Name: 배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 제브라피쉬 ZEM2S 및 ZFL 세포주를 이용한 3D 스페로이드 배양 방법으로 어류 독성 시험을 위한 효율적인 연구 모델을 구축하는 기술입니다.

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이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticário의 재정 지원에 대해 생리학 부서 (UFPR)의 다중 사용자 실험실에 감사드립니다.

둥근 바닥 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 3D 스페로이드를 생성하는 주요 단계는 그림 1에 나와 있습니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 배양 배지에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
1. 세포 배양 배지 및 단층 배양
<ol><li>두 세포주(ZFL, ZEM2S)를CO2 없이 28°C의 인큐베이터에서 단층으로 성장시키고 ~80% 합류에 도달하면 1:3의 계대배양 비율로 계대배양합니다.<ol><li>위에서 설명한 대로 배양된 ~80% 합류점에서 제브라피쉬 세포의 T75 플라스크로 시작합니다.</li>
		<li>완전한 배지를 제거하고, 피펫의 도움으로 배양 플라스크에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(0.01 M)를 첨가하여 세포를 세척한다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 3mL의 1x 트립신-0.5mM EDTA(0.05%[v/v])를 배양 플라스크에 넣고 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 28°C에서 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>플라스크를 가볍게 두드려 세포를 방출한 다음 플라스크에 완전한 배양 배지 3mL를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>펠렛 형성 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 사용중인 각 세포주 (ZFL 또는 ZEM2S)에 대한 완전한 배지 1mL를 첨가하고, 마이크로 피펫을 사용하여 재현탁한다. 세포 계수를 위해 부분 표본을 가져 가십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 트리판 블루 염료 배제 테스트를 통한 세포 계수
<ol><li>세포 현탁액 10μL와 트리판 블루 염료 10μL를 마이크로튜브에 추가하여 세포 수를 세고 생존력을 평가합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 피펫을 사용하여 염색합니다.</li>
	<li>그런 다음 이 혼합물(세포 현탁액 + 트리판 블루) 10μL를 노이바우어 챔버로 옮기고 트리판 블루를 흡수하지 않는 세포를 생존 가능한 것으로 간주하여 챔버 모서리에 배치된 4개의 큰 사각형(사분면: Q)의 세포를 계수합니다. 방정식 (1)을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1개)</li>
	<li>세포 현탁액의 최종 세포 수를 계산하려면 식 (1)을 사용하여 결정된 세포 번호에 2(트리판 블루 사용으로 인한 희석 계수)를 곱합니다. 알림: 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. ULA 플레이트의 셀 도금
<ol><li>세포 수를 계산한 후, 세포 현탁액을 각 세포주에 필요한 세포 수로 96-웰 둥근 바닥 ULA 플레이트의 웰당 200 μL의 플레이트로 조정하고, 아래와 같이 한다.<ol><li>플레이트 7,000 생존 가능한 ZFL 세포/웰; 따라서 전체 ULA 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지에 700,000개의 세포를 사용합니다.</li>
		<li>플레이트 3,500 생존 가능한 ZEM2S 세포/웰; 따라서 전체 ULA 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지에 350,000개의 세포를 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배지 저장소에서 조정된 농도의 세포로 세포 현탁액을 준비하고 거품이나 기포가 형성되지 않도록 주의하면서 다채널 마이크로피펫을 사용하여 혼합합니다. 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 조정된 세포 현탁액 200μL를 ULA 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 알림: 플레이트는 96웰 플레이트에서 배양 배지가 증발하는 것을 방지하기 위해 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉해야 합니다.</li>
</ol>4. 스페로이드 형성
<ol><li>ULA 플레이트를 28°C 인큐베이터에서 5일 동안 70 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다. 스페로이드가 5일 동안 궤도 흔들림을 통해 형성되도록 하여 평균 직경 ~225μm(ZFL 스페로이드) 및 직경 ~226μm(ZEM2S 스페로이드)에 도달합니다12. 참고: 5일간의 배양(최대 원형도) 후 스페로이드를 사용할 준비가 된 것입니다.</li>
	<li>스페로이드를 5일 이상 배양 상태로 유지하려면 5일마다 사용한 배지 100μL를 제거하고 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 신선하고 완전한 배양 배지 100μL를 추가합니다. 알림: 이 과정에서 스페로이드를 흡인하지 않도록 주의하십시오.</li>
</ol>5. 스페로이드의 크기(직경)와 형상(원형지수) 측정
<ol><li>이미지를 획득합니다.<ol><li>이미징 캡처 시스템이 있는 도립 광학 현미경에서 정의된 스케일의 이미지를 얻습니다. 참고: 현미경 사용 stage, 보정 슬라이드 또는 Neubauer 슬라이드(사분면 크기를 알고 있음)를 사용하여 스케일을 얻습니다.</li>
		<li>현미경으로 스케일 사진을 얻는 데 사용된 것과 동일한 대물 렌즈를 사용하여 완전히 형성된 스페로이드(즉, 5일 된 스페로이드)의 이미지를 얻습니다. 참고: 이미지 해상도는 스페로이드의 크기와 모양을 결정하는 데 중요하며 시스템 유형에 따라 다를 수 있으므로 모든 이미지는 동일한 이미징 캡처 시스템을 사용하여 촬영해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스케일을 설정합니다.<ol><li>ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정의된 스케일의 이미지를 엽니다( 파일 | 열기 클릭).</li>
		<li>도구 모음에서 직선 선택기 를 선택하고 마우스를 사용하여 이미지에서 정의된 비율의 확장을 가로질러 선을 끕니다.</li>
		<li>Analyze(분석) | 배율을 설정하고 배율 설정 창이 열릴 때까지 기다립니다.</li>
		<li>배율 설정 창에서 알려진 거리의 공백을 직선에 해당하는 알려진 거리(μm)로 채웁니다. 길이 단위를 μm의 UM으로 채웁니다. 확인을 클릭합니다. 참고: 픽셀/μm 단위의 배율은 창 하단에 표시됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>측정 매개변수를 설정합니다.<ol><li>ImageJ 소프트웨어에서 분석 | 측정값 설정 - 측정값 설정 창을 엽니다.</li>
		<li>Set measurements(측정 설정) 창에서 원하는 측정에 대한 상자(예: Area 및 Shape 설명자)를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드의 지름과 원형도를 구합니다.<ol><li>스페로이드 그림 열기(파일 | 열기).</li>
		<li>도구 모음에서 자유형 선택 도구를 선택하고 그림 3A와 같이 마우스를 사용하여 스페로이드의 바깥쪽을 선택합니다. 참고: 이미지를 확대 또는 축소하려면 Ctrl 키를 누르고 마우스를 사용하여 아래 또는 위로 스크롤하거나 Ctrl 키를 누르고 키보드의 위쪽 또는 아래쪽 화살표 키를 사용합니다.</li>
		<li>분석 | 측정을 클릭하여 측정값이 표시되는 결과 창을 엽니다.</li>
		<li>면적 값을 사용하여 방정식 (2)를 사용하여 스페로이드의 크기(직경)를 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2개)</li>
		<li>순환성 지수는 결과 창에 "Circ."로 표시되며 방정식 (3)을 사용하여 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) 참고: 원형도 지수 1.0은 완벽한 구상 형상을 나타내고, 값이 0.0에 가까울수록 길쭉한 형상을 나타낸다13.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이것은 제브라피쉬 간 및 배아 세포주의 스페로이드를 생성하기 위한 간단하고 쉽고 빠른 방법입니다. 이 방법은 스페로이드 형성과 관련된 과학적 연구에서 보고된 문제와 3D 스페로이드 분석의 데이터 정확도 불확실성을 극복하기 위해 기존 3D 스페로이드 방법을 수정하여 개발했습니다. 예를 들어, 보고된 문제는 취급의 어려움, 스페로이드 생성의 시간 소모적인 특성, 분석을 수행하기 위해 유사한 크기 및 모양의 스페로이드를 선택해야 하는 필요성, 행잉 드롭 방법 3,7,12에서 스페로이드를 드롭에서 마이크로플레이트로 옮기는 과정의 어려움에 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 CO2가 없는 조건에서 ZFL 및ZEM2S 세포주의 배양을 권장합니다. 두 세포주 모두에 대해 이러한 프로토콜에서 제안된 배양 배지 조성 및CO2 없는 환경은 문헌에...

스페로이드는 3D 배양에서 세포가 세포 간 밀접하게 접촉하여 배양될 때 형성되는 작은 세포 구체입니다. 생체 내 조직 환경을 모방하는 스페로이드의 능력은 이미 다양한 세포주와 일차 세포에서 연구되었습니다 1,2. 그러나, 스페로이드가 포유류 독성 연구를 위해 잘 개발되어 있지만, 비포유류 척추동물(예: 어류)을 이용한 독성 연구를 위한 스페로이드의 개발은 아직 진행 중이다3. 어류 세포주의 경우, 스페로이드는 다양한 유형의 웰 플레이트 (3,4,5,6,7)를 사용하는 궤도 쉐이킹 (orbital shaking, OS) 및 자성 나노 입자8를 이용한 자기 부상 방법(2)과 같은 다양한 방법으로 개발되었다. 그러나 스페로이드에 대한 이러한 배양 방법 중 일부는 다른 방법보다 더 많은 단점을 가질 수 있습니다.
예를 들어, 대형 마이크로플레이트(24웰 플레이트)의 선회 방법은 크기와 모양이 다른 많은 수의 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 실제로, 다중 스페로이드 구조 형성이 입증되었습니다7. 이를 위해서는 실험을 위해 비슷한 크기와 모양의 스페로이드를 직접 선택하려는 많은 노력이 필요합니다. 행드롭 3D 배양 방법은 포유 동물 세포주 1,2,9,10,11의 스페로이드를 생성하는데 통상적으로 사용되며, 이에 의해 한 방울 당 단일 스페로이드가 생성될 수 있어, 상술한 문제를 피할 수 있다. 그러나, 변형된 행잉 드롭 방법(행잉 드롭 + 오비탈 쉐이킹)은 저렴한 방법을 사용하여 ZFL 스페로이드를 생성할 수 있지만, 그 단점이 있다12. 형성된 세포 응집체는 방울에서 장기간 유지 될 수 없습니다. 따라서 우물 판으로 옮겨야합니다. 이 공정은 층류 후드에서 강렬한 취급과 장기간의 작업을 필요로 하는데, 이는 마이크로피펫(micropipette)(12)을 사용하여 적가(dropwise)하기 때문이다. 또한, 이 방법은 ZFL 스페로이드를 완전히 형성하는 데 10일이 걸립니다(행잉 드롭에서 5일 + OS에서 5일)12. 이러한 단점은 특히 화학적 우선 순위 지정 및 제품 지속 가능성에 대한 잠재적 응용 분야를 고려할 때 독성 테스트를 위한 3D 어류 스페로이드의 적용을 제한할 수 있습니다.
따라서 이 기사에서는 96웰, 초저부착 플레이트(ULA-plates) 및 궤도 쉐이커(회전 직경 22mm)의 조합을 기반으로 ZFL(D. rerio normal hepatocyte) 및 ZEM2S(D. rerio blastula phase embryo) 세포주의 단일 스페로이드를 생성할 수 있는 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 적용된 방법은 간단하고 재현 가능하며 단기간(5일)에 유사한 크기와 모양의 스페로이드를 대량으로 생성할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 산업계와 학계 모두에서 수생 독성 연구를 위한 어류 3D 모델의 적용과 생태 독성 테스트를 위한 대체 방법의 구현 진행을 지원할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 투명 원형 바닥 초저 부착 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 분말, 고포도당, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 영양 혼합물, 분말</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Java로 이미지 처리 및 분석( ImageJ) 1.52p 소프트웨어</td><td>&nbsp; National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>사용 가능: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium, 분말</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital 쉐이커&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td> 칼슘 및 마그네슘이 포함된 <td>22mm 회전 직경</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS(10x)</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - 소 태아 혈청, 유격, USDA 승인 지역</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 바이오시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), 페놀 레드</td><td>없음 Gibco 15400054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>이 세포주는 위스콘신 대학교 Michael J. Carvan 교수님께서 친절하게 기증하였습니다. 미국 밀워키)</td></tr><tr><td>ZFL 세포주</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3d 배양 방법

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

어류 세포주는 생태 독성 평가를 위한 시험관 내 모델이 유망합니다. 그러나, 종래의 단층 배양 시스템(2D 배양)은 잘 알려진 한계(예를 들어, 배양 수명 및 일부 생체내 세포 기능의 유지)를 갖는다. 따라서, 스페로이드와 같은 3D 배양이 제안되었는데, 그 이유는 이러한 모델이 조직과 같은 구조를 재현할 수 있고, 생체 내 조건을 더 잘 재포착할 수 있기 때문이다. 이 기사에서는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)을 사용하여 스페로이드를 형성하기 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥, 초저 부착, 96웰 플레이트에 세포를 도금하는 것으로 구성됩니다. 오비탈 쉐이킹(70 rpm) 하에서 5일 후, 웰 당 단일 스페로이드가 형성된다. 형성된 스페로이드는 안정적인 크기와 모양을 나타내며, 이 방법은 웰에서 여러 스페로이드가 형성되는 것을 방지합니다. 따라서 비슷한 크기의 스페로이드를 직접 고를 필요가 없습니다. 이 스페로이드 분석법의 용이성, 속도 및 재현성은 고처리량 in vitro 테스트에 유용합니다.

안정된 크기 및 형상을 갖는 웰 당 단일 스페로이드가 이 방법에 의해 형성된다. 그림 2는 궤도 진탕(70rpm) 하에서 ULA 플레이트의 웰에서 ZFL 및 ZEM2S 세포의 단일 스페로이드 형성 과정을 보여줍니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주는 3D 배양에서 서로 다른 거동을 보입니다. ZEM2S 세포주는 궤도 진탕 첫날부터 구상 모양을 쉽게 형성할 수 있는 능력을 부여하는 특징을 나타내는 반면(그림 2E), ZFL 세포주는 원하는 구상 모양에 도달하는 데 5일이 걸립니다(그림 2A-C). 이 방법으로 생성된 스페로이드는 그림 2D(16일령 ZFL 스페로이드) 및 그림 2H(10일령 ZEM2S 스페로이드...

여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

이 프로토콜은 어류 독성 테스트에서 다양한 잠재적 응용 분야를 가진 3D 체외 모델인 제브라피쉬 스페로이드를 쉽게 생성할 수 있습니다. 이것은 크기와 모양이 매우 유사한 제브라피쉬 세포주의 단일 스페로이드를 생성하는 간단하고 빠른 방법입니다. 설명 된 모든 단계를 올바르게 수행하면 문제가 발생하지 않습니다.Zebrafish 스페로이드는 화장품과 같은 제품의 환경 안전성 평가를 개선하는 데 도움이 되는 물고기에 대한 화학 물질의 영향 탐색에 큰 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 유전학 의사 인 Irisdoris Rodrigues de Souza가 될 것입니다. 시작하려면 약 80%의 합류점에서 제브라피쉬 세포의 T75 플라스크를 가져옵니다.완전한 배지를 제거하고, 피펫으로 배양 플라스크에 0.01 몰 PBS를 첨가하여 세포를 세척하였다. 배양 플라스크를 PBS로 세척하고 플라스크를 부드럽게 흔들어 PBS를 제거한다. 트립신 0.5 밀리몰 EDTA 3 밀리리터를 배양 플라스크에 첨가하고, 섭씨 28도에서 3 분 동안 배양한다.플라스크에서 세포를 분리하려면 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 분리합니다. 그런 다음 플라스크에 3 밀리리터의 완전 배양 배지를 첨가하여 트립신 소화를 중지합니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 밀리리터 원추형 원심 분리 튜브로 옮기고 100G에서 5 분 동안 원심 분리합니다.그런 다음 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 사용 중인 각 세포주에 대해 완전한 배지 1밀리리터를 추가하고 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 10 마이크로리터의 트리판 블루 염료를 마이크로 튜브에 첨가하여 세포를 계수하고 생존력을 평가합니다.피펫을 사용하여 세포 현탁액과 염료를 혼합하고, 이 혼합물 10 마이크로리터를 노이바우어 챔버로 옮긴다. 챔버 모서리에 배치된 4개의 큰 정사각형 또는 사분면의 세포를 세고, 트리판 블루를 차지하지 않는 세포를 생존 가능한 것으로 간주합니다. 그런 다음 화면에 표시된 방정식을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.이 세포 번호에 2를 곱하여 세포 현탁액의 최종 세포 수를 계산합니다. 세포 수를 계산한 후, 세포 현탁액을 각 세포주에 필요한 세포 수와 함께 96-웰 둥근 바닥 ULA 플레이트의 웰 당 200 마이크로리터의 플레이트로 조정하였다. 중간 저장소에서 조정 된 농도의 세포로 현탁액을 준비하고 거품이나 기포를 형성하지 않고 다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 혼합합니다.200 마이크로리터의 조정된 세포 현탁액을 둥근 바닥 ULA 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 다중 채널 피펫 사용. 플레이트는 96웰 플레이트에서 배양 배지가 증발하는 것을 방지하기 위해 Parafilm 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉해야 합니다.플레이트를 이산화탄소 없이 섭씨 28도의 인큐베이터에서 5일 동안 70RPM의 궤도 셰이커에서 배양합니다. 5일 후, 생성된 스페로이드를 평가하기 위해 도립 광학 현미경으로 스페로이드를 관찰합니다. 스페로이드의 모양과 크기를 측정하려면 스페로이드의 사진을 얻고 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리하고 분석합니다.알려진 스케일을 기반으로 선택한 영역을 측정하도록 소프트웨어를 설정한 후 스페로이드의 바깥쪽을 선택하여 영역과 원형을 결정합니다. 스페로이드의 면적은 지름 d를 계산하여 크기를 결정하는 데 사용되며, 소프트웨어는 선택한 면적과 둘레를 사용하는 공식으로 스페로이드의 원형을 제공합니다. ZFL 세포 응집체는 궤도 흔들림의 첫날에 형성됩니다.세포 응집체는 3일째에 원형을 증가시키고 5일째에 적절한 구상 모양에 도달합니다. ULA 플레이트의 16일 된 ZFL 스페로이드가 여기에 표시됩니다. ZEM2S 세포주는 안와 진탕 첫날부터 스페로이드를 형성합니다.스페로이드는 3일째에 모양을 유지하고 크기가 증가하며 5일째에 최대 원형도에 도달합니다. ULA 플레이트에 있는 10일 된 ZEM2S 스페로이드가 여기에 나와 있습니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주의 측정된 스페로이드 크기와 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드의 측정된 원형도 지수가 이 그림에 나와 있습니다.이 그래픽 이미지는 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드의 성장 패턴을 나타냅니다. 100RPM에서 5일 동안 궤도를 흔들어 형성한 ZFL 스페로이드와 ZEM2S 스페로이드가 여기에 나와 있습니다. 70 및 100 RPM 회전 속도에서 형성된 스페로이드의 성장 패턴과 원형도 지수가 이 그림에 나와 있습니다.70RPM은 이 방법으로 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드를 형성하는 데 가장 적합한 속도입니다. 렉틴(Lectin), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594에 의한 세포막 염색 및 DAPI에 의한 핵의 염색은 스페로이드 코어의 세포 무결성을 입증합니다. AlamarBlue의 감소에 의해 형성된 레조루핀의 형광은 두 스페로이드의 코어에서 생존 가능한 세포를 보여줍니다.ZEM2S 및 ZFL 세포주의 3D 배양 및 2D 배양에서의 MTT 생존율 분석이 여기에 나타나 있으며, 이는 유의미한 차이가 없음을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때 배양 배지의 pH가 변경되고 웰에서 증발하지 않도록 플레이트를 밀봉해야 합니다. 스페로이드는 배아 ZEM2S 세포주를 사용한 어류 간 또는 발달 연구에서 독성 효과를 평가하기 위한 다양한 시험관 내 분석에 적용할 수 있습니다.이 프로토콜은 시험관 내 어류 테스트의 개발을 촉진하는 데 도움이 될 수 있으며, 동물 기반 생태 독성 연구의 진행에 기여할 수 있습니다.

a-3d-culture-method-spheroids-embryonic-liver-zebrafish-cell

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

여기서, 우리는 척추 동물 분할의 라이브 연구를 가능하게, 제브라피시 후방 체축의 3-D 조직 배양에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 각성 모델은 축 신장, 형태항원 변형, 세포외 분해능 조직 수준 라이브 이미징에 대한 제어를 제공합니다.

얼룩말피에서 척추동물 세분화를 연구하는 3-D 꼬리 이식 문화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

배우세요 제브라피쉬 ZEM2S 및 ZFL 세포주를 이용한 3D 스페로이드 배양 방법으로 어류 독성 시험을 위한 효율적인 연구 모델을 구축하는 기술입니다.

배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법

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