Name: Zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 ZEM2S 및 ZFL 세포주를 이용한 96웰 플레이트 세포독성 분석법으로 화학물질의 급성 독성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 동물 실험 없이 생태독성 연구를 수행하는 데 활용됩니다.

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이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성에 대한 생리학과 (UFPR)의 다중 사용자 실험실과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticario의 재정 지원에 감사드립니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 재료 목록은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 매체의 구성은 표 1 을 참조하십시오.
1. ZFL 및 ZEM2S 세포 준비
<ol><li>80% 합류도를 갖는 ZFL 또는 ZEM2S 세포의 T75 플라스크로 시작하여,CO2 없이 28°C에서 각각의 완전한 배지에서 배양하였다.</li>
	<li>플라스크에서 배양 배지를 제거하고 10mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(0.01M)를 첨가하여 세포를 세척합니다. 3mL의 1x 트립신(0.05% v/v, 0.5mM 트립신-EDTA)을 배양 플라스크에 추가합니다. 28°C에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>플라스크를 가볍게 두드려 세포를 방출한 다음 플라스크에 완전한 배양 배지 3mL를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 ZFL 또는 ZEM2S 세포용 완전 배지 1mL를 추가하고 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.</li>
</ol>2. 트리판 블루 염료 배제에 의한 세포 계수
<ol><li>세포 현탁액 10μL와 트리판 블루 염료 10μL를 마이크로튜브에 추가하여 세포 수를 세고 생존력을 평가합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 피펫을 사용하여 염색합니다.</li>
	<li>그런 다음 이 혼합물(세포 현탁액 + 트리판 블루) 10μL를 노이바우어 챔버로 옮기고 생존 가능한 세포가 트리판 블루를 차지하지 않는 세포로 간주하여 챔버 모서리에 배치된 4개의 큰 사각형(사분면 Q)의 세포 수를 세습니다. 방정식 (1)을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 결정하십시오. <img alt="셀 수 수식: 셀 번호 = (ΣQ/4) × 10^4; 정량화를 위한 수학 방정식." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (1개)</li>
	<li>식 (1)을 사용하여 결정된 세포 번호에 2 (트리판 블루 사용으로 인한 희석 계수)를 곱하여 세포 현탁액의 최종 세포 수를 계산합니다. 참고: 대안으로, 자동화된 세포 계수 시스템(예: 세포 계수 및 생존 기능이 있는 세포량체)을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 96웰 플레이트의 세포 도금
<ol><li>세포독성 분석을 수행하는 데 필요한 세포 수를 얻는 데 필요한 세포 현탁액 부피를 계산합니다. 각 세포주에 대한 생존 가능한 세포의 수는 다음과 같습니다.<ol><li>웰 당 60,000개의 생존 가능한 ZEM2S 세포를 플레이트; 따라서 전체 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지(200μL/웰, 96웰 플레이트)에 600만 개의 세포를 사용합니다.</li>
		<li>웰 당 40,000개의 생존 가능한 ZFL 세포를 플레이트; 따라서 전체 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지(200μL/웰, 96웰 플레이트)에 400만 개의 세포를 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>그 후, 각 부피의 세포 현탁액을 시약 저장소(멸균)로 옮기고 ZFL 또는 ZEM2S용 완전 배양액을 20 mL로 채웁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 용액을 위아래로 부드럽게 혼합하십시오. 알림: 거품이나 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>다채널 마이크로피펫을 사용하여 투명 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 200μL를 추가합니다. 플레이트를 28°C에서 24시간 동안 배양합니다. 알림: 플레이트에는 블랭크 컨트롤을 위한 셀이 없는 웰이 3개 이상 있어야 하며 이 웰에는 완전한 매체만 추가해야 합니다. 에지 효과(에지 웰에서의 더 높은 증발에 의해 야기됨)는 96-웰 플레이트 분석에서 통상적으로 발생하며, 플레이트(28)의 에지 웰 내의 세포의 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 이 효과는 96-웰 플레이트 브랜드 및 설계(28)에 따라 더 높거나 낮을 수 있다. 가장자리 웰에서 ZFL 및 ZEM2S에 대한 세포 성장/생존 교란을 발견하지 못했지만, 이 효과를 방지하기 위해 플레이트를 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉하거나 60개의 내부 웰에서만 세포를 배양하고 가장자리 웰을 PBS로 채우는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 화학 물질을 시험하기 위한 세포 노출
<ol><li>다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 우물에서 사용한 배지를 조심스럽게 버립니다.</li>
	<li>세포를 다른 농도의 화학 물질에 노출시킵니다. 소태아혈청(FBS) 없이 ZFL 또는 ZEM2S용 배양 배지(exposure media)에서 시험 화학물질 농도의 용액을 준비한다. 그런 다음 이러한 용액을 웰당 100μL를 기술적으로 삼중(즉, 3웰/테스트 화학 물질 농도)으로 추가합니다.</li>
	<li>대조군의 경우 대조군을 테스트 화학 물질과 동일한 플레이트에 기술 삼중(3개의 웰/대조군)으로 배치합니다. 따라서, 블랭크 대조군(B)의 경우, 무세포 웰에 100 μL의 노출 배지를 추가하고, 음성 대조군(NC)의 경우, 100 μL의 노출 배지를 세포가 있는 웰에 추가하고, 양성 대조군(PC)의 경우, 노출 배지에서 제조된 1% Triton X-100의 용액에 세포를 노출시킨다. 일부 경우에, 용매 대조군 (SC)은 최종 용매 농도로서 명백히 비 세포 독성 농도를 고려하여 플레이트에 포함되어야한다. 참고: 0.5% DMSO를 용매로 사용하는 것이 좋습니다. DMSO는 음성 대조군과 관련된 세포독성 역치인 10%를 초과하지 않고 이들 세포주에서 용매로서 최대 1%까지 사용할 수 있다.</li>
	<li>플레이트를 28°C에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 배지 증발을 방지하기 위해 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 플레이트를 밀봉합니다. 참고: 특정 화학 물질은 지표 염료의 흡광도 또는 형광을 방해할 수 있는 고유한 배경 흡광도 또는 형광을 가질 수 있습니다(예: 색이 있는 화합물은 흡광도, 혈청 알부민29 및 환원 효소를 방해하는 화합물에 영향을 미칠 수 있습니다30,31). 이 경우, 플레이트는 세포가없는 우물에 시험 화학 용액을 첨가하여 추가 제어를 포함해야합니다. 이는 염료와 화학적 자동 흡광도/자가 형광의 간섭 가능성을 확인하기 위한 것입니다. 간섭이 감지되면 세포 독성의 정확한 예측을 얻기 위해 간섭을 배제 할 수 있는지 여부를 평가해야합니다.</li>
</ol>5. 세포독성 분석
알림: 표 1에 따라 모든 용액을 준비합니다. 아래에 설명 된 모든 단계 (그림 1)는 멸균 조건에서 수행됩니다. 피펫을 사용하여 노출 배지를 버리는 것은 화학 처리 후 세포가 웰에서 쉽게 분리될 수 있기 때문에 권장되지 않습니다.
<ol><li>AB 및 CFDA-AM 어세이<ol><li>테스트 화학 물질에 24시간 노출된 후 내용물을 수집 트레이에 부어 노출 매체를 조심스럽게 폐기합니다.</li>
		<li>플레이트를 200 μL의 PBS로 세척한다. 세포 손실을 방지하기 위해 PBS를 수집 트레이에 부어 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>AB/CFDA-AM 용액의 웰당 100 μL를 추가합니다. 플레이트를 28°C의 암실에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>AB의 경우 530nm(여기) 및 595nm(방출), CFDA-AM의 경우 493nm(여기) 및 541nm(방출)에서 형광 플레이트 판독기의 형광을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>NR 분석 참고: NR 분석 단계는 AB 및 CFDA-AM 분석 직후에 수행됩니다(그림 1).<ol><li>NR 작업 용액(40μg/mL)을 600 ×g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 알림: 튜브의 NR 침전이 플레이트로 전달되어서는 안 됩니다. 따라서, NR 작동 용액을 원심분리한 후, NR 침전물을 흡인하지 않고 피펫을 이용하여 상층액을 수집한다. 상청액을 시약 저장소로 옮깁니다.</li>
		<li>내용물을 수집 트레이에 부어 AB/CFDA-AM 용액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 NR 작업 용액의 웰당 100 μL를 추가합니다. 플레이트를 28°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다. 참고: 3시간 배양 후 현미경을 사용하여 플레이트에서 NR 침전이 발생했는지 관찰합니다. NR 침전물은 세포 생존율의 정량화를 방해할 수 있으며, 따라서, 이들은 존재해서는 안 된다.</li>
		<li>내용물을 수집 트레이에 부어 NR 용액을 조심스럽게 제거합니다. 웰 당 150 μL의 PBS를 첨가하여 웰을 세척한다.</li>
		<li>NR 추출 용액을 웰 당 150 μL를 첨가하고 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 인큐베이션하여 부드럽게 진탕합니다. 플레이트 리더에서 540nm에서 흡광도를 측정합니다. 알림: 플레이트의 배경 지문 흡광도를 배제하기 위해 690nm에서 두 번째 판독을 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT 어세이 참고: MTT 분석은 위에서 설명한 분석과 별도로 수행해야 합니다(새 플레이트에서)(그림 2).<ol><li>내용물을 수집 트레이에 부어 노출 미디어를 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 웰당 100μL의 MTT 작업 용액을 추가합니다. 플레이트를 28°C에서 4시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>MTT 용액을 수거 트레이에 쏟아 부어 폐기합니다.</li>
		<li>웰 당 100 μL의 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 추출하고, 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 인큐베이션한다. 플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다. 알림: 플레이트의 배경 지문 흡광도를 배제하기 위해 690nm에서 두 번째 판독을 수행해야 합니다. 테스트 화학물질이 MTT를 방해할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하며, 이는 생성된 데이터(32)의 품질을 보장하기 위해 평가되어야 한다. 이를 위해 테스트 농도와 MTT(0.5mg/mL)가 포함된 cell-free 웰을 노출시킨 다음 배양하여 흡광도를 증가시키고 잘못된 생존 결과를 초래할 수 있는 웰의 색상 변화를 관찰해야 합니다. 이 테스트에서는 MTT와 상호 작용하는 화학 물질을 피해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 세포 생존율/세포독성 계산
참고: 획득한 원시 흡광도 또는 형광은 음성 대조군(노출 배지에서 직접 준비된 테스트 화학 물질의 경우) 또는 용매 제어(DMSO와 같은 용매를 사용하여 준비된 테스트 화학 물질의 경우)와 관련된 백분율로 세포 생존율을 계산하는 데 사용됩니다. 세포 생존율 백분율을 결정하기 전에 원시 데이터는 블랭크 컨트롤에 의해 정규화되어야 합니다.
<ol><li>각 테스트 화학 물질 농도 및 대조군(3개의 웰/처리)에 대한 평균 흡광도 또는 형광을 계산합니다.</li>
	<li>세포 생존율을 결정하려면tage 대조군(음성 또는 용매)과 비교하여 방정식 (2)를 사용합니다. <img alt="흡광도를 기준으로 백분율을 나타내는 생화학적 분석의 세포 생존력 계산 공식." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (2개) 참고: 흡광도(abs) 또는 형광(fluo) 단위는 농도당 3개의 웰에서 측정된 흡광도 또는 형광의 평균을 나타냅니다. 공백은 세포가 없는 웰을 나타냅니다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

세포독성 분석은 시험관 내 독성 평가에 널리 사용되며, 이 프로토콜 기사에서는 제브라피쉬 세포주에서 수행되도록 변형된 4가지 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(즉, 96웰 플레이트의 세포 밀도, MTT 분석의 배양 시간, 화학 노출 조건 동안의 FBS 고갈 및 SC에 대한 최대 허용 농도)을 제시합니다. 이러한 분석은 다양한 세포 생존 종점(대사 기능, 리소좀 막 무결성 및 세포막 무결성)에 의해 세포 독성을 정량화하기 때문에 이들의 조합은 제브라피쉬 세포주에서 화학적 세포 독성의 정확한 평가를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 pH를 7.4(생리학적 pH)로 유지하면서 배양 시스템을 적절하게 완충할 수 있는 배양 배지 구성으로 인해 CO2가 없는 조건에서 ZFL 및ZEM2S 세포주를 배양할 것을 권장합니다. 두 세포주 모두에 대해 이러한 프로토콜에서 제안된 배양 배지 조성 및CO2 무함유 환경은 문헌에 널리 보고되어 있다. ZFL 세포주는 일반적으로 중탄산나트륨을 첨가하거나...

화학 물질은 인체 건강 및 환경에 대한 안전성에 대해 테스트해야합니다. 분자 및 세포 바이오마커는 생체 내 부작용(예: 내분비 교란, 면역학적 반응, 급성 독성, 광독성)3,4,5,6,7 에 선행할 수 있기 때문에 규제 기관 및/또는 법률(예: REACH, OECD, US EPA)에 의해 살아있는 유기체에 대한 영향을 예측하기 위한 안전성 평가에서 점점 더 많이 고려되고 있습니다 . 이러한 맥락에서, 세포 독성은 어류 급성 독성을 예측하기위한 측정으로 취해졌다 5,8; 그러나 어류에 대한 가장 다양한 영향 (예 : 내분비 교란 효과)을 연구하기 위해 화학 물질의 아 세포 독성 농도를 정의하는 것과 같은 생태 독성 연구에서 많은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있습니다.
세포 배양 시스템 (시험관 내 시스템)에서 화학 물질의 세포 독성은 종점 유형이 다른 방법으로 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 세포독성 방법은 세포 사멸 과정 동안 관찰된 특정 형태와 관련된 종말점을 기반으로 할 수 있는 반면, 다른 방법은 세포 사멸, 생존력 및 기능, 형태, 에너지 대사, 세포 부착 및 증식의 측정에 의해 세포독성을 결정할 수 있습니다. 화학 물질은 다양한 메커니즘을 통해 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있으므로 화학적 효과를 예측하기 위해서는 다양한 세포 생존 종점을 포괄하는 세포 독성 평가가 필요하다9.
MTT 및 Alamar Blue(AB)는 세포 대사 활성에 따라 세포 생존율에 미치는 영향을 결정하는 분석법입니다. 상기 MTT 분석은 미토콘드리아 효소인 숙시네이트 탈수소효소10의 활성을 평가한다. 황색을 띤 3-[4,5-디메틸티아졸-2일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)가 포르마잔 블루로 환원되는 것은 생존 세포에서만 발생하며, 광학 밀도는 생존 세포 수에 정비례한다(10). AB 분석은 살아있는 세포에 의해 레사주린을 레소루핀으로 환원시킬 때 형광을 발하고 색을 변화시키는 미토콘드리아 효소에 의해 매개되는 민감한 산화-환원 지표입니다11; 그러나 세포질 및 마이크로솜 효소도 AB 및 MTT12의 감소에 기여합니다. 이러한 효소에는 알코올 및 알데히드 산화환원효소, NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소, 플라빈 환원효소, NADH 탈수소효소 및 시토크롬과 같은 여러 환원효소가 포함될 수 있다11.
중성 적색(NR) 분석은 이 염료를 생존 세포의 리소좀에 혼입시키는 것을 기초로 하는 세포 생존율 분석이다13. NR의 흡수는 pH 구배를 유지하는 세포의 능력에 달려 있습니다. 리소좀 내부의 양성자 구배는 세포질보다 낮은 pH를 유지합니다. 정상적인 생리학적 pH에서 NR은 세포막을 투과할 수 있는 약 0의 순 전하를 나타냅니다. 따라서 염료는 전하를 띠고 리소좀 내부에 유지됩니다. 결과적으로, 잔류 NR의 양이 많을수록, 생존 가능한 세포(14)의 수가 많아진다. 세포 표면이나 리소좀 막을 손상시키는 화학 물질은이 염료의 흡수를 손상시킵니다.
CFDA-AM 분석은 5-카르복시플루오레세인 디아세테이트 아세톡시메틸 에스테르(CFDA-AM)15의 보존을 기반으로 하는 형광 측정 세포 생존율 분석법입니다. 에스테라제 기질인 5-CFDA-AM은 살아있는 세포의 막에 의해 극성이고 불투과성인 형광 물질인 카르복시플루오레세인으로 전환됩니다15; 따라서 손상되지 않은 세포막의 안쪽에 유지되어 생존 가능한 세포를 나타냅니다.
최근에는 검증된 ISO(국제표준화기구) 가이드라인(ISO 21115:2019)16 및 OECD(경제협력개발기구) 시험법(OECD TG 249)에서 3가지 세포독성 분석법(CFDA-AM, NR, AB 분석법)을 결합하여 24웰 플레이트에서 RTgill-W1 세포주(무지개 송어[Oncorhynchus mykiss] 아가미의 영구 세포주)를 사용하여 어류 급성 독성을 평가했습니다17 . 어류의 급성 독성을 예측하는 기존의 세포 기반 방법이 있지만 다른 어종과 유사한 방법을 개발하고 방법의 처리량을 늘리기 위해 노력했습니다. 몇 가지 예로는 특정 독성 경로18,19에 대한 리포터 유전자로 형질감염된 ZFL 세포주의 개발, RTgill-W1 세포주에서의 광독성 테스트(20), ZFL 및 ZF4 세포주(1일 된 배아에서 유래한 제브라피쉬 섬유아세포)의 사용을 포함하여 여러 세포독성 분석에 의한 독성을 평가한다21.
Danio rerio (제브라 피쉬)는 수생 독성 연구에 사용되는 주요 어종 중 하나입니다. 따라서 어류 독성 테스트를 위해 제브라피쉬 세포주를 사용한 세포 기반 방법이 매우 유용할 수 있습니다. ZFL 세포주는 간 실질 세포의 주요 특징을 나타내며 생체 이물을 대사할 수 있는 제브라피쉬 상피 간세포 세포주입니다 7,22,23,24,25. 한편, ZEM2S 세포주는 어류26,27에 대한 발달 효과를 조사하는 데 사용할 수 있는 배아 배반포 단계에서 유래한 배아 제브라피쉬 섬유아세포 세포주입니다. 따라서 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주로 수행할 수정과 함께 4가지 세포독성 분석(MTT, AB, NR 및 CFDA-AM 분석)을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate, 96 well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>Surface: Standard, flat base</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Powder, high glucose, pyruvate</td></tr><tr><td>FBS - Fetal Bovine Serum, 적격, USDA 승인 지역</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 영양 혼합물, 파우더</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>파우더</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>파우더</td></tr><tr><td>중립 빨강&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>분말, BioReagent, 세포 배양</td></tr><tr><td>Orbital shaker에 적합&nbsp;</td><td>가장 따뜻한</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm 회전 직경</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) 칼슘과 마그네슘</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin 나트륨 염&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>분말, 생물 시약, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>분말</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>분말,&nbsp; 분자 생물학용 생물 시약</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide&nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>이 세포주는 Michael J. Carvan 교수(미국 밀워키 위스콘신 대학교)</td></tr><tr><td>ZFL 세포주</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr> 교수에 의해 기증되었습니다</tbody></table>.

zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

어류 세포주는 생태 독성 연구에 점점 더 많이 사용되고 있으며, 어류 급성 독성을 예측하는 방법으로 세포 독성 분석이 제안되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬(Danio rerio) 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주에서 세포 생존율을 평가하기 위해 수정된 세포독성 분석을 제시합니다. 평가된 세포독성 종점은 미토콘드리아 완전성(Alamar Blue[AB] 및 MTT 분석), 에스테라아제 활성을 통한 막 완전성(CFDA-AM 분석) 및 리소좀 막 완전성(Neutral Red[NR] 분석)입니다. 96-웰 플레이트에서 시험 물질을 노출시킨 후, 세포독성 분석이 수행되고; 여기서, AB 및 CFDA-AM은 동시에 수행되고, 동일한 플레이트에서 NR이 수행되고, MTT 분석은 별도의 플레이트에서 수행된다. 이러한 분석에 대한 판독값은 AB 및 CFDA-AM에 대한 형광과 MTT 및 NR에 대한 흡광도로 측정됩니다. 이러한 어류 세포주로 수행된 세포독성 분석은 어류에 대한 화학 물질의 급성 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 3은 AB, CFDA-AM, NR 및 MTT 분석의 플레이트를 보여줍니다. AB 분석(그림 3A)의 경우, 생존 세포가 없거나 감소된 블랭크 웰 및 웰은 청색과 낮은 형광을 나타내는 반면, 생존 세포 수가 많은 웰은 분홍빛을 띠고 생존 세포에 의해 레사주린(AB)이 레소루핀(분홍빛이 도는 물질)으로 변환되어 높은 형광 값을 나타냅니다. CFDA-AM 분석의 경우 플레이트의 웰 색상에 눈에 띄는 차이가 없습니다. 그러나 형광은 CFDA-AM의 보유 및 후속 카르복시플루오레세인(형광 물질)으로의 전환으로 인해 생존 가능한 세포를 포함하는 웰에서 더 높습니다.
NR 분석(그림 3B)의 경우, NR 염료를 보유할 세포가 없기 때문에 블랭크 웰은 매우 낮은 흡광도 값으로 투명해야 합니다. 일부 경우에, 블랭크 웰은 투명하지 ...

이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주의 세포독성 평가에 적합한 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(Alamar Blue[AB], CFDA-AM, Neutral Red 및 MTT 분석)을 제시합니다.

Zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

제브라피쉬 세포주를 사용한 세포독성 분석 프로토콜은 어류에 대한 화학 물질의 급성 독성에 관한 질문에 답하거나 다른 대체 어류 분석에 대한 적절한 테스트 농도를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 96웰 플레이트 분석의 주요 장점은 생태독성 연구에서 중요한 어종인 제브라피쉬 세포에 대한 세포독성을 결정하기 위해 서로 다른 생존력 종점을 결합한다는 것입니다. 프로토콜은 매우 간단합니다.설명 된 모든 단계를 올바르게 수행하면 문제가 발생하지 않습니다. 이 프로토콜은 배아 세포의 간세포와 같은 다른 기관 또는 생활 단계에서 파생된 어류 세포주에서 효과를 평가하는 동물 기반 생태 독성 연구를 달성하는 데 도움이 되지 않습니다. ZEM2S 또는 ZFL 세포 플레이팅을 시작하려면 분석을 위해 원하는 세포 수를 얻는 데 필요한 각 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.멸균 시약 저장소를 해당 세포주에 대한 완전한 배양 배지로 채우고 계산 된 세포 현탁액 부피를 총 부피 20 밀리리터의 저장소로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 거품이나 기포를 형성하지 않고 용액을 위아래로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 투명 폴리스티렌 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 추가하여 ZEM2S 세포의 경우 웰 당 60, 000 개의 세포, ZFL 세포의 경우 웰 당 40, 000 개의 세포.플레이트를 섭씨 28도에서 24시간 동안 배양합니다. 두 유형의 세포를 서로 다른 농도의 테스트 화학 물질에 노출시키려면 소 태아 혈청 또는 FBS가 없는 관심 세포주에 대한 배양 배지에서 원하는 농도의 테스트 화학 용액을 준비합니다. 24시간 배양 후, 다채널 마이크로피펫을 사용하여 웰로부터 소모된 배지를 조심스럽게 버린다.그런 다음 웰 당 100 마이크로 리터의 특정 테스트 화학 용액을 기술 삼중으로 추가하며, 이는 각 테스트 화학 물질 농도에 대해 3 개의 웰을 의미합니다. 대조군을 테스트 화학 물질과 동일한 플레이트에 기술 삼중으로 배치합니다. 블랭크 대조군의 경우, 100마이크로리터의 노출 매체를 3개의 무세포 웰에 추가합니다.음성 대조군의 경우, 100 마이크로리터의 노출 배지를 세포를 함유하는 3개의 웰에 첨가한다. 양성 대조군의 경우, 세포가 포함된 3개의 웰을 노출 배지에서 준비된 1%Triton X-100 용액에 노출시킵니다. 배양 배지 증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉하고 플레이트를 섭씨 28도에서 24시간 동안 배양합니다.시험 화학물질 노출 24시간 후, 내용물을 수집 트레이에 붓고 각 웰을 200 마이크로리터의 PBS로 세척하여 웰로부터 노출 매체를 조심스럽게 버린다. 그런 다음 세포를 잃지 않고 PBS를 제거하려면 조심스럽게 수집 트레이에 붓습니다. Alamar Blue 또는 AB 및 CFDA-AM 분석을 수행하기 위해 웰당 100 마이크로리터의 각 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 28도의 암실에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 형광 플레이트 판독기에서 텍스트에 언급된 적절한 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정합니다. 중성 적색 또는 NR 분석을 수행하려면 밀리리터당 40마이크로그램 농도의 NR 작업 용액을 취하고, 600G에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 내용물을 수집 트레이에 부어 이전에 추가한 AB 및 CFDA-AM 용액을 웰에서 조심스럽게 제거합니다.다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터의 NR 작업 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 28도에서 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 플레이트의 NR 용액을 수집 트레이에 조심스럽게 붓고 웰당 150마이크로리터의 PBS를 추가하여 웰을 세척합니다. 세척 후 웰 당 150 μliters의 NR 추출 용액을 첨가하고 플레이트 판독기를 사용하여 540 나노미터에서 흡광도를 측정하기 전에 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 플레이트를 배양합니다.MTT 분석을 수행하기 위해 24시간 테스트 화학 물질 노출 후 내용물을 수집 트레이에 붓고 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 노출 매체를 조심스럽게 제거하고 어둠 속에서 웰당 100마이크로리터의 MTT 작업 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 28도에서 어둠 속에서 4 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 내용물을 수집 트레이에 붓고 100 마이크로 리터의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 포르 마잔 결정을 추출하여 MTT 용액을 버립니다.플레이트 판독기를 사용하여 517 나노미터에서 흡수를 측정하기 전에 플레이트 셰이커에서 플레이트를 10분 동안 배양합니다. AP 분석의 경우, 블랭크, 양성 대조군 및 높은 세포 독성 농도의 테스트 화학 물질에 해당하는 웰은 생존 세포의 부재 또는 감소를 나타내는 청색 및 낮은 형광을 나타냈다. 대조적으로, 많은 수의 생존 세포를 함유하는 시험 화학물질 및 음성 대조군의 낮은 세포독성 농도에 상응하는 웰은 레사주린을 더 높은 형광을 갖는 분홍색 레조루핀으로 전환시켰다.NR 분석의 경우, 시험 화학물질 및 양성 대조군의 세포독성이 높은 농도는 투명하거나 옅은 분홍색이며 흡광도가 낮은 반면, NR 염료를 유지하는 생존 세포를 포함하는 웰은 짙은 분홍색과 높은 흡광도를 나타냈습니다. 유사하게, MTT 분석의 경우, 생존 세포가 없는 웰은 투명한 반면, 생존 세포가 포함된 웰은 MTT를 보라색 포르마잔으로 변환합니다. 계산된 세포 생존율 백분율에 기초하여, ZFL 및 ZEM2S 세포주의 상이한 시험 화학물질에 대해 절반 최대 억제제 농도 또는 IC50 값을 추정하였다.FBS가 있는 배양액과 FBS가 없는 배양액에서 세포 생존율의 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 24시간의 화학적 노출 기간 동안 FBS가 결핍된 배양 배지의 적합성을 나타냅니다. MTT 및 NR 분석은 세포 생존율에 0.1%에서 1%까지 다양한 DMSO 농도가 유의미한 영향을 미치지 않았으며, 이는 이러한 세포주가 최대 1%까지 DMSO를 용매로 사용할 수 있음을 나타냅니다전체 절차 동안 자체 분리를 피하기 위해 도금된 세포를 취급하는 동안 특별한 주의를 기울이고 염료 침전을 피하기 위해 중성 적색 작업 용액을 조심스럽게 준비하십시오. 이 절차는 시험관 내 모델을 사용하여 어류에 대한 화학적 영향의 여러 측면을 다루는 연구에 적용될 수 있으며 동물 기반 생태 독성 연구의 진행에 기여할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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환경

이 비디오는 생체 내 종양 형성을 평가하고 치료제의 효과를 연구하기 위한 제브라피시 이종 이식 분석에 대해 설명합니다.

제브라피시 이종이식 분석법: 제브라피시 In Vivo의 종양원성에 대한 치료제의 항암 효능을 평가하는 방법

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

이 프로토콜은 신장 독성 제로 cisplatin를 사용하여 성인 얼룩말 피시에 급성 신장 상해 (AKI)를 유도하는 절차를 설명합니다. 신장 조직에서 염증및 세포사멸을 분석하기 위한 기술과 2가지 기술의 재현성을 평가하는 단계, 각각 세포측정및 TUNEL을 상세히 설명했다.

성인 얼룩말 피시에 있는 Cisplatin에 의해 유도된 급성 신장 상해 모형

본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

제브라피시는 최근 잠재적인 방사선 조절제를 검증하기 위한 모델로 활용되고 있습니다. 본 프로토콜은 방사선 기반 스크리닝 실험에 제브라피시 배아를 사용하는 세부 단계와 다양한 처리 및 방사선의 효과를 평가하기 위한 몇 가지 관찰 접근 방식을 설명합니다.

잠재적인 방사능 감작제 또는 보호제를 평가하기 위한 모델로서의 제브라피시 유충

여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

이 프로토콜은 수정 후 3-7일 후에 제브라피시 유충에 대한 약물 스크리닝 절차와 형태학적 평가를 설명합니다.

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

학습하세요 ZEM2S 및 ZFL 세포주를 이용한 96웰 플레이트 세포독성 분석법으로 화학물질의 급성 독성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 동물 실험 없이 생태독성 연구를 수행하는 데 활용됩니다.

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