면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

DNA 손상 반응에 대한 연구는 새로운 표적 치료에서 난소암 잠재적 바이오마커의 병태생리학을 이해하는 데 필요합니다. 이 기술은 샘플이 손상되지 않은 상태를 유지하고 작용 위치에서 항원을 검사할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 빠르며 면역 형광에 적합한 모든 항원에 적용 할 수 있습니다.

이 방법은 화학요법 및 PARP 억제제 내성과 관련된 난소암 및 DNA 손상 복구 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 방법은 3D 배양 및 오가노이드 사용과 관련된 다른 연구 분야에 적용할 수 있습니다. 먼저, 3D 매트릭스를 방해하지 않고 조사되고 배양된 오가노이드에서 배지를 흡인합니다.

그런 다음 300 마이크로 리터의 PBS로 씻으십시오. 오가노이드를 300마이크로리터의 2% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정합니다. 고정 후 오가노이드를 300마이크로리터의 염색 완충액으로 세척하고 5분 동안 진탕기에 올려 놓는다.

그런 다음 300 마이크로리터의 투과화 완충액을 부드럽게 첨가하여 오가노이드를 투과화합니다. 20분 배양 후, 완충액을 제거하고 300 마이크로리터의 염색 완충액으로 세척한다. 오가노이드를 셰이커에 5분 동안 올려 놓습니다.

다음으로, 300 마이크로리터의 염색 완충액을 첨가하여 투과화 단계를 차단한다. 30분 동안 진탕기에 놓고 피펫을 사용하여 염색 완충액을 흡인합니다. 그런 다음 염색 완충액에 희석된 1차 항체 300마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 4도에서 16 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 1차 항체 용액을 제거한다. 쉐이커에서 각각 5분 동안 300마이크로리터의 염색 완충액으로 3회 세척을 수행합니다.

염색 완충액에 희석된 300 마이크로리터의 2차 항체 용액을 첨가하고, 암실에서 1시간 동안 배양한다. 1시간 후, 2차 항체 용액을 흡인하고 300마이크로리터의 희석된 DAPI를 첨가한다. 셰이커에 5 분 동안 놓습니다.

쉐이커에서 각각 5분 동안 300마이크로리터의 염색 완충액으로 3회 세척을 수행합니다. 염색 버퍼를 제거하고 챔버 슬라이드에 포함된 제거 키트를 사용하여 챔버를 분리합니다. P200 피펫 팁의 끝 부분을 잘라서 오가노이드 탭이 들어 있는 각 웰을 덮을 장착 매체를 추가하는 데 사용합니다.

기포를 피하면서 시편 위에 커버 슬립을 놓습니다. 투명한 매니큐어를 바르고 커버 유리의 측면에 페인트를 칠하여 슬라이드를 밀봉합니다. 1시간 동안 굳힌 후 섭씨 20도에 둡니다.

이멀젼 오일이 포함된 63X 대물렌즈를 사용하는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하여 방사선 조사 전후의 DNA 손상 복구 단백질에 대해 환자 유래 난소암 오가노이드를 염색하고 DNA 손상 마커인 감마 H2AX 및 상동 재조합 복구 마커인 RAD51과 같은 바이오마커에 대해 평가했습니다. 복제 스트레스의 마커인 RPA, 비상동 결합 마커인 53BP1 및 GS2 단계 세포 주기 마커인 Geminin도 이 기술을 사용하여 평가되었습니다.

BME 탭은 해중합되는 경향이 있으므로 고정 및 흡입 후 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 오가노이드 손상과 DNA 손상 반응을 탑재하는 능력을 결정하기 위해 항원을 분석하면 화학 요법 내성 평가에 도움이 될 수 있습니다.