Name: CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 SPH CRISPR 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사 방법입니다. 맞춤형 sgRNA를 AAV로 전달하여 지방세포 내 PRDM16 유전자를 활성화하고, 생체 내에서 열생성 유전자 프로그램을 연구할 수 있습니다.

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저자들은 Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, AdipoSPH 마우스 생성, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, INFABIC(National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology)의 모든 실험 지원에 감사드립니다. 상파울루 연구 재단 (FAPESP)의 재정 지원에 감사드립니다 : 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

동물 연구는 캄피나스 대학교 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(프로토콜 CEUA #5810-1/2021)에 따라 수행되었습니다.
1. 분자 복제
<ol><li>단일 가이드 RNA(sgRNA)의 설계<ol><li>https://chopchop.cbu.uib.no/ 에서 구할 수 있는 CHOPCHOP 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: 표적: Prdm16; 에서: Mus musculus; 사용: Crispr/Cas9; 대상: 활성화. 참고: 200bp 업스트림 전사 시작 부위(TSS) 영역에 걸쳐 분산된 각 관심 영역에 대한 sgRNA를 설계합니다. 예를 들어, 이 연구에 사용된 Prdm16을 표적으로 하는 sgRNA는 TSS의 상류에서 154bp에 결합합니다.</li>
		<li>벡터 백본 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry의 SacI 제한 부위와 일치하도록 sgRNA에 돌출부를 추가합니다( 재료 표 참조). 포함: 5'-(N20)AGCT-3'(N = 뉴클레오티드). 예를 들어, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 서열은 5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'이고, 오버행이 있는 서열은 5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'이다.</li>
		<li>https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html 에서 사용할 수 있는 도구를 사용하여 3' sgRNA 역보체 서열을 얻습니다. 예를 들어, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 3' sgRNA 서열은 3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'이다.</li>
	</ol></li>
	<li>single-stranded complementary oligonucleotides의 어닐링<ol><li>각각 5' 및 3' 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(스톡 농도: 100μM) 1μL, T4 리가제 완충액 1μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)(1 ×10 4 units/mL) 0.5μL,H2O6.5μL를 최종 반응 부피 10μL에 추가합니다. 37°C에서 30분, 95°C에서 5분 동안 반응한 후 5°C/min의 램프 다운 속도를 제공합니다. 참고: PNK 효소는 PNK 완충액과 함께 제공되며 인산화 반응에 필요한 충분한 ATP를 포함하지 않습니다( 재료 표 참조). 반응을 단순화하려면 T4 리가아제 완충액(PNK 완충액 대신)을 사용하십시오. T4 리가아제 완충제는 인산화 반응을 위한 포스페이트의 적절한 양(1 mM ATP)을 제공한다. PNK 효소는 후속 결찰 반응을 위해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 인산화를 제공합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 결찰<ol><li>플라스미드 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry 25 ng을 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드 2 μL, SacI 효소 1 μL, 10x T4 DNA 리가제 완충액 2 μL, T4 DNA 리가제 1 μL (1-3 u/μL) ( 재료 표 참조) 및 H2O를 10 μL의 최종 반응 부피에 추가합니다.</li>
		<li>다음 조건 하에서 열순환기를 사용하여 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 결찰을 수행한다: 5분 동안 37°C 및 5분 동안 25°C의 15 사이클, 이어서 4°C에서 유지.</li>
	</ol></li>
	<li>형질전환 후 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR)<ol><li>열충격(45초 동안 42°C)을 사용하여 결찰 산물 4μL로 적격한 대장균 DH10B 세포( 재료 표 참조)를 변형하고 100μg/mL 암피실린이 포함된 한천 플레이트에 뿌립니다.</li>
		<li>PCR 마스터 믹스를 사용하여 콜로니 PCR로 형질전환된 콜로니를 확인합니다( 재료 표 참조). 콜로니를 선택하고 5 μL의 마스터 믹스, 0.1 μL의 범용 프라이머 (스톡 농도: 100 μM), 0.1 μL의 sgRNA 역방향 프라이머 (스톡 농도: 100 μM) (표 1) 및 5 μL의H2O와 혼합합니다. 다음 조건에서 thermocycler를 사용하여 PCR을 실행합니다. 초기 변성(94°C에서 2분), 변성(20초 동안 94°C), 어닐링(30초 동안 60°C), 연장(30초 동안 72°C) 및 최종 신장 단계(5분 동안 72°C)의 35주기가 이어집니다. 90 V에서 30분 동안 0.5x TAE 완충액 중 아가로스(1.5%) 겔 전기영동을 사용하여 DNA를 분해합니다. 참고: 양성 클론은 ~280bp의 밴드를 제공합니다.</li>
		<li>양성 제출amp범용 프라이머를 사용한 Sanger 염기서열 분석을 위한 파일(표 1, 보충 파일 1).</li>
	</ol></li>
	<li>플라스미드 정제<ol><li>제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 양성 클론에서 플라스미드를 정제합니다. 참고: 음이온 교환 수지 또는 세포 형질감염에 사용하기에 적합한 다른 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다.</li>
		<li>100μg/mL 암피실린을 함유한 표준 박테리아 성장 배지를 사용하여 양성 클론(37°C에서 200rpm으로 진탕하면서 12시간)을 배양합니다.</li>
		<li>박테리아 세포를 6,000 × g 에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 제조업체의 키트 지침에 따라 다음 단계를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. AAV 포장
참고: AAV 포장은 이전 간행물15,16에 따라 약간의 수정을 가하여 수행되었습니다.
<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 포함하는 25mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 사용하여 175cm2 플라스크(플라스크당 5 ×10 6개 세포 시딩)에서 293T 세포(재료 표 참조). 세포가 50%-70% 합류점에 도달할 때까지 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양합니다.</li>
	<li>14μL의 폴리에틸렌이민(1μg/μL)과 1mL의 150mM NaCl을 혼합합니다. AAV 생산에 필요한 3개의 플라스미드를 1:1:1 몰비(즉, 17.7μg의 pAdDeltaF6, 7.9μg의 AAV2/8( 재료 표 참조) 및 5.9μg의 150mM NaCl 1mL에 1단계로부터 클로닝된 sgRNA로 혼합합니다. 폴리에틸렌이민:NaCl 혼합물을 DNA (플라스미드 혼합물)가 들어있는 튜브에 한 방울씩 옮기고 25 °C에서 20 분 동안 배양합니다. 참고: pAdDeltaF6는 헬퍼 플라스미드이고 pCapsid pAAV2/8은 복제(Rep) 및 캡시드(cap) 유전자를 발현하는 패키징 플라스미드입니다. 두 플라스미드 모두 AAV를 생산하는 데 필요합니다.</li>
	<li>형질감염 전에 세포 성장 배지를 1% FBS와 L-알라닐-L-글루타민(0.5g/L)이 포함된 DMEM 18mL로 교체합니다. 폴리에틸렌이민:DNA 혼합물 2mL를 각 배양 플라스크에 넣고 CO2 배양기(37°C, 5%CO2, 95% 습도)에서 세포를 배양합니다.</li>
	<li>5시간 후 10% FBS와 L-알라닐-L-글루타민(0.5g/L)이 보충된 DMEM 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>배양 3일 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 배양 플라스크에서 세포를 분리합니다. 10개(175cm2) 세포 배양 플라스크에서 293T 세포를 50mL 원뿔형 튜브에 수집하고 최대 30mL의 DMEM(재료 표 참조)을 추가합니다.</li>
	<li>293T 세포가 들어 있는 각 50mL 원뿔형 튜브에 3mL의 클로로포름을 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 5분 동안 고속으로 혼합합니다. 7.6mL의 5M NaCl을 추가하고 잠시 소용돌이하여 세포를 재현탁합니다. 3,000 × g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리.</li>
	<li>수성상을 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 9.4mL의 50%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000을 추가합니다. 소용돌이 믹서로 고속으로 10 초 동안 혼합하고 샘플을 1 시간 동안 얼음에 놓습니다.</li>
	<li>4°C에서 3,000× g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>1.4mL의 HEPES(50mM, pH 8)를 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 고속으로 5분 동안 혼합합니다. 3.5μL의 1MMgCl2, 14μL의 DNase I(20단위/μL) 및 1.4μL의 RNase A(10μg/μL)를 추가합니다. 37°C 수조에서 20분 동안 배양한 다음 샘플을 새 1.5mL 튜브(각 튜브당 700μL)로 옮깁니다.</li>
	<li>각 1.5mL 튜브에 클로로포름 700μL를 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 고속으로 10초 동안 혼합합니다. 4°C에서 3,000× g 에서 5분 동안 원심분리하고 수성상을 새로운 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 3회 반복합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛에서 30분 동안 클로로포름을 증발시킵니다. 그런 다음 수성 상 300 μL를 0.5 mL 초원심분리 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 필터를 25°C에서 14,000× g 에서 5분 동안 돌립니다. 플로우 스루를 제거하고 전체 볼륨이 필터를 통과할 때까지 필터를 다시 돌립니다.</li>
	<li>300μL의 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)을 첨가하여 필터를 세척하고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다. 필터를 25°C에서 14,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세척 단계를 4회 반복합니다.</li>
	<li>필터를 25°C에서 14,000× g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 필터를 새 튜브에 거꾸로 놓고 25°C에서 1,000× g 에서 2분 동안 회전시킵니다.</li>
</ol>3. qPCR에 의한 AAV의 적정
<ol><li>AAV 적정을 위한 표준 곡선을 준비하고 Fripont et al.15의 원래 연구에 따라 AAV 역가를 결정합니다.</li>
</ol>4. 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 AAV의 생체 내 주입
<ol><li>수술에 필요한 수술 도구와 용품을 분리하여 각 특정 재료에 권장하는 대로 멸균합니다.</li>
	<li>복강내 주사로 100mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진으로 마우스를 마취합니다. 발과 꼬리에 격렬한 압력을 가하고 반사를 확인하여 마취를 확인하십시오. 수술 중 눈이 건조하지 않도록 마우스의 눈에 연고를 바르십시오.</li>
	<li>마취된 마우스를 앙와위 자세로 놓고 면도기로 iWAT 주사를 위해 고관절 근위부에 있는 옆구리의 작은 부위를 면도합니다. 5 분 동안 제모 크림을 바릅니다. 피부 화상을 방지하기 위해 물로 잔여 크림을 제거하십시오.</li>
	<li>깨끗한 거즈와 70 % 알코올로 피부에 소독액 (포비돈 요오드)을 3 회 번갈아 가며 피부를 소독하십시오. 사용 후에는 거즈를 버리십시오.</li>
	<li>피부에 소독액을 최종 도포하십시오. 그런 다음 관절의 근위 부위에 멸균 된 가위로 1-2cm 절개를하고 집게를 사용하여 피부를 열어 지방 저장소를 노출시킵니다. WAT는 양쪽 피부에 부착되어 있으며 뒤쪽의 처음부터 고환쪽으로 뻗어 있습니다. 알림: 수술이나 봉합 절차 중 오염을 방지하기 위해 커튼을 사용하십시오.</li>
	<li>집게를 사용하여 절개를 통해 지방 저장소를 위쪽으로 부드럽게 당겨 주사가 올바른 위치와 깊이에 있는지 확인합니다. 알림: 티슈를 원래 위치에서 제거하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>마이크로리터 주사기(게이지: 33, 포인트 스타일: 4, 각도: 12, 길이: 10)(재료 표 참조)에 AAV(내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 포함)의 2.5μL(5.6 ×10 10 바이러스 게놈[VG]/μL)을 채웁니다. 바늘을 iWAT에 30°-45° 각도로 조심스럽게 삽입합니다. 조직의 다른 위치에 주사를 5회 반복하여 전체 iWAT 지방 패드를 균질하게 감염시킵니다. iWAT를 감염시키기 위해 총 부피 15μL가 권장됩니다. 알림: 주사기의 삽입 깊이는 지방 패드 침전물의 두께에 따라 다릅니다. 노터치 기술을 사용하여 주사를 그립니다.</li>
	<li>4/0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 면도한 피부 절개 부위를 닫습니다. 의식이 회복될 때까지 마우스를 열 패드에 올려 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 10-15 분마다 동물을 모니터링하십시오. 동물이 의식을 회복 한 후, 선형이어야하고 고통이나 통증의 징후가 없어야하는 운동 프로파일 링을 관찰하십시오.</li>
	<li>수술 후 48시간 이내에 트라마돌 염산염(5mg/kg)을 3일(2회/일) 복강 투여하여 수술 후 통증 조절을 시행합니다. 알림: 고통과 불편함의 징후를 관찰하고 물과 음식 섭취량을 모니터링하십시오. 효과적인 용량의 진통제를 선제적 방식으로, 가급적이면 수술 전이나 수술 시작 시에 투여하십시오.</li>
	<li>치유 기간 동안 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있는 새장에 마우스를 보관하십시오. 치유 기간이 지나면 마우스를 안락사시킵니다. 본 연구에서는 유도 용량의 3배(300-360mg/kg 케타민 염산염 + 30-40mg/kg 자일라진 염산염)의 주사 가능한 마취제를 과다 투여한 후 참수하여 안락사를 시행하였다. 알림: 마취에서 완전히 회복될 때까지 동물을 개별 케이지에 보관하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 기질 혈관 세포(SVF)를 베이지색 지방세포로 시험 관 내 분화
<ol><li>Aune et al.17에 따라 AdipoSPH 마우스의 iWAT에서 1차 SVF의 분리 및 도금을 수행합니다. AdipoSPH 마우스 iWAT에서 파생된 종자 SVF를 완전한 배지(3.1g/L 포도당, 0.5g/L L-알라닐-L-글루타민, 10% FBS 및 2.5% P/S를 포함하는 DMEM)를 포함하는 6웰 플레이트에 1-2시간 동안. 참고: SVF 분획에는 다양한 세포 유형의 혼합물이 포함되어 있습니다. 이 단계에서, 지방 세포를 발생시키는 시드 된 전구 세포의 수를 정의하는 것은 불가능하다.</li>
	<li>배지를 흡인하고, 인산염 완충 식염수(1x PBS)를 사용하여 웰을 2배 세척하고, 새로운 완전 배지로 교체한다. 세포가 70%-80% 합류도에 도달할 때까지 37°C, 5%CO2, 95% 습도에서 세포를 배양합니다.</li>
	<li>유도 배지로 세포를 처리하여 분화(0일째)를 유도한다(표 2). 참고: 유도 배지의 약물 칵테일은 베이지색 지방세포 분화를 향상시키고 열발생 유전자 프로그램의 발현을 위해 필요하다17.</li>
	<li>2일 후(2일째), 유도 배지를 유지 배지로 교체한다(표 2).</li>
	<li>2일 후(4일차) 2-3일 동안 유지 관리 매체를 새로운 유지 관리 매체(표 2)로 교체합니다.</li>
	<li>지방전구세포가 지방세포로 완전히 분화될 때까지 48시간마다 유지 배지를 교체합니다(일반적으로 유도 배지 첨가 후 6일). 성숙한 지방 세포는 분화된 세포에 지질 방울이 가득 차 있는 것처럼 보이기 때문에 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.</li>
</ol>6. SVF의 시험관 내 AAV 감염
참고: AdipoSPH 마우스 iWAT에서 파생된 SVF는 이전에 Wang et al.18 에 의해 설명된 바와 같이 몇 가지 수정을 통해 AAV 운반 sgRNA-Prdm16에 감염되었습니다.
<ol><li>5.1-5.3단계에서 앞서 설명한 대로 세포가 70%-80% 합류에 도달할 때까지 완전한 배지를 사용하여 6웰 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.</li>
	<li>5.6 ×10 VG/μL의 AAV 운반 sgRNA-Prdm16을 2mL의 완전 배지 및 헥사디메트린 브로마이드(8μg/mL)와 혼합합니다(재료 표 참조). 완전한 배지를 교체하고 AAV를 포함하는 완전한 배지를 추가하여 세포를 형질도입합니다. 형질도입된 세포를 37°C, 95% 습도 및 5% CO2에서12시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>세포 증식 및 베이지색 지방세포로의 분화를 위해 단계 5에 기재된 바와 같이 세포를 분절하고 시딩한다. 참고: 산소 소비 분석을 위해, 24-웰 세포 배양 플레이트에서 유도 배지를 사용하여 웰당 4.0 ×10 4 세포(단계 6.2로부터)를 시드합니다. 세포 증식 및 분화의 후속 단계는 단계 5에 기재된 바와 같이 수행된다. 산소 소비량 분석은 이전에 보고된 바와 같이 세포가 80%-100% 합류에 도달하고 완전히 분화될 때 수행된다19.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
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<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

CRISPR 기술의 가장 유용한 비편집 응용 분야 중 하나는 CRISPRa 시스템을 사용하여 내인성 유전자의 활성화를 통한 유전자 기능의 조사입니다6. SPH는 강력한 CRISPRa로, 원래 여러 신경성 유전자를 표적으로 삼아 성상교세포를 활성 뉴런으로 전환시키는 것으로 기술되었다14. 이 연구에서 AdipoSPH는 지방 세포에서 내인성 Prdm16의 발현을 활성화하여 베이지색 지방 생물학을 조사하는 데 적합한 도구임이 입증되었습니다. 지방 세포에서 SPH-유도된 Prdm16 과발현은 열 발생 유전자 프로그램의 활성화를 유도하고, 갈변 표현형을 유도하여, 이전의 형질전환(Tg) Prdm16 마우스 모델을 표현복사한다23. Prdm16은 갈색 및 베이지색 지방 분화를 조절하는 이 전사 인자의 중심 역할과 분화된 지방 세포에서 열 발생 유전자 프로그램(예: Ucp1 발현 향상)의 조절을 기반으로 베이지색 ...

베이지색(또는 브라이트) 지방세포는 백색 지방 조직(WAT) 저장소 내에 존재하는 단백질 1(UCP1) 발현 및 미토콘드리아가 풍부한 지방세포의 결합을 해제합니다. 베이지색 지방은 저온 노출 및 기타 자극에 대한 반응으로 지방 세포 전구체 또는 성숙한 백색 지방 세포의 하위 집합에서 나옵니다 1,2. 베이지색 지방세포는 UCP1 의존적 또는 독립적인 방식으로 에너지를 열로 변환할 수 있다3. 열 발생 기능에 관계없이 베이지색 지방은 아디포카인 분비, 항염증 및 항섬유화 활동과 같은 다른 수단을 통해 대사 건강을 개선할 수도 있습니다. 생쥐와 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 베이지색 지방을 유도하면 전신 포도당과 지질 항상성이 향상되는 것으로 나타났다3. 그러나 베이지색 지방 생물학에 대한 우리의 지식은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했지만 대부분의 대사 이점과 관련 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats(CRISPR)는 Cas9 단백질 4,5의 뉴클레아제 활성을 통해 게놈의 특정 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있는 도구로서 진핵 세포에서 처음 설명되었습니다. Cas9은 합성 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 유도되어 특정 게놈 영역을 표적으로 하여 DNA DSB를 유도합니다. CRISPR-Cas9 기술은 편집 목적으로 뉴클레아제 Cas9을 사용하는 것 외에도 서열 특이적 유전자 조절 도구로 사용되도록 발전했습니다6. 촉매 비활성 Cas9 단백질(dCas9)의 개발과 유전자 발현을 향상시킬 수 있는 전사 모듈의 결합으로 인해 CRISPR 활성화(CRISPRa) 도구가 탄생했습니다. SAM과 SunTag 활성제의 구성 요소를 결합한 VP647,8, 시너지 활성화 매개체(SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 및 SunTag-p65-HSF1(SPH)14와 같은 여러 CRISPRa 시스템이 등장했습니다. 최근 N2a 신경아세포와 일차 성상교세포에서 신경성 유전자의 유도 발현이 다른 CRISPRa 시스템에 비해 SPH를 사용하는 것이 더 높다는 것이 입증되었으며14, 이는 SPH가 유망한 CRISPRa 도구임을 입증한다.
여기서, 우리는 이전에 개발된 SPH 마우스(14 )를 활용하여 아디포넥틴 Cre 계통(AdipoSPH)을 사용하여 지방세포에서 SPH를 특이적으로 발현하는 조건부 마우스 모델을 생성하였다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사타구니 WATT(iWAT)의 갈변(흰색에서 베이지색으로의 전환)을 유도하여 열 발생 유전자 프로그램의 발현을 증가시켰습니다. 또한, 시험관내 Prdm16 과발현은 산소 소비를 향상시켰다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 내에서 베이지색 지방 발달 메커니즘을 탐색하기 위한 다목적 SPH 마우스 모델을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>3,3',5-트리요오도-L-티로닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 293T 세포주</td><td>Takarabio</td><td>632273</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 초원심 필터</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC510008</td><td>100 KDa</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Eagles Medium 변형 (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&trade; 보충</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>고농도의 포도당, 아미노산, 및 비타민</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Excelta 자동 개방 마이크로 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 세포 스크래퍼 (100 pk)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 날카로운 해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>시그마-알드리치</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Rapid DNA 결찰 시스템</td><td>Promega</td><td>M8225</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>마이크로리터 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td>모델 701</td></tr><tr><td>NEB 10-베타/안정&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019H</td><td>E. coli competent cells</td></tr><tr><td>pAAV2/8&nbsp;</td><td>애드진&nbsp;</td><td></td><td></td>112864</tr><tr><td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>91947</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6&nbsp;</td><td>애드진&nbsp;</td><td></td><td></td>112867</tr><tr><td>PEG 8000</td><td>시그마-알드리치</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민</td><td>시그마-알드리치</td><td>23966</td><td>선형, MW 25000</td></tr><tr><td>포비돈-요오드</td><td>Rioqu&iacute; 운모</td><td>510101303</td><td>방부제</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>SacI 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design Premier Adson Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-741</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Hamilton</td><td>475-40417</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>M180B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 완충액&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 효소 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>트라마돌 하이드로클로라이드</td><td>SEM</td><td>43930</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel&nbsp;</td><td>바우쉬 + 롬브&nbsp;</td><td>99620</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr suntag-p65-hsf1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 생물학에 혁명을 일으켰으며, 최근의 도구는 원래 기술된 유전자 편집을 훨씬 뛰어넘어 적용되었습니다. CRISPR 활성화(CRISPRa) 시스템은 촉매 비활성 Cas9(dCas9) 단백질과 별개의 전사 모듈을 결합하여 내인성 유전자 발현을 유도합니다. SunTag-p65-HSF1(SPH)은 최근에 개발된 CRISPRa 기술로, 시너지 활성화 매개체(SAM)의 구성 요소와 SunTag 활성제를 결합합니다. 이 시스템은 맞춤형 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하여 단일 또는 다중 유전자의 과발현을 허용합니다. 본 연구에서는 이전에 개발된 SPH 마우스를 사용하여 AdipoSPH라는 이름의 지방세포(adiponectin Cre lineage)에서 SPH를 발현하는 조건부 마우스를 생성하였다. 흰색에서 베이지색의 지방(갈변) 표현형을 유도하기 위해 내인성 Prdm16 유전자(갈색 및 베이지색 지방 발달과 관련된 잘 확립된 전사 인자)를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 주입했습니다. 이 마우스 모델은 내인성 Prdm16의 발현을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 활성화시켰다. 또한, 시험관 내 SPH 유도 Prdm16 과발현은 베이지색 지방세포의 산소 소비를 향상시켜 이전 Prdm16 형질전환 마우스 모델의 결과를 표현화했습니다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 생물학을 조사하기 위한 다재다능하고 비용 효율적이며 시간 효율적인 마우스 모델을 설명합니다.

AdipoSPH 마우스는 SPH 및 Adipoq-Cre 마우스 균주를 육종하여 개발되었습니다. 두 마우스 균주 모두 하이브리드 C57BL6J-DBA/2J 배경에 있었습니다(상용 공급업체에 따름, 재료 표 참조). SPH 마우스 계통은 원래 Zhou et al.14에 의해 설명되었습니다.
 AdipoSPH 매개 Prdm16 과발현을 통한 생체 내 베이지 지방세포 발달 생체 내에서 베이지색 지방세포를 발달시키기 위해 본 연구에 기술된 모델의 능력을 평가하기 위해, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 AAV를 AdipoSPH 마우스의 iWAT에 주입하였다. Prdm16은 베이지색 지방세포 발달 및 기능을 결정하는 잘 확립된 전사 인자입니다20,21<su...

이 프로토콜은 베이지색 지방 생물학을 조사하기 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)에 대한 대체 전략으로 지방 세포(AdipoSPH)에서 CRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)의 사용을 제시합니다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 AAV 운반 sgRNA의 생체 내 주입은 베이지색 지방 발달을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 향상시키기에 충분합니다.

CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

이 프로토콜은 지방 세포에서 이득 기능 분석을 수행하기 위한 기존 바이러스 벡터에 대한 대안 전략으로 SPH CRISPR 활성화 시스템을 제시합니다. 그것은 아데노 관련 바이러스를 사용하여 맞춤형 단일 가이드 RNA를 전달함으로써 지방 조직의 복잡한 세포 환경 내에서 단일 또는 다중 지방 세포 내인성 유전자의 과발현을 허용합니다. 이 프로토콜의 어려운 단계는 단일 가이드 RNA를 클로닝하고 아데노 관련 바이러스를 생산 및 지방 조직에 주입하는 것과 관련이 있습니다.먼저, 찹찹(chopchop) 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 PRDM16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: CRISPR/Cas9를 사용하여 Mus musculus에서 PRDM16으로 표적 및 활성화를 위해. 벡터 백본 PAAVU6GRNACBHM 체리의 Sac1 제한 부위와 일치하도록 sgRNA에 돌출부를 추가합니다.여기서 n은 뉴클레오티드에 대응하는 5'AGCT 3'를 포함한다. 표시된 도구를 사용하여 3'sgRNA 역보체 서열을 얻습니다. 다음에, 단일-가닥 상보적 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 위해, 10 마이크로리터의 최종 반응 부피를 위해 각각의 5' 및 3' 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 1 마이크로리터, T4 리가제 완충제 1 마이크로리터, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 0.5 마이크로리터 및 물 6.5 마이크로리터를 첨가한다.섭씨 37도에서 30분 동안, 섭씨 95도에서 5분 동안 열순환기를 사용하여 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 다음 분당 섭씨 5도의 램프 다운 속도를 수행합니다. 그런 다음 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 결찰을 위해 2마이크로리터의 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드, 1마이크로리터의 Sac1 효소, 2마이크로리터의 10X T4 DNA 리가아제 완충액, 1마이크로리터의 T4 DNA 리가아제 및 물을 10마이크로리터의 최종 반응 부피에 25나노그램의 플라스미드 PAAVU6GRNACBHM 체리를 추가합니다. 열순환기를 사용하여 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 5분 동안 15사이클 동안 인큐베이션하고 섭씨 25도에서 5분 동안 인큐베이션한 후 섭씨 4도에서 유지하여 결찰을 수행합니다.다음에, 유능한 대장균 DH10B 세포를 섭씨 42도에서 45초 동안 열 충격에 의해 4 마이크로리터의

investigation-beige-fat-biology-metabolism-using-crispr-suntag-p65

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

이 비디오 보고서에서는 활성화 및 우울한 조건에서 마우스의 견갑골 갈색 지방 조직에 대한 Cerenkov Luminescence Imaging(CLI)의 적용을 보여줍니다.

견갑골 갈색 지방 조직의 Cerenkov 발광 이미징

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

마이크로 PET/MR 이미징 기반 접근법을 사용하여 마우스에서 열원성 지방 창고의 기능적 이미징 및 정량화.

[18F]FDG 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 마우스의 갈색 및 베이지 지방 조직의 시각화 및 정량화

여기에서 우리는 갈색 지방 조직(BAT) 활동이 인간 대사에 미치는 영향의 생리학적 중요성을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 탄수화물 부하와 간접 열량계를 쇄골 상 온도 변화의 측정과 결합하여 달성됩니다. 이 새로운 접근법은 인간의 BAT 열 발생에 대한 약리학적 표적을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

간접 열량계, 적외선 체온 측정 및 혈당 수치의 조합을 사용하여 인간의 갈색 지방 조직 열 발생을 측정합니다.

여기에서 우리는 인간과 실험실 동물에서 식사 후 갈색 지방 조직 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

갈색 지방 조직 활동의 변화를 감지하기 위한 적외선 열화상 촬영

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

배우세요 SPH CRISPR 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사 방법입니다. 맞춤형 sgRNA를 AAV로 전달하여 지방세포 내 PRDM16 유전자를 활성화하고, 생체 내에서 열생성 유전자 프로그램을 연구할 수 있습니다.

CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사

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