Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

이 프로토콜은 조직 샘플 또는 매우 작은 혈관 조각에서 내피 세포를 분리하는 것과 관련이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 모든 연구 실험실에서 재현 할 수 있으며 매우 작은 샘플에서도 우수한 순도의 내피 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 염화칼슘 및 염화마그네슘 또는 PBS 마이너스 마이너스 없이 PBS가 들어있는 50 밀리리터 튜브에서 수집된 샘플을 세척하여 폐 실질 샘플 준비를 시작합니다.

샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 수술 용 가위를 사용하여 약 3-4 밀리미터의 작은 조각으로 수동으로 자릅니다. 동맥 부분의 경우, 수집 된 샘플을 PBS 마이너스 마이너스가 들어있는 50 밀리리터 튜브에서 세척하고, 자르지 않고 멸균 된 페트리 접시에 옮긴다. 잔류 혈액의 큰 부분을 제거하려면 PBS에서 빼기를 뺀 두 번 깍둑 썰기 한 폐 실질 또는 폐동맥 분절에 두 번 세척하십시오.

다음으로, 샘플을 15 밀리리터 튜브에 넣고 5 밀리리터의 유형 II 콜라게나아제와 함께 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 10 분 동안 배양합니다. 큰 조각을 제거하려면 50밀리리터 수집 튜브 상단에 멸균된 1mm 메쉬 크기의 여과기를 놓고 15밀리리터 튜브의 전체 내용물을 여과기에 붓습니다. 다음으로, 수집 튜브가 채워질 때까지 PBS 마이너스 마이너스로 샘플을 헹구기 전에 주걱으로 소화된 조직을 부드럽게 마사지합니다.

비혈관 내피 세포를 제거하려면 70마이크로미터 메쉬 크기의 세포 스트레이너를 사용하여 새로운 50밀리리터 튜브에서 소화된 세포에서 수집된 유출을 여과합니다. 그런 다음 40마이크로미터 메쉬 크기의 셀 스트레이너를 사용하여 튜브 1로 표시된 새로운 50밀리리터 튜브에 유출물을 수집합니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 30G에서 원심분리하여 세포 클러스터를 침전시킵니다.

멸균 피펫을 사용하여 상층액을 Tube 2로 표시된 새로운 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브 1에 펠릿을 매달고 PBS 마이너스 마이너스로 튜브를 최대 50 밀리리터까지 채 웁니다. 마찬가지로 튜브 2를 PBS 마이너스 마이너스로 최대 50 밀리리터까지 채 웁니다.

완료되면 샘플을 300G에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 2 밀리리터의 성장 배지로 펠릿을 현탁시키고 사전 코딩 된 6 웰 플레이트의 두 개의 개별 웰에 현탁액을 시드합니다. 평활근 세포 또는 SMC 및 섬유아세포를 포함하는 처리된 세포 응집체의 일부가 장섬유에 결합되어 있는 것이 관찰되었다.

또한, SMC는 비-혈액 세포 단일체의 대부분을 차지하였다. 직경이 10 내지 20 마이크로미터를 초과하지 않는 세포의 작고 조밀한 클러스터는 기질 조직의 단편에 기인하는 요소가 없었다. 약 70%의 순수 인간 폐 미세혈관 내피 세포 또는 HLMVEC, 단일 세포가 얻어졌습니다.

순수한 HLMVEC 제제를 얻는 동안, 분류 된 세포는 특징적인 내피와 같은 모양을 취했다. 초점 현미경 검사에서 지방의 정제된 세포의 거의 100%가 내피 세포 항원, 즉 CD31 및 보다 구체적인 폰 빌레브란트 인자에 대해 양성으로 염색된 것으로 나타났습니다. 이 세포들이 매트리겔에 안착되었을 때, 그들은 관형 구조와 HUVEC를 생성하여 내피 표현형을 확인했습니다.

효소 소화 중 잠복 시간이 짧기 때문에 콜라게나제를 예열하는 것이 중요합니다. 그리고 또 다른 요점은 세포 클러스터가 침전되는 동안 팔레트의 세포 응집체를 건드리지 않고 상청액을 부드럽게 제거하는 것이 중요하다는 것입니다. 이 절차는 원심분리 및 여과의 사용을 기반으로 하며, 따라서 크기 및 클러스터링과 같은 특성에 기초하여 다른 세포 유형을 분리하는 것을 알 수 있는 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.