Name: 유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 배우세요 Z-REX 방법을 활용하여 유충 제브라피쉬에서 반응성 소분자 신호전달을 정밀하게 분석하는 기술입니다. 이 방법은 특정 리간드-표적 상호작용과 표현형 변화를 연결하여 삼중음성 유방암 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

REX 기술에 의해 발견된 동형 특이적 소분자 키나제 억제제가 특허 출원을 위해 출원되었습니다

이 프로토콜에 설명된 Z-REX는 활어의 친전자성-표적 쌍 조사 및 신호 전달 경로 디콘볼루션을 위한 강력한 전략을 보여줍니다. 근접 지향 전달은 친전자성 화합물 처리의 투여량 및 공간 제어를 가능하게 합니다. 배치된 친전필의 초생리학적 농도가 종종 표적 이탈 문제를 유발하는 기존의 볼루스 투여 방법과 달리, 시스템에 방출되는 친전자성의 상대적으로 적은 양은 Z-REX를 대체로 비침습적으로 만듭니다. 우리는 제브라피쉬 배아에 0.1-6μM Ht-PreHNE(알킨)를 사용했으며, 그 결과 치료가 배아 발달에 해롭지 않은 것으로 나타났다11.
Z-REX 절차는 일반적으로 배양된 세포에서 친전자성 감지 단백질을 스크리닝/연구하는 기술인 T-REX보다 깁니다. 실험의 목적이 친전자성-표적 상호작용을 스크리닝하는 것이라고 가정합니다. 먼저 배양된 세포에서 T-REX에 의한 광범위한 스크리닝을 수행하고 생체 내 검증 및 표현형/경로 분석을 위해 Z-REX를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양과 비교할 때, Z-REX를 수행하기 위한 요구 사항은 T-REX가 요구하는 생화학적 실험 기술 외에 기본적인 어류 사육 기술입니다. Z-REX의 일반적인 기간(물고기 교배에서 광유도성 친전성 전달까지)은 2-3일이며, 이는 형질주입된 살아있는 세포에 대한 T-REX 실험의 일반적인 시간보다 1일 이상 길지 않습니다. 표현형 분석을 위한 라이브 이미징은 조명 조명 후 2-10시간 후에 수행할 수 있습니다. 풀다운 분석을 위한 비오틴-아지드와의 클릭 커플링은 3일이 소요됩니다. 전사 반응을 분석하기 위한 qRT-PCR은 3일이 걸립니다. IF 염색에는 5 일이 걸립니다. 이러한 단계는 세포 배양 단계와 거의 유사하지만 데이터를 해석하려면 어류 생리학 및 리포터 균주에 대한 이해가 필요합니다.
다중 변수 절차(12)로서, Z-REX가 결과의 불확실성을 배제하기 위해 여러 대조군이 필요하다(도 1D). 일반적인 대조군은 다음과 같다: (1) DMSO/비히클 치료만; (2) 프로브 처리, 그러나 조명 없음; (3) 조명 조명이지만 프로브 처리가 필요하지 않습니다. (4) P2A-분할 구성물, 헤일로와 POI가 별도로 표현되어, 근접 전달이 제거된다; 및 (5) 이전 연구에서 사용한 Akt3(C119S)6 및 Keap1(C151S, C273W, C288E)5와 같이 친전자성 감지 잔기가 돌연변이된 하이포모픽 돌연변이체.
다운스트림 분석에 웨스턴 블롯 분석이 포함되는 경우 수확 전에 디노킹을 수행해야 합니다. 노른자 단백질은 용해물 농도 평가의 충실도를 감소시키고 항체에 비특이적으로 결합할 수 있습니다. 활어 이미징 또는 전체 마운트 IF 염색을 수행할 때 난황낭의 자가형광 단백질 또는 항체 자체의 비특이적 결합으로 인해 난황낭에서 비특이적 형광 신호도 관찰했습니다. 자가형광 신호가 신호를 방해하는 경우 난황낭을 정량화에서 제외하거나 다른 영역을 별도로 정량화하는 것이 좋습니다. Dechorination은 활어 이미징 및 전체 마운트 IF 염색 분석에 필요합니다. chorion은 이미징을 방해할 수 있으며 나중에 정량화/세포 계수를 방해할 수 있습니다. 그러나 dechorination은 1dpf 이상의 배아에만 적용됩니다. blastulation/gastrulation/segmentation 단계의 어린 배아는 너무 약해서 융모막을 제거할 수 없습니다.
여기에 설명된 Z-REX 프로토콜은 mRNA 기반 이소성 POI 발현을 기반으로 합니다. 이 절차는 형질전환 낚싯줄을 사용/생성하는 것에 비해 빠릅니다. mRNA 기반 발현은 유비쿼터스이고 일시적이며 이 프로토콜에 사용되는 mRNA의 경우 최소 2일 동안 지속됩니다. 그러나 발현 기간은 다른 경우에 다를 수 있습니다. 따라서 이 접근 방식은 여러 고처리량/고함량 분석과 호환되는 특정 친전자성 표지 이벤트의 효과에 대한 빠르고 보다 글로벌한 조사 창을 제공합니다. 특정 조직에서 안정적인 Halo-POI 발현을 갖는 형질전환 계통도 Z-REX11과 호환됩니다. 이러한 라인은 예를 들어 특정 장기의 표현형이 세포 배양 데이터에서 예측되거나 mRNA 주입 실험에서 스크리닝하여 특정 장기가 친전자성 표지 이벤트에 민감하다고 예측할 때와 같이 보다 정확한 질문이 필요할 때 가장 잘 사용됩니다. Z-REX를 통한 심장 특이적 항산화 반응 유도는 이전 간행물11에서 Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) 물고기를 사용하여 입증되었습니다. 2dpf보다 오래된 형질전환 어류에 대해 Z-REX를 수행하는 것도 가능할 수 있습니다.

무수히 많은 세포 신호 전달 사건은 작은 반응성 분자(세포에서 내인성으로 생성되거나 약물과 같은 생체이물/이종대사산물)와 단백질 표적 간의 반응을 포함합니다. 많은 경우에, 이러한 공유 결합 이벤트의 화학량론적 수준은 세포 반응을 촉발할 수 있고, 예를 들어, 발달, 대사, 세포자멸사 및/또는 면역 반응의 변화를 유도할 수 있다1. 그러나 특정 결합 이벤트를 표현형 결과와 연결하여 작용 방식(MOA)을 해체하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 고농도의 반응성 종을 도입하는 전통적인 볼루스 투여법은 종종 다수의 단백질을 변형시킬 뿐만 아니라 모델 유기체에 과도한 독성을 초래한다2. 이러한 조건은 이상적이지 않습니다. T-REX(표적화 가능한 반응성 친전필 및 산화제)3라고 하는 기본 세포 맥락에서 정밀하게 국소화된 친전자필 전달을 사용하여 세포 배양에서 이러한 문제를 해결하기 위한 방법이 개발되었습니다. 그 사이에 초점은 전체 유기체에 대한 실험으로 바뀌었고, 이를 통해 형질전환되지 않은 세포의 특정 세포 맥락에서 단백질을 연구할 수 있는 기회를 얻었습니다. 따라서 우리는 Danio rerio 배아 모델을 포함한 여러 모델과 호환되도록 기술을 확장했습니다. 여기에서는 Z-REX(반응성 친전필 및 산화제를 표적으로 하는 제브라피쉬)를 제시합니다(그림 1).
Z-REX를 이해하기 위해 이 기사에서는 먼저 REX 기술과 기본 개념을 제시합니다. 핵심적으로, 이러한 기술은 자연 친전성이 시공간 정밀도로 생체 내에서 국부적으로 생성되는 방식을 모방하여 내인성 생리학적 반응성 친전자성 종(RES) 신호 전달을 모델링합니다. 관심 단백질(POI)은 Halo에 대한 융합 구조로 표현됩니다. 후자는 광케이지 RES를 포함하는 조직 투과성 및 불활성 프로브를 1:1 화학량론에 고정합니다. 이러한 내인성 RES 중 하나는 4-하이드록시노네날(HNE)이며, 이는 프로브 Ht-PreHNE에서 광케이지됩니다. 많은 경우에, 우리는 HNE와 본질적으로 동일한 생물학적 특성을 갖지만 클릭 화학에 의해 라벨링될 수 있는 HNE의 알킨 기능화 버전[즉, HNE(알킨)]을 사용합니다. Halo와의 반응성을 위해 클로로알칸으로도 기능화된 프로브를 Ht-PreHNE(알킨)라고 합니다. 이렇게 형성된 Halo-POI 융합 및 프로브의 복합체는 UV 광을 조사할 때 융합된 POI에 RES의 근위 전달을 허용합니다. POI가 유리된 RES와 빠르게 반응하면 결과적으로 POI와 RES의 공유 결합 라벨링을 통해 동역학적으로 특권이 있는 시스테인을 식별할 수 있습니다.
Z-REX는 앞서 언급한 REX 기술의 장점을 활용하여 활어의 특정 신호 전달 경로를 연구하는 데 광범위하게 적용합니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬(D. rerio)에 최적화되어 있는데, 이는 제브라피쉬가 발달 중에 투명하고 유전적으로 다루기 쉬운 척추동물 유기체이기 때문에 REX 기술과 같은 광화학/유전 기술에 이상적입니다. 그럼에도 불구하고, 유사한 전략은 유전적으로 다루기 쉬운 다른 어종에서도 잘 작동할 가능성이 높은데, 그 이유는 이 방법의 광범위한 적용 가능성이 지질 유래 친전자성(LDE) 전달의 유사 분자 내 메커니즘 때문이기 때문입니다. 실제로, 물고기는 발달에 눈에 띄는 영향 없이 최소 48시간 동안 Z-REX 광변성 친전성[예: Ht-PreHNE(알킨)]으로 처리할 수 있기 때문에 이 절차는 생체 적합성이 매우 높습니다. 유사한 프로토콜이 예쁜꼬마선충 4,5에서 기능합니다.
이 프로토콜은 먼저 수정 후 1-1.5일(dpf)에 배아 제브라피쉬 모델에서 비천연 Halo-POI 융합 구조의 일시적인 발현을 생성하기 위한 mRNA 주입의 사용을 설명합니다. 그 결과 특정 조직이나 지역이 아닌 물고기 내의 대부분의 세포(이하 '유비쿼터스'라고 함)에서 이소성 단백질이 발현됩니다. 그러나 데이터는 특정 경우에 세포 특이적 효과가 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 주입 후, 배아는 수정 후 최대 30.5시간(hpf) 동안 프로브의 저농도[0.3-5μM Ht-PreHNE(알킨)]와 함께 배양됩니다. 그런 다음 사용자가 지정한 시간에 2-5분 동안 광경화하여 물고기 내 POI에 RES를 전달합니다. RES의 광융합 후, 다양한 다운스트림 표현형 분석이 다음 2-10시간 동안 수행될 수 있습니다: 1) 리포터 라인의 라이브 이미징(그림 2A); 2) 웨스턴 블롯 분석에 의한 표적 표지 평가(그림 3); 3) 전사체 분석(도 4); 또는 4) 전체 마운트 면역 형광 (그림 5).
리포터 라인의 라이브 이미징의 예로, Z-REX는 물고기 라인의 라이브 이미징, Tg(lyz:TagRFP) 및 Tg(mpeg1:eGFP)와 함께 시연되어 특정 친전자성 센서 POI(즉, Keap1)의 RES 변형이 물고기의 다른 세포에 관찰 가능한 영향 없이 각각 호중구 및 대식세포 수준을 각각 감소시키는 방법을 측정합니다. 그러나 우리는 이전에 T-REX 연구의 POI 표지 및 결과적 경로 신호 전달이 Akt3 6, Keap17 및 Ube2v26과 같은 여러 단백질에 대해 Z-REX를 사용하여 재현될 수 있음을 보여주었습니다. 전반적으로 Z-REX를 통해 과학자들은 여러 복잡한 산화 환원 경로의 맥락에서 RES에 의한 POI의 공유 변형 결과를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 상황에 맞는 전체 동물 모델에서 공유 약물 설계 및 새로운 약물 메커니즘을 위한 표적과 기능적 잔류물을 정확히 찾아낼 준비가 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>, Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td>, <td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>2mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>, Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드 용액</td>, <td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dPEG11-azide</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>모세관</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 - Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr> <tr><td>당나귀 안티 - 토끼 - Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr> 당<tr><td>나귀 안티 - AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>ECL 기질</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr>, <tr><td>ECL-Plus 기질</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>종단 간 로테이터</td><td>, FinePCR</td><td>로테이터, AG</td><td></td></tr>, <tr><td>에탄올</td><td>, Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr>, <tr><td>브롬화 에티듐</td>, <td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr>, <tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 인스트루먼트 컴퍼니</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>집게 (뭉툭한)</td> <td>날카로운 집게를 무디게 하여 자체 제작 (Fine Science Tools, Dumont # 5, 11252-40)</td><td></td> 집게 (날카로운) 미세 과학 도구 Dumont # 5, 11252-40 젤 로딩 팁 Fisher 02-707-181 젤 / 블롯 이미저 Vilber <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Fusion FX 이미저</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>시그마</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>유리 무대 마이크로미터</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>가열 초음파 수조</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>고용량 스트렙타비딘 아가로스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE 알킨 프로브</td><td>자체 제작</td><td>-</td><td>Parvez, S. 외. 살아있는 세포에서 T-REX 주문형 산화 환원 표적화. 냇 프로토콜. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>이미징 플레이트(10% HBSS 버퍼, 살아있는 배아용)</td><td></td><td></td><td>페트리 접시로 제작, 10% HBSS 버퍼에 2% 아가로스로 제작</td></tr><tr><td>이미징 플레이트(PBS, 포름알데히드 고정 배아용)</td><td></td><td></td><td>페트리 접시와 PBS 주입판</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>에 2% 아가로스로 제작 <td>10% HBSS 버퍼에 미세사출 금형, 페트리 접시 및 2% 아가로스로 제작</td></tr><tr><td>LDS</td><td>아폴로</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>미세 사출 금형</td><td>적응형 과학 도구</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주입용 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>현미경 광원</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 &베타;-actin-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>마우스 안티 HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>다중 모드 리더</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>핵산 아가로스 겔 전기영동 장치</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>주황색 G</td><td>시그마</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>자가 복제</td><td>-</td>EPFL pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA의 <td>Yimon AYE 교수</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>그룹에서 사용 가능 EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>단백질 전기영동 장비 및 용품</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영</td><td></td></tr>동 <tr><td>토끼 안티액티브 카스파제-3</td><td>BD 파밍겐&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Rat anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF 및 WB)</td></tr><tr><td>Rat anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap RNA 오염 제거 솔루션</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 역전사 효소</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-부탄올</td><td>시그마</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV 프로테아제(S219V)</td><td>자체 제작</td><td>-</td><td>Parvez, S. et al. T-REX 살아있는 세포에서 주문형 산화 환원 표적화. 냇 프로토콜. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>제브라피시 국제 리소스 센터(ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>제브라피쉬 국제 리소스 센터(ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>분석기 Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>아폴로</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>트라이졸 시약</td><td>써모 피셔 사이언</td><td>15596018</td><td></td>티</tr>픽 <tr><td>글리신 맥스 (대두)의 트립신 억제제시</td><td>그마</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>피셔</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>UV 램프 365nm 광</td><td>분광 ENF</td><td>240C</td><td></td></tr><tr><td>자외선 측정기&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries, Inc. (볼텍서 사이언티픽 인더스트리, Inc.)</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 전송 장비 및 용품</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot 또는 Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>제브라피시 사육 및 사육 장비</td><td></td><td></td> 사<td>내</td></tr><tr><td>지르코니아 비즈</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - z-rex는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

반응성 대사 산물 및 관련 친전자성 약물은 연구하기 가장 어려운 소분자 중 하나입니다. 이러한 분자의 작용 방식(MOA)을 해체하기 위한 기존의 접근 방식은 특정 반응성 종을 과량으로 사용하여 실험 표본의 대량 처리를 활용합니다. 이 접근법에서, 친전성체의 높은 반응성은 시간 및 상황에 따라 방식으로 프로테옴의 비차별적 표지를 렌더링합니다. 산화 환원에 민감한 단백질과 공정은 간접적으로 그리고 종종 돌이킬 수 없는 영향을 받을 수 있습니다. 무수한 잠재적 표적과 간접적인 2차 효과를 배경으로 표현형을 특정 표적 참여에 연결하는 것은 여전히 복잡한 작업으로 남아 있습니다. 반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬(유충 제브라피쉬에 사용하도록 개조된 주문형 반응성 친전자필 전달 플랫폼)는 교란되지 않은 활어 배아의 특정 관심 단백질(POI)에 친전자성을 전달하도록 설계되었습니다. 이 기술의 주요 특징은 낮은 수준의 침습성과 용량, 화학형 및 시공간적으로 제어되는 정밀 친전자성 전달을 포함합니다. 따라서 고유한 제어 제품군과 함께 이 기술은 반응성 친전자성 및 다면발현 친전자성 약물에 대한 동물의 통제되지 않은 대량 노출 후 관찰되는 표적 이탈 효과 및 전신 독성을 회피합니다. 연구자들은 Z-REX를 활용하여 온전한 살아있는 동물의 거의 생리학적 조건에서 특정 POI와의 특정 반응성 리간드 결합의 결과로 개별 스트레스 반응 및 신호 출력이 어떻게 변경되는지 이해하는 발판을 마련할 수 있습니다.

Z-REX 처리된 형질전환 호중구/대식세포 리포터 어류, Tg(lyz:TagRFP) 및 Tg(mpeg1:EGFP) 의 라이브 이미징.Keap1 HNEylation을 통한 호중구/대식세포 세포자멸사 유도. (그림 2 참조). 호중구 및 대식세포 수준에 대한 Keap1의 친전자성 표지의 효과는 Tg(lyz:TagRFP) 또는 Tg(mpeg1:EGFP)에서 유래한 이형접합체 형질전환 배아에 Halo-Keap1을 암호화하는 mRNA를 주입한 다음 Ht-PreHNE(알킨)로 처리하여 평가했습니다. 단계 6.1-다운스트림 분석에 대한 절차에 따라 옵션 1-HNE(알킨)를 유리하고 Keap1을 표지했습니다. 호중구 및 대식세포 수치는 각각 리포터 라인인 Tg(lyz:TagRFP) 및 Tg(mpeg1:eGFP)의 실시간 영상으로 평가되었습니다. 두 세포 유형의 수준은 HNE가 Keap1에 전달된 Z-REX 처리 후 30%-40% 감소했습니다. 반대로, Z-REX 기술 대조군[빛 및 Ht-PreHNE(알킨), 빛 단독 또는 Ht-PreHNE(알킨) 단독]에서 호중구 또는 대식세포의 손실이 관찰되지 않았습니다(그림 1D 및 그림 2A-D).
호중구/대식세포 세포자멸사의 유도는 Z-REX를 통해 Keap1에 대한 성공적인 HNE 전달을 나타냅니다. 경로 분석 및 세포자멸사 메커니즘에 대한 자세한 내용이 발표되었습니다5. HNE(알킨)의 타겟 이탈 효과를 설명하기 위해 몇 가지 대조군이 사용되었습니다. (1) 동일한 실험 조건에서 Halo-TeV-Keap1 mRNA 대신 배아에 Halo-P2A-Keap1 mRNA를 주입했습니다. P2A 링커는 Halo 및 Keap1 단백질이 독립적으로 발현되도록 했습니다. 이 시나리오에서 Halo에서 방출된 HNE(알킨)는 더 이상 Halo에 근접하지 않았기 때문에 Keap1에 레이블을 지정할 수 없습니다(그림 1D). 따라서, 세포자멸사 신호전달 경로가 촉발되지 않았다. 이 그룹에서는 대식세포 또는 호중구 수준의 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 2A, B). (2) HNE(알킨)에 반응하지 않는 Keap1의 돌연변이인 Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E)을 암호화하는 mRNA를 사용하여 동일한 실험 조건을 수행하였다(그림 1D). 대식세포 또는 호중구 수준의 변화는 관찰되지 않았습니다(그림 2G,H).
비오틴 아지드-클릭 커플링 및 비오틴 풀다운 분석. 목표 라벨링 평가. ( 그림 3 참조). 표적 표지 평가는 Halo-TeV-Keap1-2xHA(Halo-POI 융합 구조) 또는 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA(P2A-분할 구조, Halo와 Keap1이 융합되지 않음; 그림 1D). 표지된 Keap1 단백질은 융합 단백질을 발현하고 Z-REX로 처리한 그룹에서만 풀다운되었지만(상단 항-HA 블롯의 두 번째 레인), 다른 대조군(mRNA 주입 없음, Z-REX가 없는 융합 구조체 또는 P2A-분할 구조체)에서는 처리되지 않았습니다. 결과는 HNE(알킨)가 Keap1에 성공적으로 전달되었고, 변형된 Keap1은 클릭 반응을 통해 비오틴과 접합되었고, 비오틴 표지된 Keap1은 스트렙타비딘 수지에 의해 풀다운되었음을 나타냅니다.
전사 분석. RNA-seq 및 qRT-PCR. ( 그림 4 참조). Z-REX 처리 후의 전사 변화를 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의해 평가하였다. RNA-seq에서 여러 면역 관련 유전자가 Z-REX 후에 하향 조절되었습니다. 대조적으로, 많은 항산화 반응(AR) 관련 유전자는 Z-REX 후에 상향 조절되었으며, 이는 Keap110 에서 HNEylation에 따라 Keap1-Nrf2-AR 경로의 유도로 인해 발생했습니다(그림 4A). qRT-PCR 분석에서 3개의 면역 관련 유전자(lyz, mpeg1.1 및 coro1a)를 분석했을 때 유사한 결과가 발견되었습니다(그림 4B). 각 유전자의 상향 및 하향 조절은 Keap1 HNEylation에 의해 매개되는 경로의 성공적인 유도를 보여주었습니다.
전체 마운트 (공동) 면역 형광 염색 분석 및 colocalization 분석. (그림 5 참조). 외인성 Halo-TeV-Keap1-2xHA 및 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA 발현은 전체 마운트 면역형광(IF) 염색으로 평가되었습니다(그림 5A,B). P2A-분할-구축물은 TeV-융합-구축물보다 2배 더 많은 HA 태그를 가졌으며, 이는 다른 것보다 P2A-분할-구축물-mRNA-주입 그룹에서 2배 더 높은 항-HA 신호에 해당하며, 이는 두 구축물의 발현 수준이 유사함을 나타낸다(도 5C). Halo-TeV-Keap1(wt) 및 Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E)의 발현 수준도 anti-Halo로 프로빙할 때 유사한 것으로 나타났습니다(그림 5D,E). Z-REX 처리된 Tg(lyz:TagRFP)에서 호중구 및 활성 카스파제 3의 공동 국소화는 항-RFP 및 항-활성-카스파제 3과의 공동 면역염색에 의해 관찰되었습니다(그림 5F). 활성 카스파아제 3은 세포자멸사 사건의 지표입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> 그림 1: Z-REX 워크플로우. (A,B) 1-4 세포 단계 제브라피쉬 배아에 Halo-POI(예: Halo-Keap1)를 인코딩하는 mRNA를 주입합니다. 그런 다음 주입된 배아는 HaloTag 리간드로 구성된 프로브와 B의 Ht-PreHNE(알킨)와 같은 알킨 작용기가 추가된 광케이지 친전성체로 처리됩니다. 과량의 프로브를 제거한 후, 배아는 관심있는 친 전자성 [예 : HNE 또는 그 유사체, HNE (알킨)]을 방출하기 위해 빛에 노출됩니다. 다운스트림 분석은 지정된/사용자 정의 시점에 수행됩니다. (C) 다양한 지질 유래 친전성기(LDE)에 적용할 수 있는 Ht-PreLDE 프로브의 설계 및 메커니즘. (D) Z-REX에 대한 음성/기술적 대조군. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> 그림 2: Z-REX에 노출된 형질전환 호중구/대식세포 리포터 물고기의 라이브 이미징. Z-REX 매개 Keap1 HNEylation은 호중구/대식세포 세포자멸사를 유도합니다. (A) Halo-TeV-Keap1(융합 구조체) 또는 Halo-P2A-Keap1(분할 구조체)을 발현하고 음성 대조 조건[무처리, 빛 단독 또는 Ht-PreHNE(알킨) 단독 또는 Z-REX]. 배아 연령 : 36 hpf. (B) A의 호중구 수준의 정량화. (C) Z-REX 처리 유무에 관계없이 Halo-TeV-Keap1을 발현하는 Tg(mpeg1:eGFP) 물고기의 대표 이미지. 배아 연령 : 34 hpf. (D) C의 대식세포 수준의 정량화. (E,에프) Z-REX 처리 후 (E) 호중구 및 (F) 대식세포 수준의 시간 경과 측정. (G) HNE 감지 능력이 없는 돌연변이인 Halo-TeV-Keap1(WT) 또는 Halo-TeV-Keap1(C151S, C273W, C288E)을 발현하는 어류에서 A에서와 유사한 실험. (H) G의 호중구 수준 정량화. 스케일 바: 500 μm. 모든 그래프는 평균 ± SEM으로 제시됩니다. p 값은 일원 분산 분석(파란색)과 양측 스튜던트 t-검정(검은색)으로 계산되었습니다. 이 수치는 Poganik et al.7에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> 그림 3: 비오틴 풀다운 분석. Halo-TeV-Keap1-2XHA 또는 Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA를 발현하는 WT 배아를 Z-REX 또는 각각의 음성 대조군 조건(이 경우 프로브 처리 없음)으로 처리했습니다. 수확 후, 배아를 용해시키고 비오틴 풀다운 분석 전에 TeV 프로테아제로 처리했습니다. 그 결과를 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 이 그림은 Huang et al.에서 수정되었습니다. Z-REX: 조직 특이적 또는 유비쿼터스적으로 발현되는 특정 단백질에 반응성 친전필을 투여하고 애벌레 물고기에서 결과적인 기능적 친전자성 유도 산화 환원 반응을 기록합니다. 이 그림은 Huang et al.에서 수정되었습니다.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> 그림 4: 전사 분석. (A) Z-REX 처리 대 처리되지 않은 배아의 RNA-seq 결과. 통계적으로 유의한 차등적 발현(SDE) 유전자가 강조 표시됩니다. 면역 관련 SDE 유전자는 빨간색으로 표시됩니다. 항산화 반응(AR) 관련 유전자는 녹색으로 표시됩니다. 다른 SDE 유전자는 파란색으로 표시됩니다. 모든 p 값은 CuffDiff로 계산되었습니다. (B-D) A의 3가지 면역 관련 SDE 유전자: (B) lyz, (C) mpeg1.1 및 (D) coro1a를 qRT-PCR로 추가로 분석한 결과, Z-REX 처리된 배아만이 이러한 전사체의 억제를 보여주었습니다. 모든 그래프는 평균 ± SEM으로 제시됩니다. p 값은 일원 분산 분석(파란색) 및 양측 스튜던트 t-검정(검은색)으로 계산되었습니다. 이 수치는 Poganik et al.7에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> 그림 5: 전체 마운트 면역형광 염색 분석. (A,B) 항-HA 및 AlexaFluor568과 접합된 2차 항체로 면역염색된 (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA 또는 (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA를 발현하는 배아의 대표 이미지. mRNA가 주입된 물고기는 연령이 일치하는 주사되지 않은 물고기와 비교되었습니다. (C) (A,B)에서 항-HA 신호의 정량화. (D) 항-Halo 및 AlexaFluor647과 접합된 2차 항체로 면역염색된 Halo-TeV-Keap1(WT) 또는 Halo-TeV-Keap1(C151S, C273W, C288E)을 발현하는 배아의 대표 이미지. mRNA가 주입된 물고기는 연령이 일치하는 주사되지 않은 물고기와 비교되었습니다. (E) D에서 안티 헤일로 신호의 정량화. p 값은 양측 스튜던트 t-검정으로 계산되었습니다. (에프) Z-REX를 투여받은 Tg(lyz:TagRFP) 배아는 항-RFP 및 항활성 카스파제 3 및 각각의 형광단 접합 2차 항체와 함께 면역염색되었습니다. 흰색 상자는 확대된 영역을 표시합니다. 흰색 화살표는 호중구와 활성 카스파아제 3의 colocalizations를 나타냅니다. 스케일 바: 500 μm. 모든 그래프는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 수치는 Poganik et al.7에서 수정되었습니다. 및 Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 본 연구에 사용된 완충액 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬는 반응성 소분자 신호 조사를 위한 화학 생물학 기반 방법입니다. 이 기술은 다양한 발달 단계의 활어에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 신호 전달 경로 분석을 위해 제브라피쉬의 표준 분석과 Z-REX를 결합합니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

따라서 연구자들은 Z-REX를 활용하여 제브라피쉬 유충의 생리학적 조건에 가까운 특정 관심 단백질과 결합하는 특정 반응성 리간드에 대한 반응으로 개별 신호 반응이 어떻게 변경되는지 조사할 수 있습니다. 대량 투여 반응성 소분자와 같은 기존의 방법은 표적 및 독성을 유발하고 리간드 표적 특이성을 제어하지 않습니다. Z-REX는 높은 시공간 정밀도로 특정 리간드 표적 결합을 특정 표현형과 연결할 수 있습니다.우리는 최근 Z-REX가 발견한 관련 표적 및 경로인 반응성 대사산물 HNE가 삼중 음성 유방암에 대한 정밀 동형 특이적 키나아제 억제제의 개발을 가능하게 하는 방법을 보여주었습니다. 신선한 10%Hank's balanced salt 용액 또는 HBSS로 채워진 주입 플레이트의 홈에 배아를 정렬하는 것으로 시작합니다. 바늘 끝을 배지에 담그고 필요한 경우 주입 펄스를 적용하여 팁의 기포를 제거합니다. 배아를 주입하려면 융모막과 난황낭을 한 번에 관통하고 주입 펄스를 적용합니다.다른 배아를 주입한 후 물병을 사용하여 신선한 HBSS 배지가 들어 있는 새 페트리 접시에 헹굽니다. 주입되지 않은 배아를 다른 접시에 모으십시오. Z-REX 처리 분석을 수행하려면 먼저 주입된 배아를 10cm 접시에 분배합니다.적색광이 있는 어두운 방에서 REX 프로브 1마이크로몰을 사용하거나 사용하지 않고 30밀리리터의 10% HBSS로 매체를 교체합니다. 어둠 속에서 섭씨 28.5도에서 배아를 배양하십시오. 수정 후 30 시간이 지나면 어둠 속에서 배지를 교체하십시오.배양과 배지 교체를 두 번 반복한 후 30초마다 소용돌이치는 예열된 UV 램프의 빛에 배아를 노출시킵니다. 표현형 분석을 수행하려면 마취된 배아가 들어 있는 플레이트에서 수정되지 않았거나 죽은 배아를 제거합니다. 날카로운 집게를 사용하여 배아의 chorion을 제거하십시오.10% HBSS 배지로 준비된 2% 아가로스 플레이트에 배아를 장착하고 실체 현미경으로 관찰합니다. ImageJ를 사용하여 각 물고기의 호중구와 대식세포 수를 계산합니다. 자유형 선택을 선택하고 전체 물고기에 동그라미를 친 다음 최대값 찾기 옵션을 선택하여 형광 세포를 계산합니다. 본 연구에서, Z-REX-처리된 배아는 호중구 및 대식세포의 손실을 입증하였다.이 효과는 치료되지 않은 그룹에서는 나타나지 않았다. 세포자멸사 신호전달 경로는 Halo-P2A-Keap1 그룹에서 촉발되지 않아 대식세포 및 호중구 수준이 변경되지 않았습니다. HNE에 반응하지 않은 Halo-TEV-Keap1 돌연변이에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다.전사 및 실시간 정량적 PCR 분석은 Z-REX 후 면역 관련 유전자의 하향 조절 및 항산화 유전자의 상향 조절을 보여주었습니다. 면역형광 염색은 P2A-분할-구축물이 TeV-융합-구축물보다 2배 더 많은 HA 태그를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 유사한 발현 수준을 나타낸다. 야생형 및 돌연변이형 Halo-TeV-Keap1의 발현 수준도 유사하였다.Z-REX 처리된 형질전환 호중구 리포터 라인에서, 호중구 및 활성 카스파아제 3의 공동 국소화가 또한 관찰되었다. 가장 중요한 것은 문서를 올바르게 설정하는 것입니다. 제한하면 결과가 실제로 향상됩니다.우리는 Localis-REX로 알려진 약물 스크리닝 플랫폼에 대한 아이디어인 Z-REX를 채택했습니다. 지금까지 다른 어떤 기술도 이러한 국소 특이적 및 반응성 리간드 또는 표적 맵핑을 달성할 수 없었습니다. 유방암 치료를 위한 친전자성 약물 후보를 개발하는 데 도움이 되었습니다.암, 면역학, 노화 등 많은 분야에서 국소 신호 전달의 중요성이 커짐에 따라 국소 반응성 리간드 유도 이벤트를 매핑할 수 있는 유일한 도구인 Z-Rex는 다양한 분야에 도움이 될 것을 약속합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

우리는 미세 조작 및 전기 망막검사 기술을 사용하여 제브라피시 유충의 전기망막검사(ERG) 분석 방법을 제시합니다. 이것은 생체 내에서 제브라피시 유충의 시각 기능을 분석하는 간단하고 간단한 방법입니다.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

여기서, 우리는 DEPDC5 유전자의 일시적인 억제로 인한 간질의 제브라피시 모델의 개발 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시한다.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

여기서, 우리는 대식세포 혈통 세포에 대한 약물 전달을 표적으로 하기 위한 목적으로 약물로드 리포좀과 그들의 미세 주입을 애벌레 얼룩말어로 합성하는 것을 기술한다.

약물이 탑재된 리포좀을 주입하여 애벌레 얼룩말 대식세포에 약물을 타겟팅

제브라피시 배아 진동 놀람 반응을 기반으로 화합물 독성을 평가하기 위한 스크리닝 시스템의 워크플로우 및 데이터 분석에 대해 설명합니다. 이 시스템은 진동 자극에 노출된 제브라피시 배아의 움직임을 기록하고 일반 독성/치사율 및 신경근 독성을 통합적으로 평가할 수 있습니다.

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

이 프로토콜은 수정 후 3-7일 후에 제브라피시 유충에 대한 약물 스크리닝 절차와 형태학적 평가를 설명합니다.

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

배우세요 Z-REX 방법을 활용하여 유충 제브라피쉬에서 반응성 소분자 신호전달을 정밀하게 분석하는 기술입니다. 이 방법은 특정 리간드-표적 상호작용과 표현형 변화를 연결하여 삼중음성 유방암 치료 전략 개발에 활용됩니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

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