Name: 고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 고급 장애성 난소암 환자 유래 오가노이드 생성 및 배양 방법을. 종양 미세환경을 재현하여 신생물 표지자와 치료제 연구에 활용할 수 있는 이 모델은 기존 암세포주의 한계를 극복합니다.

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이 프로토콜을 수립하는 데 있어 Ron Bose, MD, PhD의 지도와 Barbara Blachut, MD의 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 세인트루이스 산부인과 및 부인과 종양학과에 있는 워싱턴 대학교 의과대학, 워싱턴 대학교 학장 장학생 프로그램 및 생식 과학자 개발 프로그램에 감사드립니다.

연구를 위해 수집된 모든 인체 조직 표본은 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 아래에 요약된 프로토콜은 멸균 인체 조직 배양 환경에서 수행되었습니다. 정보에 입각한 서면 동의는 인간 피험자로부터 얻었습니다. 적격 환자는 난소암 진단 또는 추정 진단을 받았고, 정보에 입각한 동의서에 서명할 의지와 능력이 있어야 하며, 18세 이상이어야 했습니다. 종양 조직(악성 원발성 종양 또는 전이 부위), 복수 및 흉막액은 시술 당시 동의한 환자로부터 얻었습니다. 이 표본은 즉시 실험실로 운반되어 아래에 설명된 방법을 사용하여 오가노이드 생성을 위해 처리되었습니다.
1. 매체 준비
<ol><li>완벽한 오가노이드 배지 준비<ol><li>이전에 발표된 보고서7에 따라 R-spondin 1/Noggin 조절 배지를 준비합니다. 참고: R-spondin-1/Noggin 조절 배지는 상업적으로 이용 가능한 재조합 단백질에 대한 보다 저렴한 대안입니다. 렌티바이러스 매개 형질도입을 통해 R-스폰딘-1 및 노긴을 안정적으로 분비하는 HEK293T 세포는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교 의과대학의 Ron Bose와 뉴욕-장로교/컬럼비아 대학교 어빙 메디컬 센터 8,9,10의 Anil Rustgi로부터 관대한 선물이었습니다. 상업적으로 조절된 매체는 대체물로 사용될 수 있습니다(재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>완전한 오가노이드 배지를 만들려면 10% R-스폰딘 1/노긴 조절 배지, 50ng/mL EGF, 10ng/mL FGF-10, 10ng/mL FGF2, 1x B27, 10mmol/L 니코틴아미드, 1.25mmol/L N-아세틸시스테인, 1μmol/L 프로스타글란딘 E2, 10μmol/L SB202190, 500nmol/L A83-01 및 10μM ROCK 억제제를 결합합니다(재료 표 참조). 알림: 배지는 최대 4개월 동안 3°C에서 보관할 수 있습니다. 이 배지는 Hill et al.11에서 채택되었습니다. 배지의 농도와 성분은 ROCK 억제제가 첨가되어 동일합니다.</li>
	<li>500mL의 DMEM/F12의 고급 제형을 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1x 디펩타이드, L-알라닐-L-글루타민 및 1x HEPES(10mM)와 결합하여 오가노이드 염기 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>2. 복수 및 흉막액에서 오가노이드 채취
참고: 복수와 흉막액은 오가노이드의 최상의 수율을 위해 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 내용물이 액화될 때까지 얼음 위에 놓아 이전에 분주된 BME, DNase I 및 DNase I 반응 완충액( 재료 표 참조)을 해동합니다.
<ol><li>표준 치료 수술 또는 시술 시 동의한 환자로부터 복수 및 흉수를 채취하여 실온에서 여행 용기에 담아 실험실로 운송합니다. 참고: 모든 복수 또는 흉수 처리는 무균 환경에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>50mL의 복수 또는 흉막을 50mL의 원추형 튜브로 옮깁니다(튜브 수는 얻은 복수의 부피에 따라 다름). 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 원심분리 후 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>이전에 원심분리된 펠릿에 복수 또는 흉막액 50mL를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 에서 다시 원심분리하여 계속합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다. 모든 복수 또는 흉막액이 처리될 때까지 이 단계를 반복합니다.</li>
	<li>1,000 μL의 뉴클레아제가 없는 물, 100 μL의 DNase I 반응 완충액 및 10 μL의 DNase I을 조합하여 100 μg/mL DNase I 용액을 준비합니다. 참고: 적용된 DNase I 처리는 일부 환자 샘플에서 세포 응집체의 존재 여부와 관계없이 단일 세포 현탁액을 만들기에 충분하다(12).</li>
	<li>각 세포 펠릿을 100μg/mL DNase I 용액 1mL에 재현탁합니다. DNase I 용액을 부드럽게 적가하고 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 알림: 최소 1mL의 DNase I 용액을 추가합니다. 1mL가 펠릿을 방해하기에 충분하지 않은 경우 1mL를 더 추가합니다.</li>
	<li>배양 후 25mL의 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 세포에 넣고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 이어서, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.</li>
	<li>새로 형성된 세포 펠릿을 미리 예열된 5mL의 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액에 재현탁합니다( 재료 표 참조). 와류를 458 x g로 설정하고 각 원뿔형 튜브의 용액을 소용돌이합니다. 용액이 균질해지면 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 원뿔형 튜브의 내용물을 단일 50mL 원뿔형 튜브로 결합합니다.</li>
	<li>와동된 용액이 들어 있는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 알림: 펠릿을 검사합니다. 분홍색/빨간색 펠릿은 적혈구의 존재를 나타내며, 펠릿이 더 이상 빨간색이 아닐 때까지 RBC 용해 완충 단계를 반복해야 합니다.</li>
	<li>원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 이어서, 펠릿을 10 mL의 PBS로 세척하고, 용액을 458 x g에서 와동시키고, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g에서 원심분리한다.</li>
	<li>큰 세포 펠릿이 형성되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1mL(단계 1.3)를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이치고, 300-400 μL를 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 마이크로 원심분리기 튜브를 1,650 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 참고: 미세 원심분리기 튜브에 넣지 않은 세포 펠릿 부분은 향후 사용을 위해 동결할 수 있습니다(FBS에서 500% DMSO 1mL에 세포 10μL). 냉동 세포 펠릿은 -80°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 액체 질소에 넣으면 몇 년 동안 보관할 수 있습니다13.</li>
	<li>유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드 기본 배지(단계 1.3)를 조심스럽게 흡인하고 콜드 팁을 사용하여 BME( 재료 표 참조)에 재현탁합니다. 알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 75% BME로 재현탁된 세포와 함께 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>재현탁된 세포 용액의 분취액 40 μL를 6-웰 플레이트 상에 플레이트한다. 웰당 최대 5개의 분취량을 플레이트합니다(그림 1).</li>
	<li>즉시 플레이트를 37°C 인큐베이터에 20분 동안 두어 BME가 응고되도록 합니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.</li>
</ol><img alt="DNA 분석 준비를 위해 PCR 워크스테이션에서 피펫을 사용한 실험실 실험." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 환자 유래 난소암 오가노이드의 도금. 오가노이드 도금의 대표 이미지. 오가노이드 혼합물의 분취량은 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 도금됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 조직에서 오가노이드 채취
참고: 오가노이드의 최상의 수율을 위해 조직을 가능한 한 빨리 처리해야 합니다.
<ol><li>PBS가 들어 있는 여행 용기에 얼음 위에서 종양을 수집하고 운반합니다.</li>
	<li>샘플을 10cm 조직 배양 접시에 놓습니다(그림 2). 일회용 메스를 사용하여 티슈를 다듬습니다. 다음으로, 일회용 주사기의 둔한 끝을 사용하여 균질 한 혼합물이 생성 될 때까지 조직을 분쇄합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 균질 조직 혼합물을 해리 튜브에 넣습니다. 균질화된 조직 1-2mL마다 오가노이드 기본 배지(1.3단계)에 1mg/mL 유형 II 콜라게나제 용액( 재료 표 참조) 7-8mL와 DNase I 용액 1mL를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이칩니다. 참고: 조직의 양에 따라 콜라게나제 용액의 양과 필요한 튜브 수가 결정됩니다.</li>
	<li>해리 기계( 재료 표 참조)를 사용하여 콜라게나제 용액에 있는 동안 조직을 액화합니다. 단일 세포 현탁액이 될 때까지 프로그램 37C_h_TDK3(1시간)를 실행합니다. 알림: 결과 혼합물이 균질하지 않은 경우(즉, 조직 조각이 혼합물에 여전히 존재하는 경우) 프로그램을 다시 실행해야 합니다. 조직이 소화되었지만 용액이 점성이 있는 경우 오가노이드 기본 배지를 사용하여 희석합니다(단계 1.3).</li>
	<li>균질화된 혼합물을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 20-40mL의 오가노이드 기본 배지를 추가합니다(단계 1.3). 그런 다음 100μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로 라벨이 붙은 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다.</li>
	<li>여과된 혼합물을 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>1,000 μL의 뉴클레아제가 없는 물, 100 μL의 DNase I 반응 완충액 및 10 μL의 DNase I을 조합하여 100 μg/mL DNase I 용액을 준비합니다. 참고: 적용된 DNase I 처리는 일부 환자 샘플에서 세포 응집체의 존재 여부와 관계없이 단일 세포 현탁액을 만들기에 충분하다(12).</li>
	<li>100ug/mL DNase I 용액 1mL에 세포를 재현탁합니다. DNase I 용액을 부드럽게 적가하고 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 25mL의 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 세포에 넣고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 이어서, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.</li>
	<li>새로 형성된 세포 펠릿을 미리 예열된 5x RBC 용해 완충액의 1mL에 재현탁합니다. 각 원뿔형 튜브의 용액을 458 x g로 소용돌이칩니다.</li>
	<li>세포 펠렛이 들어 있는 원뿔형 튜브를 RBC 용해 완충액에 재현탁하여 5분 동안 배양한다. 배양이 완료되면 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 알림: 펠릿을 검사합니다. 분홍색/빨간색 펠릿은 적혈구의 존재를 나타내며, 이는 펠릿이 흰색으로 나타날 때까지 RBC 용해 완충 단계를 반복해야 합니다.</li>
	<li>원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 이어서, 펠릿을 10 mL의 PBS로 세척하고, 용액을 458 x g에서 와동시키고, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g에서 원심분리한다.</li>
	<li>큰 세포 펠릿이 형성되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1mL(단계 1.3)를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이치고, 300-400 μL를 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 참고: 미세 원심분리기 튜브에 넣지 않은 세포 펠릿 부분은 향후 사용을 위해 동결할 수 있습니다(FBS에서 500% DMSO 1mL에 세포 10μL)(5.1단계). 냉동 세포 펠릿은 -80°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 액체 질소에 넣으면 몇 년 동안 보관할 수 있습니다13.</li>
	<li>유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드 베이스 배지를 조심스럽게 흡인하고 콜드 팁을 사용하여 BME에서 재현탁합니다. 알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 75% BME에 재현탁된 세포와 함께 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>재현탁된 세포 용액을 40μL 분취액의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.</li>
	<li>즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.</li>
</ol><img alt="실험실 설정에서 성장 배지, 용기 및 조직 샘플을 사용한 세포 배양 공정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 해부 전의 종양 조직. 오가노이드 생성을 위해 얻은 종양 조직의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 오가노이드의 패시징
참고: 샘플이 합류하는 경우 각 오가노이드 웰을 매주 두 개의 새 웰로 통과시킬 수 있습니다.
<ol><li>1mL 피펫을 사용하여 1mL의 오가노이드 기본 배지(단계 1.3)를 각 웰에 추가하고 배지를 오가노이드 탭에 직접 위아래로 피펫팅하여 해리합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 재현탁된 펠릿이 들어 있는 모든 배지를 수집합니다.</li>
	<li>혼합물이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브를 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>동물 유래가 없는 재조합 효소 1mL( 재료 표 참조)를 세포 펠릿에 넣고 용액을 458 x g에서 소용돌이치고 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 37°C 수조에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>BME에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% BME에 재현탁된 세포와 함께 1.3% 오가노이드 기본 배지(75단계)를 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>재현탁된 세포 용액을 40 μL 분취액의 6-웰 플레이트에 플레이트한다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다. 모든 분취액이 도말되면 즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.</li>
</ol>5. 오가노이드의 동결 및 해동
<ol><li>오가노이드의 동결<ol><li>4.1-4.4단계부터 시작합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 0.5-1 mL의 회수 세포 배양 동결 배지( 재료 표 참조)에 재현탁하고 1mL를 각 극저온 저온 배지로 옮깁니다.</li>
		<li>그런 다음 -80°C의 이소프로판올로 채워진 용기에 극저온 혼합물을 최대 2주 동안 넣은 후 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다13.</li>
	</ol></li>
	<li>오가노이드의 해동<ol><li>액체 질소 탱크로부터 샘플을 제거하고, 37°C 수조에서 해동한다.</li>
		<li>해동되면 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.</li>
		<li>BME에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% BME에 재현탁된 세포와 함께 1.3% 오가노이드 기본 배지(75단계)를 추가하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>재현탁된 세포 용액을 40μL 분취액의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 배치하십시오.</li>
		<li>즉시 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 웰에 부드럽게 추가합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 오가노이드 조성을 평가하기 위한 FFPE(formalin-fixed paraffin-embeded) 슬라이드 내장 및 생성
<ol><li>적절한 크기를 보장하기 위해 최소 10일 동안 오가노이드를 배양한 후 웰에서 완전한 오가노이드 배지를 제거하고 2% 파라포름알데히드 고정제(PFA) 1mL를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후, 배양된 오가노이드 분취액을 PBS 1 mL로 매번 5분 동안 3x 세척하였다.</li>
	<li>각 웰로부터 PBS를 제거하고, 탈이온화된H2O중의 따뜻한 2% 한천 1 mL를 각 웰에 첨가하였다. 한천을 첨가할 때, 배양된 오가노이드 분취액을 주걱을 사용하여 플레이트로부터 들어 올린다. 참고: 배양된 오가노이드 분취량을 들어 올리기 전에 한천이 굳지 않도록 하는 것이 중요합니다.<ol><li>한천이 실온에서 우물에서 굳어지도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>작은 주걱을 사용하여, 응고된 한천을 웰로부터 분리하고, 프로세싱할 때까지 70% 에탄올 중에서 4°C에서 최대 48시간 동안 카세트에 저장한다(재료 표 참조).</li>
	<li>샘플을 파라핀 15에 매립시키고, 슬라이드를 5 μm의 두께로 절단하고, 표준 프로토콜15를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&amp;E, 재료 표 참조) 염색으로 슬라이드를 염색하였다.</li>
</ol>

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<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
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난소암은 진단 시 진행 단계와 화학 요법 내성의 일반적인 발달로 인해 매우 치명적입니다. 난소암 연구의 많은 발전은 암 세포주와 PDX 모델을 활용하여 이루어졌습니다. 그러나 보다 대표적이고 저렴한 시험관 내 모델에 대한 분명한 필요성이 있습니다. PDO는 원발성 종양의 종양 이질성, 종양 미세환경, 게놈 및 전사체적 특징을 정확하게 나타내는 것으로 입증되었으며, 따라서 약물 요법에서 오가노이드 모델의 구현과 같은 다양한 연구 접근법을 위한 이상적인 전임상 모델이다16.
여기에 설명된 프로토콜은 97%의 성공률로 알 수 있듯이 매우 효과적이고 신뢰할 수 있습니다. 현재 프로토콜에는 세심한 주의를 기울여야 하는 중요한 단계가 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 첫째, 조직에서 오가노이드를 채취할 때 샘플이 완전히 균질화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 해리 프로그램을 두 번 이상 실행해야 할 수 있습니다. 샘플...

2021년에 미국에서 약 21,410명의 여성이 상피성 난소암 진단을 받았고 12,940명의 여성이 이 질병으로 사망했습니다1. 수술과 화학요법이 충분히 발전했음에도 불구하고, 진행성 질환 환자의 70% 이상이 화학요법 내성이 나타나 진단 후 5년 이내에 사망한다 2,3. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 전략과 전임상 연구를 위한 대표적이고 신뢰할 수 있는 모델이 시급히 필요합니다.
원발성 난소 종양에서 생성된 암 세포주와 환자 유래 이종이식(PDX)은 난소암 연구에 사용되는 주요 도구입니다. 암 세포주의 주요 장점은 빠른 확장입니다. 그러나 이들의 지속적인 배양은 암 세포주가 원래의 원발성 암 종양 샘플에서 벗어나게 하는 표현형 및 유전형 변화를 초래합니다. 암 세포주와 원발성 종양 사이의 기존 차이로 인해, 세포주에서 긍정적인 영향을 미치는 약물 분석은 임상 시험에서 동일한 효과를 나타내지 못한다2. 이러한 한계를 극복하기 위해 PDX 모델이 사용됩니다. 이 모델은 신선한 난소암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 만들어집니다. 생체 내 모델이기 때문에 인간의 생물학적 특성과 더 정확하게 유사하고 약물 결과를 더 잘 예측할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델에는 생성에 필요한 비용, 시간 및 자원을 포함하여 상당한 제한이 있습니다4.
PDO는 암 세포주와 PDX 모델 모두의 한계를 극복하는 전임상 연구를 위한 대안 모델을 제공합니다. PDO는 환자의 종양 및 종양 미세 환경을 요약하여 전임상 연구에 이상적인 시험관 내 다루기 쉬운 모델을 제공합니다 2,3,5. 이러한 3D 모델에는 원발성 종양을 모델링하는 자기 조직화 기능이 있으며, 이는 2차원(2D) 세포주에는 없는 기능입니다. 또한, 이러한 모델은 유전적으로 및 기능적으로 모 종양을 나타내는 것으로 나타났으며, 따라서 새로운 치료법 및 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 요컨대, 이들은 세포주와 유사한 장기 확장 및 저장 기능을 제공할 뿐만 아니라 마우스 모델 4,6에 내재된 미세 환경 및 세포-세포 상호 작용도 포함합니다.
본 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 유래 종양, 복수 및 흉막액 샘플로부터 PDO의 생성을 설명합니다. 그런 다음 PDO 배양을 여러 세대에 걸쳐 확장하여 약물 요법 감수성 및 예측 바이오마커를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 PDO의 치료 반응에 기초하여 치료를 개인화하는 데 사용될 수 있는 기술을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>1% HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1% 페니실린-스트렙토마이신</td><td>Fisher Scientific</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tubes&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>14125</td><td></td></tr><tr><td>10cm 조직 배양 접시&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>MidSci</td><td>100ICS</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 분리기 관</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 극저온</td><td>Simport Scientific</td><td>T301-2</td><td></td></tr><tr><td>2% 파라포름알데히드 고정액</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조&nbsp;</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>3dGRO R-Spondin-1 컨디셔닝 미디어 보충제</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCM104</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R31541GA</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Lamda Biotech</td><td>C121</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컬트렉스 타입 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-010-02</td><td>기저막 추출물</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 반응 버퍼</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>히터가 있는 gentleMACS Octo Dissociator</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-427</td><td>우리는 제조업체 프로토콜을 사용합니다.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>디펩타이드, L-알라닐-L-글루타민</td></tr><tr><td>헤마톡실린 및 에오신 염색 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1470670</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast 파라핀 왁스</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 컨테이너</td><td>Fisher Scientific</td><td>07202363S</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 피펫 팁 포함&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫(팁 포함)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 9"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2</td><td>R& D 시스템</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>회수 세포 배양 냉동 매체</td><td>Invitrogen</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y-27632)</td><td>R& D 시스템</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 임베딩 카세트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>동물 유래 성분 무함유, 재조합 효소</td></tr><tr><td>유형 II 콜라겐분해효소 Life</td><td>Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

오가노이드는 환자 유래 난소 종양 조직, 복수 또는 흉수에서 성공적으로 성장할 수 있는 3D 동적 종양 모델이며 난소암에 대한 새로운 치료법 및 예측 바이오마커의 발견을 돕습니다. 이 모델은 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 요약합니다. 또한, 그들은 형태학적으로, 세포학적으로, 면역조직화학적으로, 유전적으로 원발성 종양과 일치하는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드는 종양 세포 및 종양 미세 환경에 대한 연구를 용이하게 하며 세포주보다 우수합니다. 현재 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 종양, 복수 및 흉막액 샘플에서 환자 유래 난소암 오가노이드를 생성하는 고유한 방법을 설명합니다. 환자 샘플은 기계적 및 효소 분해에 의해 세포 현탁액으로 분리됩니다. 그런 다음 기저막 추출물(BME)을 사용하여 세포를 도말하고 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 배양에 특이적인 보충제를 포함하는 최적화된 성장 배지로 지지합니다. 초기 오가노이드를 형성한 후 PDO는 후속 실험을 위한 확장을 위한 계대배양을 포함하여 장기간 배양을 지속할 수 있습니다.

PDO를 생성하기 위해, 샘플을 기계적 및 효소적으로 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 BME에 재현탁하고 특별히 조작된 배지로 보충했습니다(그림 3). 오가노이드는 일반적으로 10일의 기간 동안 확립되며, 그 후 배양에서 개별 오가노이드를 입증합니다(그림 4).
<img alt="종양-오가노이드 과정 다이어그램; 기계적 소화; 단일 세포 배양; 종양 연구; BME 임베딩." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 오가노이드로 형성된...

환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

환자 드라이브 오가노이드 모델은 유전적 및 기능적으로 모 종양을 나타내므로 난소암에서 새로운 치료법 및 복잡한 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 클론 이질성, 종양 미세 환경 및 시험관 내 세포 대 세포 상호 작용을 요약함으로써 이러한 모델은 암 세포주 및 환자 유래 이종 이식편의 한계를 극복합니다. 환자 유래 오가노이드는 장기 확장 및 저장 기능을 제공하고 종양 생리학을 모방합니다.결과적으로 새로운 치료법 및 예측 바이오마커 연구에 이상적인 모델입니다. 종양 샘플을 10cm 조직 배양 접시에 넣고 조직을 다져서 일회용 메스를 사용하여 균질한 혼합물을 만들어 오가노이드 수확을 시작합니다. 집게를 사용하여 균질 조직 혼합물을 해리 튜브에 넣습니다.균질화된 조직 1 내지 2밀리리터마다 오가노이드 염기 배지에 밀리리터당 1밀리그램의 2형 콜라게나제 용액 7 내지 8밀리리터와 DNase 1 용액 1밀리리터를 첨가한다. 458 G.Lique에 있는 458 G.Liquidy에 있는 해결책에 소용돌이 모양 조직은 해리 기계를 사용하여 collagenase 해결책에 있는 동안 합니다. 37C 밑줄, H 밑줄, TDK 3이 단일 세포 현탁액이 될 때까지 1시간 동안 프로그램을 실행한다.완료되면 균질화된 혼합물을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 20 내지 40 밀리리터의 오가노이드 베이스 배지를 첨가하고 458 G에서 용액을 와동시킨 다음 100 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로 라벨이 붙은 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과한다. 다음으로, 여과된 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 650 G에서 원심분리하고, 유리 목초지 피펫을 이용하여 상층액을 흡인한다.밀리리터당 100마이크로그램의 Dnase One을 준비하고 드롭 와이즈 DNase One 용액을 추가하여 1밀리리터의 Dnase One 용액에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후 25밀리리터의 오가노이드 염기 배지를 세포에 첨가하고 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 4도에서 5 분 동안 1, 650 G에서 원심 분리하고 유리 목초지 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.새로 형성된 세포 펠릿을 5밀리리터의 미리 데워진 적혈구 또는 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 각 원뿔형 튜브의 용액을 458G에서 소용돌이 치고 5 분 동안 배양합니다. 다시, 펠릿을 RBC 용해 완충액에 현탁하여 원

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

본 프로토콜은 환자 유래 난소암 오가노이드에서 DNA 손상 복구 단백질을 평가하는 방법을 설명합니다. 여기에는 포괄적인 도금 및 염색 방법과 상세하고 객관적인 정량 절차가 포함됩니다.

면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

전임상 약물 검사를 위한 난소암 환자 유래 오가노이드 모델

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

이 프로토콜은 다양한 질병 단계의 난소암 오가노이드 확립을 위한 체계적인 프레임워크를 제공하고 환자별 변동성 문제를 해결하여 수율을 높이고 후속 응용 분야에서 강력한 장기 확장을 가능하게 합니다. 여기에는 조직 처리, 파종, 배지 요구 사항 조정 및 면역형광 염색을 위한 자세한 단계가 포함됩니다.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

이 프로토콜은 일차 인간 난소 표면 상피(hOSE) 세포에서 3차원(3D) 조직 오가노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 갓 채취한 난소에서 hOSE 분리, hOSE의 세포 확장, 동결 보존-해동 절차 및 오가노이드 유도가 포함됩니다. 면역형광(Immunofluorescence), 정량 분석(quantitative analysis) 및 스크리닝 플랫폼으로서의 유용성 입증(showcasing utility as a screening platform)이 포함되어 있습니다.

조직 재생을 연구하기 위한 플랫폼으로서의 인간 난소 표면 상피 오가노이드

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내에서 고급 장액성 난소 암종(HGSOC) 마우스 모델의 개발을 자세히 설명합니다. 쥐 나팔관 오가노이드의 파생, 인간 HGSOC 유전학을 요약하기 위한 유전자 변형, 종양의 생체 내 발달을 위한 동계 마우스의 난소 활액낭에 도입.

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있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의...

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

배우세요 고급 장애성 난소암 환자 유래 오가노이드 생성 및 배양 방법을. 종양 미세환경을 재현하여 신생물 표지자와 치료제 연구에 활용할 수 있는 이 모델은 기존 암세포주의 한계를 극복합니다.

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

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