Name: Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: 배우세요 폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포를 분리하고 정제하는 방법을. 콜라게나아제 소화와 원심분리를 통해 약 70% 순도의 HLMVEC를 얻어 폐 염증 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 이탈리아 대학 연구부(ex 60% 2021 및 2022)에서 RP에 대한 자금과 이탈리아 낭포성 섬유증 재단(FFC#23/2014) 및 이탈리아 보건부(L548/93)에서 MR에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 승인되었으며 프로토콜은 키에티-페스카라 대학교(#237_2018bis)의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따랐습니다. 그림 1은 기흉 또는 폐엽 절제술과 같은 다양한 이유로 흉부 수술을 받는 비식별화된 인간 피험자(서면 동의 하에)로부터 폐 실질 또는 폐동맥의 세그먼트(1-3cm 길이)에서 내피 세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 이 후자의 경우 외과의는 폐동맥 부분도 수집했습니다. 특히, 외과의는 암이 없는 샘플을 수집하도록 정확하게 지시받았습니다. 제시된 프로토콜은 가능한 최고의 수율과 순도를 얻기 위해 최적화되었습니다.
1. 실험 준비
<ol><li>콜라게나제 재구성<ol><li>콜라게나제 분말을 CaCl 2 및 MgCl2(PBS--, 재료 표 참조)가 없는 인산염 완충 식염수에 2mg/mL 농도로 용해하고 0.22μm 공극 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.</li>
		<li>5mL 분취량을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용하기 전에 분취량을 해동하고 37°C로 예열합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트 코팅<ol><li>플레이트 코팅의 경우 1.5% 젤라틴 용액 또는 50μg/mL 피브로넥틴( 재료 표 참조)을 배양 플레이트(500μL는 6웰 플레이트의 각 웰 표면을 덮기에 충분함)에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후, 과량의 젤라틴을 제거하고, PBS로 웰을 세척한다. PBS를 흡인하고 멸균 후드에서 플레이트를 건조시킵니다. 참고: 젤라틴 재구성을 위해 분말을 물에 용해시켜 1.5% 용액을 만든 다음 오토클레이브하고 4°C에서 보관합니다. 1.5 %의 젤라틴은 4 °C에서 액체가 아닙니다. 따라서 플레이트 코팅 전에 예열해야 합니다. 대안적으로, 세포 배양에 적합한 임의의 상업적 젤라틴 용액을 플레이트 코팅에 사용할 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 시료 전처리
<ol><li>폐 실질<ol><li>수집된 샘플을 PBS가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .</li>
		<li>샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 수술 용 가위 (최적 크기 : >2cm)를 사용하여 샘플을 각각 약 3-4mm의 작은 조각으로 수동으로 자릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>동맥 세그먼트<ol><li>수집된 샘플을 PBS가 들어 있는 50mL 튜브에 담가 세척합니다.- - .</li>
		<li>단편화는 동맥 분절의 단면의 표면적을 증가시켜 비 EC를 분리 할 가능성을 증가시키기 때문에 자르지 않고 멸균 된 페트리 접시로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 효소 소화
<ol><li>깍둑썰기한 폐 실질 또는 폐동맥 분절을 PBS--로 두 번 세척합니다. 이 단계는 잔류 혈액의 많은 부분을 제거합니다.</li>
	<li>샘플을 15 mL 튜브에 넣고, 37°C 및 5%CO2에서 10분 동안 5 mL의 타입 2 콜라게나제(재료 표 참조)와 함께 인큐베이션한다. 이 배양 동안, 세포 외 기질의 분해는 단일 세포 및 세포 응집체를 방출한다.</li>
</ol>4. 소화된 세포의 회복
<ol><li>멸균 강철/금속 여과기(즉, ~1mm 메쉬 크기의 차 여과기)를 50mL 수집 튜브 상단에 놓습니다.</li>
	<li>15mL 튜브의 전체 내용물을 여과기에 붓고 주걱으로 소화된 조직을 부드럽게 마사지한 다음 수집 튜브가 채워질 때까지 PBS-로 샘플을 헹굽니다. 참고: 이 단계는 밀리미터 단위의 큰 조직 조각을 제거하여 후속 여과 단계의 효율성을 높입니다.</li>
</ol>5. 여과에 의한 Non-EC 제거
<ol><li>4.2 단계에서 수집된 유출물을 70 μm 메쉬 크기의 셀 스트레이너를 이용하여 여과하고, 유출물을 새로운 50 mL 튜브에 수집하였다.</li>
	<li>그런 다음 메쉬 크기가 40μm인 셀 스트레이너를 사용하여 유출물을 새 50mL 튜브에 수집합니다. 이 튜브에 "튜브 1"이라는 레이블을 붙입니다. 참고: 5.1단계와 5.2단계의 이러한 여과는 종종 혼합 세포 집단으로 구성된 큰 세포 응집체를 제거합니다.</li>
</ol>6. 세포 클러스터의 침전 및 세포 파종
<ol><li>실온에서 5분 동안 30 x g 에서 샘플을 원심분리하여 세포 클러스터를 침전시킵니다.</li>
	<li>멸균 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고(붓지 마십시오) 새 50mL 튜브("튜브 2")에 넣습니다.</li>
	<li>펠릿을 "튜브 1"에 현탁하고 PBS--로 최대 50mL까지 튜브를 채웁니다. "튜브 2"를 PBS--로 최대 50mL까지 채웁니다. 알림: 이 단계부터 두 튜브는 동일한 방식으로 처리됩니다.</li>
	<li>샘플을 실온에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>펠릿을 2mL의 성장 배지로 현탁하고( 재료 표 참조), 미리 코팅된 6웰 플레이트의 두 개의 별도 웰에 현탁액을 시딩합니다(단계 1.2). 참고: 이 단계부터 정렬을 위한 합리적인 수의 세포를 얻기 위해 밀도에 도달할 때까지(샘플 크기에 따라 약 1주) 성장 배지를 2일마다 세포에 공급합니다.</li>
</ol>7. 세포 확장
<ol><li>CaCl2 및MgCl2(PBS++, 재료 표 참조)가 포함된 PBS 2mL로 세포를 세척하여 잔류 혈액 세포를 제거합니다(PBS++를 사용하는 것은 세포 분리를 방지하는 데 중요합니다).</li>
	<li>PBS++를 제거하고 새로운 배양 배지를 추가합니다.</li>
	<li>세포가 밀도에 도달할 때까지 7.1단계와 7.2단계를 반복합니다(샘플 크기에 따라 약 1주).</li>
</ol>8. 세포 분류
<ol><li>500 μL의 트립신-EDTA(0.05%, 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 분리하고, 원심분리하고, 190 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>형광 접합체 항-인간 CD31-FITC 항체 10μL(1:20 희석, 표 참조)를 추가하고 세포 현탁액을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>10mL의 PBS-를 사용하여 세포를 세척하고, 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 300μL의 PBS-에 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>100μm 노즐을 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 CD31 양성(CD31+) 세포를 분리 및 수집하고 튜브에 수집합니다.<ol><li>게이팅 전략에 따라 먼저 측면 산란 영역 매개변수인 SSC-A 및 FSC-A를 사용하여 세포 형태를 정의합니다. 그런 다음 FSC-Area/FSC-Height 또는 SSC-Area/SSC-Height 도트 플롯을 사용하여 단일 세포를 선택하고, 표시된 샘플의 양성 세포를 염색되지 않은 대조군 샘플과 비교하여 정의하고, 형광 세포를 수집 튜브(21)로 향하게 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 펠릿을 6-웰 플레이트의 사전 코팅된 웰에 파종하기 위해 성장 배지 2 mL에 현탁시켰다.</li>
</ol>9. 사후 분류 확장
<ol><li>세포 분류 2일 후, 조절된 배지를 신선한 성장 배지로 교체한다.</li>
	<li>세포 확장을 위해 7.1 단계와 7.2 단계를 2 일마다 반복하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+Endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: Endothelial cell.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).</li>
<li>Lüscher, T. F., Tanner, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+regulation+of+vascular+tone+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Endothelial regulation of vascular tone and growth.</a> American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).</li>
<li>Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+endothelial+surface+layer+in+neutrophil+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).</li>
<li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+%28HUVEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e183(2007).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e4032(2012).</li>
<li>Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-to-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-to-cell junctions.</a> FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).</li>
<li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+long-term+culture+of+human+cystic+fibrosis+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells.</a> Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).</li>
<li>Totani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endothelial+cell+dysfunction+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).</li>
<li>Gaskill, C., Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-yield+isolation+and+enrichment+strategy+for+human+lung+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells.</a> Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).</li>
<li>Hewett, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+endothelial+cells+from+micro-+and+macro-vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 61(2016).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li>
<li>Comhair, S. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+lung+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human primary lung endothelial cells in culture.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).</li>
<li>Visner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+maintenance+of+human+pulmonary+artery+endothelial+cells+in+culture+isolated+from+transplant+donors%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors.</a> The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).</li>
<li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory Research. 14 (1), 23(2013).</li>
<li>Ventetuolo, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+pulmonary+artery+endothelial+cells+from+pulmonary+artery+catheter+balloon+tips%3A+considerations+for+use+in+pulmonary+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease.</a> The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313(2020).</li>
<li>Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+isolating+mouse+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).</li>
<li>Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse lung endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63253(2021).</li>
<li>Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CD276+%28B7-H3%29+expression+is+increased+in+human+malignancies+and+distinguishes+between+normal+and+tumour-derived+circulating+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells.</a> British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).</li>
<li>Khan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+senescence+of+endothelial+cells+upon+chronic+exposure+to+TNF%CE%B1+can+be+prevented+by+N-acetyl+cysteine+and+plumericin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin.</a> Scientific Reports. 7 (1), 39501(2017).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+24+protocols+for+the+production+of+platelet-rich+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Oral+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin.</a> BMC Oral Health. 20 (1), 310(2020).</li>
<li>Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+biosynthesis%2C+secretion%2C+and+clearance%3A+Connecting+the+far+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends.</a> Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).</li>
<li>Thompson, S., Chesher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lot-to-lot+variation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lot-to-lot variation.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).</li>
<li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).</li>
</ol>

저자는 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었다고 선언합니다.

인간 병태생리학에서 혈관 내피 세포가 수행하는 다양한 역할은 이러한 세포를 체외 병인 및 약리학 연구에 없어서는 안될 도구로 만듭니다. 다른 혈관 부위/기관의 EC는 독특한 특징과 기능을 나타내기 때문에 관심 기관에서 건강하고 병든 EC를 사용할 수 있는 것이 연구 목적에 이상적입니다. 예를 들어, HLMVEC는 폐 염증에 대한 연구에 필수적입니다. 따라서 이러한 세포의 고수율, 고순도 분리를 위한 방법론은 다양한 연구 분야에 도움이 될 것입니다.
HLMVEC를 분리하는 방법은 다양한 그룹 10,11,12,14,15,17,18,19에 의해 보고되었다.<su...

혈관 내피는 혈관의 내부 표면을 따라 늘어서 있습니다. 혈액 응고, 혈관 긴장도 및 면역 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 인간 표본에서 분리된 내피 세포(EC)의 배양은 연구 목적에 필수적이지만 다른 혈관(동맥, 정맥, 모세혈관)의 EC는 특정 기능을 가지고 있다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의해 완전히 요약 될 수 없으며, 이는 혈관 내피 병태 생리학 5,6에 대한 연구에서 쉽게 이용 가능하고 널리 사용된다. 예를 들어, 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)는 백혈구 모집 및 축적을 조절하여 폐 염증에 중요한 역할을 합니다 4,7. 따라서 높은 충실도로 폐 염증을 재현하는 것을 목표로 하는 실험 환경에는 HLMVEC가 포함되어야 합니다. 반면에 EC 기능 장애는 여러 병리에서 관찰 될 수 있습니다. 따라서 환자의 EC는 질병의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 구축하는 데 기본이 됩니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)에 걸린 사람들의 이식된 폐에서 해부된 폐동맥(HPAEC)에서 EC 조각을 분리함으로써 이 질병에서 내피 기능 장애의 메커니즘을 밝힐 수 있었습니다 8,9.
따라서 질병 상태에서도 다양한 소스/기관으로부터 EC의 분리를 최적화하는 것을 목표로 하는 프로토콜은 특히 이러한 도구가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 연구자에게 귀중한 연구 도구를 제공하는 데 필수적입니다. HLMVEC 및 HPAEC 격리 프로토콜은 이전에 보고되었습니다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 모든 경우에, 폐 표본의 효소적 소화는 혼합 세포 집단을 초래했으며, 이는 임시 선택적 배지 및 자기 비드 또는 세포 분석 기반 세포 분류를 사용하여 정제되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 최적화는 EC 분리의 두 가지 주요 문제를 해결해야 합니다: (1) EC 복제 노화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠른 배양 통로에서 해결되어야 하는 세포 및 조직 오염20; (2) 1차 EC 분리주의 낮은 수율.
이 연구는 HLMVEC 및 HPAEC의 고수율, 고순도 분리를 위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 쉽게 적용할 수 있으며 몇 단계로 거의 순수한 대혈관 및 미세혈관 EC를 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-EDTA 1X</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td>배양판에서 세포를 분리하는 데 사용</td></tr><tr><td>Anti CD31 항체, 클론 WM59</td><td>Dako</td><td>M0823</td><td>면역세포화학에서 CD-31 염색에 사용됩니다. 희석 사용: 1:50</td></tr><tr><td>Anti vWF 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-14029</td><td>면역세포화학에서 von Willebrand 인자 염색에 사용됩니다. 작업 희석 : 1:100</td></tr><tr><td>오토 클레이브 수술 용 가위</td><td></td><td></td><td>표본 절단에 사용</td></tr><tr><td>세포 스트레이너 40 &micro; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>두 번째 여과 시 사용</td></tr><tr><td>셀 스트레이너 70 & 마이크로; m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>첫 번째 여과 콜라</td></tr><tr><td>겐 분해 효소 사용, 유형 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>유형 2 콜라겐 분해 효소 사용. 작업 농도 : 2 mg / mL</td></tr><tr><td>Conjugated anti CD31 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555445</td><td>세포 분류에 사용 (1 : 20 희석)</td></tr> <tr><td>Dulbecco & prime; s 인산염 완충 식염수(PBS)와 함께&nbsp; CaCl2 및 MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>매체 변화 Dulbecco&prime 전에 세포 세척에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. CaCl2 및 MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td>이 없는 S 인산염 완충 식염수(PBS) <td>trypsinization 전 수술 표본 및 세포 세척에 사용</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지 MV</td><td>PromoCell</td><td>C-22020</td><td>HLMVEC 성장 배지</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>플레이트 코팅에 사용되는 인간 플라즈마의 피브로넥틴. 작업 농도 : 50 & 마이크로; </td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 추출한 g/mL 젤라틴, A형</td><td>시그마-알드리치</td><td>G2500</td><td>플레이트 코팅에 사용되는</td></tr><tr><td>A형 젤라틴</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>g-2500</td><td>플레이트 코팅에 사용되는 돼지 가죽의 젤라틴. 작업 농도 : 1.5 %</td></tr></tbody></table>

microvascular and macrovascular endothelial cell isolation and purification from lung-derived samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples

건강하고 병든 조직 및 기관에서 분리된 세포의 가용성은 개인화된 의학 접근의 핵심 요소입니다. 바이오뱅크는 생물의학 연구를 위한 광범위한 1차 및 불멸화 세포 컬렉션을 제공할 수 있지만, 이러한 것들이 모든 실험 요구, 특히 특정 질병이나 유전자형과 관련된 것들을 충족시키지는 못합니다. 혈관 내피 세포(EC)는 면역 염증 반응의 핵심 구성 요소이므로 다양한 장애의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 특히, 서로 다른 부위의 EC는 서로 다른 생화학적 및 기능적 특성을 나타내므로 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 특정 EC 유형(즉, 대혈관, 미세혈관, 동맥 및 정맥)의 가용성이 필수적입니다. 여기에서는 폐동맥 및 폐 실질로부터 고수율, 사실상 순수한 인간 대혈관 및 미세혈관 내피 세포를 얻기 위한 간단한 절차가 상세히 설명된다. 이 방법론은 상업적 출처로부터 독립성을 달성하고 아직 사용할 수 없는 EC 표현형/유전자형을 얻기 위해 모든 실험실에서 비교적 저렴한 비용으로 쉽게 재현할 수 있습니다.

HLMEC 격리 HLMVEC를 분리하는 동안 가장 큰 문제는 미세한 모세 혈관이 간질 조직에서 쉽게 분리 될 수 없기 때문에 오염 된 세포의 존재입니다. 따라서 분리 공정의 초기 단계에서 가능한 가장 높은 순도를 달성하는 것은 배양 계대 및 세포 노화를 줄이기 위해 중요합니다. 마찬가지로, 최적의 격리 프로토콜은 순수 HLMVEC의 가능한 가장 높은 수율을 제공해야 합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 이전에 설명된 프로토콜10,11,12,14,15에 따라 새로운 절차가 설정되었습니다.
폐 실질은 혈관이 심하여 HLMVEC의 훌륭한 공급원을 나타내지만 주로...

어렵지만 폐 내피 세포의 분리는 폐 염증 연구에 필수적입니다. 본 프로토콜은 대혈관 및 미세혈관 내피 세포의 고수율, 고순도 단리를 위한 절차를 설명한다.

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

The availability of cells isolated from healthy and diseased tissues and organs represents a key element for personalized medicine approaches. Although ...

이 프로토콜은 조직 샘플 또는 매우 작은 혈관 조각에서 내피 세포를 분리하는 것과 관련이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 모든 연구 실험실에서 재현 할 수 있으며 매우 작은 샘플에서도 우수한 순도의 내피 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 염화칼슘 및 염화마그네슘 또는 PBS 마이너스 마이너스 없이 PBS가 들어있는 50 밀리리터 튜브에서 수집된 샘플을 세척하여 폐 실질 샘플 준비를 시작합니다.샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 수술 용 가위를 사용하여 약 3-4 밀리미터의 작은 조각으로 수동으로 자릅니다. 동맥 부분의 경우, 수집 된 샘플을 PBS 마이너스 마이너스가 들어있는 50 밀리리터 튜브에서 세척하고, 자르지 않고 멸균 된 페트리 접시에 옮긴다. 잔류 혈액의 큰 부분을 제거하려면 PBS에서 빼기를 뺀 두 번 깍둑 썰기 한 폐 실질 또는 폐동맥 분절에 두 번 세척하십시오.다음으로, 샘플을 15 밀리리터 튜브에 넣고 5 밀리리터의 유형 II 콜라게나아제와 함께 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 10 분 동안 배양합니다. 큰 조각을 제거하려면 50밀리리터 수집 튜브 상단에 멸균된 1mm 메쉬 크기의 여과기를 놓고 15밀리리터 튜브의 전체 내용물을 여과기에 붓습니다. 다음으로, 수집 튜브가 채워질 때까지 PBS 마이너스 마이너스로 샘플을 헹구기 전에 주걱으로 소화된 조직을 부드럽게 마사지합니다.비혈관 내피 세포를 제거하려면 70마이크로미터 메쉬 크기의 세포 스트레이너를 사용하여 새로운 50밀리리터 튜브에서 소화된 세포에서 수집된 유출을 여과합니다. 그런 다음 40마이크로미터 메쉬 크기의 셀 스트레이너를 사용하여 튜브 1로 표시된 새로운 50밀리리터 튜브에 유출물을 수집합니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 30G에서 원심분리하여 세포 클러스터를 침전시킵니다.멸균 피펫을 사용하여 상층액을 Tube 2로 표시된 새로운 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브 1에 펠릿을 매달고 PBS 마이너스 마이너스로 튜브를 최대 50 밀리리터까지 채 웁니다. 마찬가지로 튜브 2를 PBS 마이너스 마이너스로 최대 50 밀리리터까지 채 웁니다.완료되면 샘플을 300G에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 2 밀리리터의 성장 배지로 펠릿을 현탁시키고 사전 코딩 된 6 웰 플레이트의 두 개의 개별 웰에 현탁액을 시드합니다. 평활근 세포 또는 SMC 및 섬유아세포를 포함하는 처리된 세포 응집체의 일부가 장섬유에 결합되어 있는 것이 관찰되었다.또한, SMC는 비-혈액 세포 단일체의 대부분을 차지하였다. 직경이 10 내지 20 마이크로미터를 초과하지 않는 세포의 작고 조밀한 클러스터는 기질 조직의 단편에 기인하는 요소가 없었다. 약 70%의 순수 인간 폐 미세혈관 내피 세포 또는 HLMVEC, 단일 세포가 얻어졌습니다.순수한 HLMVEC 제제를 얻는 동안, 분류 된 세포는 특징적인 내피와 같은 모양을 취했다. 초점 현미경 검사에서 지방의 정제된 세포의 거의 100%가 내피 세포 항원, 즉 CD31 및 보다 구체적인 폰 빌레브란트 인자에 대해 양성으로 염색된 것으로 나타났습니다. 이 세포들이 매트리겔에 안착되었을 때, 그들은 관형 구조와 HUVEC를 생성하여 내피 표현형을 확인했습니다.효소 소화 중 잠복 시간이 짧기 때문에 콜라게나제를 예열하는 것이 중요합니다. 그리고 또 다른 요점은 세포 클러스터가 침전되는 동안 팔레트의 세포 응집체를 건드리지 않고 상청액을 부드럽게 제거하는 것이 중요하다는 것입니다. 이 절차는 원심분리 및 여과의 사용을 기반으로 하며, 따라서 크기 및 클러스터링과 같은 특성에 기초하여 다른 세포 유형을 분리하는 것을 알 수 있는 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

microvascular-macrovascular-endothelial-cell-isolation-purification

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

이 프로토콜은 전체 췌장에서 마우스 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다.

마우스 췌장 내피 세포의 분리

배우세요 폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포를 분리하고 정제하는 방법을. 콜라게나아제 소화와 원심분리를 통해 약 70% 순도의 HLMVEC를 얻어 폐 염증 연구에 활용할 수 있습니다.

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제) (동영상) | JoVE Journal

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

더 많은 동영상 탐색