미늄 입 개그로 열린 자세로 상악과 하악을 안정시킵니다.</li>
		<li>GCF를 M1의 mesio-palatal 주위의 치은 틈새에 삽입하여 30번 점(직경 0.03cm x 길이 3cm)의 흡착지를 사용하여 약간의 저항이 있을 때까지 수집합니다. 용지 포인트를 총 30초 동안 동일한 위치에 유지한 후 즉시 제거하십시오.</li>
		<li>수집 후 종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>GCF 내에서 단백질을 평가하려면 다음 용액을 준비하고 설명된 대로 용출 방법의 단계를 따르십시오. 참고: IL-1β는 제조업체의 프로토콜에 따라 면역분석법을 사용하여 GCF(14일)에서 평가됩니다.<ol><li>용출 완충액을 신선하게 준비하고 전체 추출 과정에서 얼음 위에 보관하여 프로테아제 활성을 억제합니다.</li>
		<li>설명된 대로 용리 버퍼에 필요한 모든 용액을 준비합니다.<ol><li>초순수에 아프로티닌 1mL(1mg/mL)를 준비합니다.</li>
			<li>메탄올에 10mL의 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)(200mM)를 준비합니다.</li>
			<li>PBS 용액 24.5mL(pH = 7.4)에 PMSF 125μL와 아프로티닌 250μL를 넣어 용출 완충액을 제조합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>상용 포스파타제 억제제 정제 1개를 4°C에서 10분 동안 교반하면서 새로 제조된 용출 완충액 10mL와 함께 용해시킵니다. 참고: GCF 용출 기간은 제한되어 있습니다. 처음 30분 이내에 포스파타제 억제제 정제를 첨가한 후 원심분리에 즉시 사용하십시오.</li>
		<li>포스파타제 억제제를 첨가한 후, 11 μL의 완전 용출 완충액을 종이 뾰족한 튜브에 직접 첨가합니다.</li>
		<li>튜브를 452 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>용출된 내용물을 새 플라스틱 바이알에 옮깁니다. 이 과정을 4회 더 반복하여 총 부피 50μL를 산출합니다.</li>
		<li>마지막 원심분리 후 총 부피 60μL를 종이 지점에 직접 추가하고 4°C에서 5분 동안 452 x g 에서 마지막으로 한 번 더 원심분리합니다.</li>
		<li>단백질 평가를 위해 용리된 필요한 부피를 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>안락사와 GCF 수집 후 수술 가위를 사용하여 쥐의 상부 턱을 잘라냅니다. 쥐의 가면을 벗겨 내고 가능한 한 작은 연조직을 남겨 두십시오.</li>
	<li>시각화를 위해 현미경 단계에 턱을 배치하고 원하는 배율로 사진을 찍습니다.</li>
	<li>PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드(PFA)에 턱을 직접 넣습니다. 완전한 고정을 위해 12일 동안 새 PFA로 일주일에 두 번 새로 고칩니다. 주의 : PFA와 관련된 단계는 안전 보건 자료 권장 사항에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>턱을 완전히 고정한 후 다음과 같이 원뿔형 컴퓨터 단층 촬영(CBCT) 스캐너를 사용하여 뼈 손실을 평가합니다.<ol><li>PC를 엽니다.</li>
		<li>CBCT 분석 프로그램을 엽니다.</li>
		<li>Scan Protocol(스캔 프로토콜) > Denture Scan Mode(의치 스캔 모드)를 선택합니다.</li>
		<li>시야각(FOV) > (11x8) HIRes(90kV 전압 및 3mA 전류)를 선택합니다.</li>
		<li>갠트리에 쥐의 고정 된 상악골을 놓습니다.</li>
		<li>다음을 클릭합니다.</li>
		<li>X선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 스캔하는 전체 시간 동안 계속 누르고 있음).</li>
		<li>필요한 경우 제어 버튼을 눌러 상악을 정면 중앙으로 재배치한 다음 X 선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 스캔 기간 동안 계속 누르고 있음).</li>
		<li>다음을 클릭합니다.</li>
		<li>X선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 스캔하는 전체 시간 동안 계속 누르고 있음).</li>
		<li>필요한 경우 제어 버튼을 눌러 시상면 중앙에 의치를 재배치한 다음 X 선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 스캔 기간 동안 계속 누르고 있음).</li>
		<li>다음을 클릭합니다.</li>
		<li>시작 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 검사 기간 동안 계속 누르고 있음). 처리 메시지가 수신될 때까지 기다린 후 표시된 지침을 따릅니다.</li>
		<li>창 보기가 나타납니다. 회색을 65%로 조절하고 적용을 클릭합니다.</li>
		<li>스캔을 저장하려면 파일을 클릭하고 DICOM 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 모든 이미지( All Images )를 클릭하고 DICOM 내보내기 선택 창에서 표시된 모든 매개변수(초기 이미지, 원본 축방향, 재포맷된 축방향, 다중 평면)를 선택하고 미리 정의된 유형을 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상악어금니의 2차원 및 시상 대표 이미지를 다음과 같이 분석 프로그램을 사용하여 처리합니다.<ol><li>소프트웨어를 엽니 다.</li>
		<li>파일 및 열기를 클릭한 다음 DICOM 형식의 이미지가 있는 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다.</li>
		<li>"8비트로 변환" 창이 나타날 때까지 기다렸다가 0에서 6,000 사이의 범위를 선택하고 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>Raw 이미지를 클릭합니다.</li>
		<li>선택 영역의 위쪽과 아래쪽을 정의하여 관심 영역을 제한합니다. 치조골이 나타나는 첫 번째 이미지와 마지막 이미지를 검색하고 선택 명령의 맨 위 와 맨 아래에서 선택합니다. 참고: 어금니의 치조골의 대표적인 2차원 이미지는 그림 3A,B에서와 같이 내보낼 수 있습니다.</li>
		<li>시상 대표 이미지의 경우 프로필 표시줄 토글을 클릭합니다.</li>
		<li>구개 중간에 시상선을 그리고 모델 슬라이스 재생(Reslice model)을 클릭합니다. 관심 영역을 구분하기 위한 매개 변수(슬라이스 간격: 1, 슬라이스 수: 100)를 결정하고 [확인]을 클릭합니다. 리슬라이싱 모델이 끝날 때까지 기다립니다. 마지막으로 Resliced 이미지 저장을 클릭합니다. 참고: 어금니의 치조골에 대한 대표적인 시상 상상은 그림 3C,D에서와 같이 내보낼 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Marchesan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+murine+model+to+study+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An experimental murine model to study periodontitis.</a> Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).</li>
<li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+ligature-induced+periodontitis+in+mice+to+explore+the+molecular+mechanism+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900(2021).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 방법은 Pg-LPS 주사와 M1 주위에 합자 배치를 결합한 기술에 따라 쥐에서 PD의 유도를 설명하며, 이 방법 후 14일 이내에 치주 조직과 치조골의 상당한 변화가 유도될 수 있음을 보여줍니다.
이 절차 중에 다른 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 동물 마취 및 시술 준비 중에 동물의 올바른 위치를 보장하고, 앞니 주위에 알루미늄 입 개그로 열린 쥐 입을 안정화하고, 개그와 수술 도구로 동물이 다치는 것을 방지하는 것과 마찬가지로 수술 과정에서 적절한 마취를 평가하는 것이 성공에 매우 중요합니다. 산소 포화도와 맥박수가 떨어지면 절차를 중단하고 정상 값에 도달 할 때까지 동물을 측면 욕창 위치에 놓아야합니다. 합자 자세를 취하는 동안 다른 부위의 통증과 염증을 예방하기 위해 연조직 손상을 최소화해야 한다는 점을 고려하여 봉합사와 매듭을 고랑에 올바르게 삽입하는 것이 중요합니다. 동물의 복지와 관련된 윤리적 문제를 고려할 때 마취 효과가 완전히 바뀔 때까...

치주염(PD)은 전 세계적으로 6번째로 널리 퍼진 공중 보건 질환으로, 전체 인구의 약 11%에 영향을 미치며, 진행성, 비가역적, 파괴적 형태의 치주 질환이다 1,2. PD는 치은 및 치주 조직에 영향을 미치는 염증 과정으로, 치은 후퇴, 포켓 발달을 동반한 접합 상피의 정점 이동, 치조골 손실을 초래합니다3. 또한, 파킨슨병은 심혈관 질환, 비만, 당뇨병 및 류마티스 관절염을 포함한 여러 전신 질환과 관련이 있으며, 환경 및 숙주 특이적 요인이 중요한 역할을 한다 4,5.
따라서, PD는 주로 미생물 군집의 dysbiosis로 인한 미생물 플라크의 축적과 치주 병원체에 대한 과장된 숙주 면역 반응에 의해 시작되어 치주 조직의 파괴를 초래하는 다인성 질환입니다 4,6. 여러 치주 박테리아 중에서 그람 음성 혐기성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis는 PD4의 주요 병원체 중 하나입니다. P. gingivalis는 염증이 있는 치주 조직에서 다형핵 백혈구 침윤 및 혈관 확장을 유도하는 것으로 알려진 분자인 복합 지질다당류(LPS)를 벽에 함유하고 있다7. 그 결과 인터루킨 1(IL-1), IL-6, IL-8과 같은 염증 매개체, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 프로스타글란딘이 생성되어 파골세포가 활성화되고 뼈 흡수가 일어나 조직 파괴와 궁극적인 치아 손실이 발생합니다3.
동물 모델의 다양한 장점 중에는 인간에서와 같이 세포 복잡성을 모방할 수 있는 능력, 또는 제한된 세포 유형의 플라스틱 표면에서 수행되는 시험관 내 연구보다 더 정확하다는 점이 있다8. 생체 내에서 PD를 실험적으로 모델링하기 위해 인간이 아닌 영장류, 개, 돼지, 흰 족제비, 토끼, 생쥐 및 쥐와 같은 다양한 동물 종이 사용되었습니다9. 그러나, 래트는 파킨슨병의 발병기전에 대해 가장 광범위하게 연구된 동물 모델인데, 그 이유는 이들이 저렴하고 다루기 쉽기 때문이다10. 그들의 치은 조직은 인간의 치은 조직과 유사한 구조적 특징을 가지고 있으며, 얕은 치은 고랑과 접합 상피가 치아 표면에 부착되어 있습니다. 또한, 인간과 마찬가지로 접합 상피는 염증 세포에서 박테리아, 이물질 및 삼출물의 통과를 촉진한다 9.
쥐의 PD 유도에 대해 가장 많이 보고된 실험 모델 중 하나는 치아 주위에 합자를 배치하는 것인데, 이는 기술적으로 어렵지만 신뢰할 수 있습니다10. 합자 배치는 치태와 박테리아 축적을 촉진하여 치주 조직 염증 및 파괴를 유발하는 치은 고랑에 dysbiosis를 생성합니다11. 치주 부착의 상실 및 치조골의 재흡수는 이 쥐 모델8에서 7일 이내에 발생할 수 있다.
PD에 대한 또 다른 동물 모델은 치은 조직에 LPS를 주입하는 것으로 구성됩니다. 결과적으로 파골 세포 형성과 뼈 손실이 자극됩니다. 이 모델의 조직병리학적 특징은 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인, 콜라겐 분해 및 치조골 흡수를 특징으로 하는 인간이 확립한 PD와 유사합니다 6,8.
따라서 본 연구의 목적은 제1 상악 어금니(M1) 주위의 합자 배치와 결합된 P. gingivalis-LPS(Pg-LPS) 주사 기술을 기반으로 한 실험 PD의 간단한 쥐 모델을 설명하는 것이었습니다. 이것은 인간 PD 질환에서 관찰되는 것과 유사한 특성을 가진 모델로, 질병 진행 메커니즘 및 향후 가능한 치료법 연구에 사용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>흡착제 종이 포인트 n&ordm; 30&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>8187</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Dechra</td><td>573751.5</td><td>Revanzol 5 mg/mL</td></tr><tr><td>꼰 실크 합자 (5/0)&nbsp;</td><td>Laboratorio Arago Sl</td><td>613112</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀&nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>578816.6</td><td>Bupaq 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>콘-빔 컴퓨터 단층 촬영 (CBCT) 스캐너&nbsp;</td><td>MyRay</td><td>하이페리온 X9</td><td>모델 하이페리온 X9</td></tr><tr><td>CTAn 소프트웨어</td><td>SkyScan</td><td></td><td>버전 1.13.4.0</td></tr><tr><td>치과 탐색기&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>99743</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 랜스 모양 버&nbsp;</td><td>Dentaltix</td><td>IT21517</td><td></td></tr><tr><td>식품 유지 다이어트</td><td>Sodispain 연구</td><td>ROD14&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>가열식 수술 플랫폼</td><td>PetSavers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hollenback 조각가</td><td>Hu-FRIEDY&nbsp;</td><td></td><td></td>HF45234</tr><tr><td>피하 주사 바늘&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>25G x 5/8" - 0,5 x 16 MM</td></tr><tr><td>이소플루란&nbsp;</td><td>Karizoo</td><td></td><td>Isoflutek 1000mg/g</td></tr><tr><td>케타민&nbsp; &nbsp;</td><td>Dechra</td><td>581140.6</td><td>Anesketin 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide&nbsp; P.Gingivalis에서 유래;</td><td>InvivoGen</td><td>TLRL-PGLPS</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M/4000/PB08</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 니들 홀터</td><td>펠링 수술 기구</td><td>KOT-6</td><td></td></tr><tr><td>마이크로그래지컬 플라이어</td><td>KLS Martin</td><td>12-384-06-07</td><td></td></tr><tr><td>마이크로그래지컬 가위&nbsp;</td><td>에스& T 마이크로외과 수술 기구</td><td>SDC-15 RV</td><td></td></tr><tr><td>모니터 iMEC 8 Vet</td><td>Mindray&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티플렉스 비드 면역분석법</td><td>Procartaplex, Thermo fisher Scientific</td><td>PPX-05</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Periosteal 미세수술 엘리베이터&nbsp;</td><td>덴탈틱</td><td>스 CU19112468</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼 솔루션 (PBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>상업용 포스파타제 억제제 정제&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스틱 바이알</td><td>SPL Lifesciencies</td><td>60015</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>식염수</td><td>Cinfa</td><td>204024.3</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>모델 SteREO Discovery.V12</td></tr><tr><td>수술용 루페 led 라이트</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위&nbsp;</td><td>Zepf Surgical</td><td>08-1701-17</td><td></td></tr><tr><td>주사기&nbsp;</td><td>BD plastipak</td><td>303172</td><td>1mL</td></tr><tr><td>수의학 치과 마이크로 모터</td><td>Eickemeyer</td><td>174028</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Calier</td><td>20102-003</td><td>Xilagesic 20 mg / mL</td></tr></tbody></table>

쥐 모델에서 합자와 지질다당류 주입의 조합을 통한 치주염 유도

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

치주염(PD)은 치주 연조직, 치주 인대, 시멘트질 및 치조골의 손실을 초래하는 매우 만연한 만성 면역 염증성 질환입니다. 본 연구에서는 랫트에서 PD를 유도하는 간단한 방법을 설명한다. 우리는 첫 번째 상악 어금니(M1) 주위에 합자 모델을 배치하고 M1의 근심-구개 쪽에 있는 Porphyromonas gingivalis 에서 파생된 지질다당류(LPS) 주사의 조합에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 치주염의 유도는 14일 동안 유지되어 박테리아 생물막의 축적과 염증을 촉진하였다. 동물 모델을 검증하기 위해 주요 염증 매개체인 IL-1β를 치은 틈새액(GCF)에서 면역분석법으로 측정하고 원뿔형 컴퓨터 단층촬영(CBCT)을 사용하여 치조골 손실을 계산했습니다. 이 기술은 14일 후 실험 절차 종료 시 치은 후퇴, 치조골 손실 및 GCF의 IL-1β 수준 증가를 촉진하는 데 효과적이었습니다. 이 방법은 파킨슨병 유도에 효과적이어서 질병 진행 기전 및 향후 가능한 치료법에 대한 연구에 사용할 수 있습니다.

실험 단계의 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2A 는 실험 시간 0에서 M1의 고랑 주위에 합자가 배치된 외과적 개입 후 하악의 이미지를 보여줍니다. 그림 2B 는 시술 14일 후 M1 주변의 합자가 치은 고랑으로 들어가 치은의 염증을 유발하고 침윤성 축적을 일으키는 방법을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64842/64842fig01.jpg"> 그림 1: 쥐의 치주염(PD) 유도 실험 절차 타임라인의 개략도. <a href="https://www.jove.com...

이 연구에서는 첫 번째 상악 어금니 주위에서 14일 동안 Porphyromonas gingivalis에서 추출한 지질다당류의 유지 합자와 반복 주사의 조합을 통해 치주염 유도의 쥐 모델을 제시합니다. 결찰 및 LPS 주사 기술은 치조골 손실과 염증을 유발하는 근막염 유도에 효과적이었습니다.

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

이것은 합자 배치와 결합된 지질다당류 주사 기술을 기반으로 하는 실험적 치주염의 쥐 모델로, 질병 진행을 연구하고 치주염 치료법을 평가하는 효과적인 방법을 제공합니다. 두 기술을 개별 방법과 결합하면 빠른 질병 유도, 파괴적인 염증 반응 증폭 및 결합 조직 손실 및 치조골 흡수 증가로 절정에 달합니다. 이 방법은 치주염 치료의 영향을 평가할 수있는 귀중한 기회를 제공합니다.절차를 시연하는 것은 Dr.Oscar Villa, PhD. 수술 전에 모든 수술 도구를 멸균하는 것으로 시작하십시오. PBS 또는 식염수로 희석한 케타민 1.6ml와 자일라진 1mg을 혼합하여 케타민과 자일라진의 혼합물을 준비하고 육수를 섭씨 4도에서 보관하십시오.아티파메졸을 PBS 또는 식염수에 밀리리터당 0.25mg의 최종 농도로, 부프레노르핀을 밀리리터당 0.03mg의 최종 농도로 희석하고 주식을 섭씨 4도에 보관하십시오. 멸균 식염수에 1 밀리리터의 PG-LPS를 준비하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 실험에 암컷과 수컷 Wistar 쥐를 사용하십시오.적절한 환경에서 동물을 그룹으로 수용하고 음식과 표준 물을 임의로 제공하십시오. 쥐를 마취시킨 후, 동물을 가열 된 수술 플랫폼에 등을 대십시오. 열 손실을 방지하기 위해 절차 중에 동물의 몸을 덮으십시오.작은 노즈콘을 이용하여 100% 산소를 투여하고, 맥박산소측정기로 맥박수와 산소포화도를 모니터링한다. 이제 앞니 주위에 알루미늄 입 개그를 사용하여 쥐 입을 엽니다. 그것으로 혀를 수축시키고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정시켜 하악 어금니에 접근 할 수 있도록합니다.총 4개의 흡수성 종이 점 번호 30을 사용하여 GCF를 수집하고, 약간의 저항이 있을 때까지 M1의 중구개 주위의 치은 틈새에 삽입합니다. 용지 끝을 30초 동안 같은 위치에 유지한 후 즉시 제거하십시오. 수집 후 종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.봉합사의 말단 꼬리를 치열의 구개 쪽에 놓고 M1과 두 번째 상악 어금니의 접촉 사이에 근위 부분을 삽입합니다. 골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 고랑 내에 봉합사를 삽입합니다. 이 수준의 조직은 부착된 치은의 좁은 영역을 나타내므로 M1의 협측 표면 주위에 합자를 매우 조심스럽게 감쌉니다.봉합사가 잇몸 고랑으로 들어가도록 양쪽 끝이 조여졌는지 확인합니다. 그런 다음 봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 짧게 자릅니다. 고랑에 매듭을 삽입하십시오.합자 위치 지정 후 멸균 식염수에 40마이크로리터의 PG-LPS를 M1의 중구개 쪽에 있는 치은연하 조직에 양측으로 주입합니다. 합자를 검사하고 조정하려면 마취된 동물을 등에 대고 시술 중에 동물 마취 유지를 위해 1% 이소플루란과 100% 산소가 포함된 작은 노즈 콘을 사용합니다. 앞니 주위의 알루미늄 입 개그를 사용하여 랩 입을 열고 혀를 수축시키고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정화하여 합자에 접근할 수 있도록 합니다.골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 합자를 치은에 대고 조이고 합자의 봉합사가 삽입되어 치은 주위에 염증을 유발하는지 확인합니다. 합자 조정 후, 앞서 설명한 바와 같이 M1의 중구개 쪽에 있는 치은연하 조직에 40마이크로리터의 PG-LPS를 양측으로 주입합니다. 14 일째에 동물을 희생 한 후 앞과 같이 GCF를 수집하십시오.종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 상악 어금니의 치조골의 2차원 이미지는 치주염 발병 후 기저 조절에서 더 많은 뼈 부피와 더 높은 치조골 손실을 보여줍니다. 시상 이미지의 분석은 기저 대조군에 비해 치주염 확립 후 M1 및 M2의 경골 간 영역에서 더 중요한 치조골 손실을 강조합니다.희생 후, 구개는 다른 그룹 사이에서 M1의 치은 후퇴의 차이를 나타냈다. 치주염 그룹은 기저 대조군에 비해 상악 어금니 주위의 치은 이동과 염증이 더 현저합니다. 또한, 치주염 그룹은 대조군보다 GCF로부터 전염증성 사이토카인 1L-1 베타의 방출이 유의하게 높은 것으로 나타났다.절차의 중요한 단계는 고랑에 봉합사와 매듭을 올바르게 배치하고, 합자를 적절하게 조정하고, 14일 프로토콜 동안 정확한 지질다당류 주입입니다.

induction-periodontitis-via-combination-ligature-lipopolysaccharide

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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