Name: Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 학습하세요 오가노이드-섬유아세포 공동 배양 기법을 통해 식도 전구세포와 섬유아세포 간 상호작용을 시각화하고 분석하는 방법을. 이 모델은 식도 생물학 및 암 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 ERC StG TroyCAN(851241)의 지원을 받았습니다. E.E.는 Cancerfonden 박사후 연구원입니다. MG는 Ragnar Söderberg 펠로우이자 Cancerfonden Junior Investigator입니다. 우리는 Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) 및 Comparative Medicine Biomedicum (KMB) 동물 시설을 포함한 Karolinska Institutet 핵심 시설의 기술 지원에 감사드립니다. 프로토콜을 주의 깊게 읽고 의견을 제시해 주신 Genander 연구소 구성원들에게 감사드립니다.

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<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
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<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
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<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
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<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 기능적 식도 상피-섬유아세포 상호작용을 조사하기 위한 시험관 내 모델을 설정합니다.
상피층은 기질에서 분리되어 상피 및 기질 구획 모두에 대해 최적화된 해리 프로토콜을 허용합니다. 상피 해리 프로토콜의 최적화에도 불구하고 조직 덩어리는 여전히 분명합니다. 15분마다 세게 위아래로 피펫을 하면 덩어리의 수와 크기가 크게 줄어듭니다. 다른 프로토콜은 트립신을 사용하여 상피층 5,6을 추가로 해리시킵니다. 여기서, 트립신의 사용, 또는 해리 시간을 추가로 증가시키는 것은 바람직하지 않은데, 이는 상피 세포 생존율 및 오가노이드 형성 효율의 감소를 초래하는 경향이 있기 때문이다. 상피와 달리 간질은 쉽게 해리되며 해리 용액에서 30분 동안 ~90%의 섬유아세포 생존율을 가진 단일 세포 현탁액이 생성됩니다(그림 1E). 프로토콜에서 상피-기공 분리 단계를 제외하면 해리 시간이 상당히 증가하여 섬유아세포 생존율이 감소하고 상피 세포의 수율이 낮아집니다. 또한, 간질에서 상피를 분리하면 각 집단의 세포 수를 결정하고 공동 배양을 설정할 때 상피 세포와 다른 마우스 계통의 섬유아세포를 혼합할 수 있습니다.
오가노이드 성장에 대한 섬유아세포 기능을 연구하는 것은 줄기 세포 생물학에서 일반적으로 사용되는 방법이다 9,10,11,15,16. 확립된 공동 배양 배지는 10% 태아 송아지 혈청(FCS)9,15 또는 성장 인자 감소 배지10,16으로 보충된 DMEM입니다. 이 프로토콜에서, 성장 인자 환원 배지는 섬유아세포가 대체로 정지 상태인 생체내 줄기 세포 틈새의 조건을 모방하기 위해 사용된다. FCS는 공동 배양에서 섬유아세포의 활성화 및 증식을 초래하는 성장 인자 풍부 혈청이며, 생체 내 상태와 구별되는 섬유아세포 상태에 해당할 가능성이 높습니다. FCS를 배제하고 성장 인자를 감소시킴으로써, 배지 단독(ERlow low)이 오가노이드 성장을 지지하지 않고 섬유아세포 증식을 자극하지 않도록, 오가노이드 성장에 대한 섬유아세포의 효과를 단리할 수 있다. 이 배지에서 NOGGIN이 제거되고 RSPO가 최소(10% RPSO)로 감소합니다. NOGGIN과 RSPO는 모두 식도 오가노이드 성장에 필수적인 것으로 입증되었다6. EGF는 그 자체로 오가노이드 성장을 지원하지 않기 때문에 공동 배양 배지에 유지되었습니다. 그러나, 섬유아세포는 또한 EGF 환원 배지에서 오가노이드 성장을 지원할 수 있다 (ElowRlow; 그림 2B, D).
오가노이드 공동 배양은 트립신 처리 중에 섬유아세포가 손실되기 때문에 계대배양을 통해 지속될 수 없습니다. 그러나 식도 오가노이드가 유지, 확장 및 단일 배양으로 추가 실험에 사용될 수 있기 때문에 오가노이드 계대배양이 프로토콜에 포함되었습니다. 단일 배양의 계대 오가노이드는 새로 분리된 섬유아세포와 공동 배양을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 1차 세포 사용의 단점은 여러 오가노이드 공동 배양을 설정하는 데 필요한 마우스의 수입니다. 섬유아세포의 작은 하위 집단에 초점을 맞출 때, 얻어지는 공동 배양의 수는 제한적이다. 다른 프로토콜에서, 섬유아세포는 오가노이드 공동배양을 설정하기 위해 섬유아세포를 사용하기 전에 먼저 배양에서 확장된다10. 그러나, 섬유아세포는 패시징 동안 형태 및 정체성을 변화시키며, 이는 일차 피부 및 심장 섬유아세포를 사용하여 나타난다17,18. 식도 섬유아세포의 기존 2D 계대배양은 형태 및 표현형 변화를 모두 초래하며, 이는 섬유아세포의 시험관 내 농축이 내인성 줄기 세포 틈새의 표현화를 목표로 하는 공동 배양에 적합하지 않음을 보여줍니다.
전체 마운트 염색은 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 유지하고 시각화하는 도구를 제공합니다. 모든 오가노이드에 섬유아세포가 직접 부착되어 있는 것은 아니지만 대부분의 오가노이드는 섬유아세포와 접촉한다는 점에 유의해야 합니다( 그림 2C 참조). 상피-섬유아세포 상호작용을 유지하려면 오가노이드를 주의해서 다루고 격렬한 피펫팅, 와류화 및 고속 회전을 피하는 것이 중요합니다. 최적의 고정은 3D 조직 구조를 유지하고 내인성 형광을 유지하는 데 중요합니다. 30분 고정은 H2BeGFP 신호를 유지하기에 충분하며 이 프로토콜에 사용되는 항체에 최적이지만 사용된 형광단과 항체에 따라 다를 수 있습니다. 오가노이드를 제거하면 광 산란이 감소하고 전체 3D 구조의 시각화가 크게 향상됩니다. 오가노이드가 작기 때문에 청소가 쉽고 빠릅니다. 그러나 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 전체 오가노이드를 이미징하는 것은 여러 Z 스택을 만들어야 하기 때문에 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 스피닝 디스크와 같은 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징 시간을 줄일 수 있습니다.
전반적으로, 섬유아세포가 있는 상태에서 성장한 식도 오가노이드는 식도 줄기 세포 틈새의 측면을 이해하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 또한 전체 마운트 클리어링은 섬유아세포와 오가노이드 간의 상호 작용을 시각화할 수 있는 접근 가능한 방법을 제공합니다.

오가노이드는 줄기 세포와 전구 세포를 특성화하고 줄기 세포 틈새 1,2,3,4의 세포 구성 요소에서 파생된 신호 신호를 이해하기 위한 3D in vitro 분석으로 사용됩니다. 마우스 식도 오가노이드는 2014년에 처음 기술되었으며 여러 논문에서 R-Spondin(RSPO), NOGGIN 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장 인자를 확인하고 식도 오가노이드 5,6,7을 유지하고 통과시키는 데 필요한 성장 인자를 확인했으며 생체 내에서 유사한 신호 신호가 필요하다고 주장했습니다 전구 세포 재생. 그러나 성장 인자는 일반적으로 비생리학적 농도로 첨가되어 생체 내 신호 전달 환경을 반드시 반영하지 않는 오가노이드 성장 조건을 초래합니다.
섬유아세포(Fibroblasts)는 많은 줄기세포 틈새에서 전구세포 특성을 지지하는 이질적인 기질 세포 집단이다8. 동일한 오가노이드 배양에서 상피 전구 세포와 섬유아세포를 결합하면 외인성으로 보충된 성장 인자의 감소된 농도에서 오가노이드 형성이 가능합니다. 장 및 간 상피로부터의 오가노이드 공동배양 시스템이 기재되어 있지만, 식도 오가노이드-섬유아세포 공동배양을 확립하기 위한 프로토콜은 여전히 탁월하다 9,10,11.
이 프로토콜에서는 형질전환 PdgfrαH2BeGFP 마우스12 또는 고전적인 항체 염색이 있는 야생형 마우스를 사용하여 식도에서 섬유아세포에 대한 두 가지 형광 활성화 세포 분류(FACS) 전략이 요약됩니다. 섬유아세포의 상이한 하위집단은 선택된 세포 표면 마커를 사용하여 분리될 수 있으며, 이에 따라 프로토콜에 유연성을 제공한다. 또한, 오가노이드 형태를 보존하는 3D 형광 이미징 기술을 사용하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 특성화합니다. 오가노이드 투명화는 오가노이드의 광 투과 깊이를 증가시켜 오가노이드-섬유아세포 연결의 시각화를 개선하고 오가노이드 구조 전체를 재현할 수 있는 빠른 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 식도 오가노이드 공동 배양과 전체 마운트 이미징 전략을 결합하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용의 기능적 특성화를 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>B-27 보충제 (50X), 무혈</td>청 <td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 마트리겔&nbsp; 성장 인자 감소(GFR) 기저막 매트릭스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>써모 피셔(Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>써모 피셔(Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제</td><td>써모 피셔 (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>없음 써모 피셔 (Gibco)</td> <td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청</td><td>잭슨 면역</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신 (10,000 U/mL)</td> <td>써모 피셔 (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100 솔루션</td><td>머크</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides, and recombinant proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>해리 용액: 0.25 mg/ml Liberase TM, HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td>의 0.25 mg/ml Dnase<td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>포름 알데히드, 37 %, 10-15 % 메탄올 포함</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>리바제</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N- 아세틸 - 시스테인</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>노긴 쥐</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 EGF 단백질, CF</td><td>R& D 시스템</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 murine</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plastic & 유리 제품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 멸균 세포 여과기 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning 멸균 세포 여과기 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml; ser/ 커버 슬립</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 반응 튜브, 1.5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Low Retention 마이크로 원심분리기 튜브 0.6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 mm 4 원형 웰 iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 겸자, 생물학 팁</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 펜</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위 각도 측면 볼 팁 8mm 커팅 엣지</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjugated Antibody for FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 항체 클론: 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD26 (DPP-4) 항체</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) 항체</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>면역형광 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig;-integrin 4) 클론: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 14</td><td>Acris 항체 (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin13 클론:</td><td>EPR3671 abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin (CD324) 클론: 2.40E+11</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 5 Polyclonal Chicken 항체, Purified 클론: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 클론: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>재조합 항-KLF4 항bod 클론: EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* 항체 선택의 형광단을 갖는</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization and visualization of espacageal fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

상피 줄기 세포와 전구 세포는 평생 동안 상피 장벽의 형성과 유지에 기여합니다. 대부분의 줄기 및 전구 세포 집단은 해부학적으로 구별되는 위치에 숨겨져 있어 줄기를 유지하는 틈새 신호와 독점적인 상호 작용을 가능하게 합니다. 상피 오가노이드 배양의 발달은 항상성 및 질병에서 줄기 및 전구 세포의 역할을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공하지만, 틈새 환경 내에서의 상호 작용은 거의 부재하여 줄기 세포 행동에 영향을 미치는 요인의 식별을 방해합니다. 섬유아세포는 상피줄기와 전구세포의 운명을 지시하는 데 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 식도 전구 세포 재생 및 분화에서 섬유아세포 하위 집단의 묘사를 가능하게 하는 포괄적인 오가노이드-섬유아세포 공동 배양 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜에서, 상피 세포와 섬유아세포 모두를 식도로부터 병렬로 분리하는 방법이 기재되어 있다. 형질전환 리포터 또는 야생형 마우스에서 식도 전구 세포와 섬유아세포 하위 집단을 모두 분리하기 위한 뚜렷한 형광 활성화 세포 분류 전략이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 특정 섬유아세포 하위 집단의 분리를 수용하도록 조정할 수 있는 다양한 접근 방식을 제공합니다. 식도 상피 오가노이드 단일 배양의 확립 및 계대 배양이 이 프로토콜에 포함되어 있어 공동 배양 시스템과 직접 비교할 수 있습니다. 또한, 상피-섬유아세포 상호작용의 상세한 이미지 분석을 가능하게 하는 3D 클리어링 접근법이 설명된다. 총체적으로, 이 프로토콜은 시험관 내에서 식도 줄기 세포 틈새 성분을 식별하고 이해하기 위한 비교 및 상대적으로 높은 처리량 방법을 설명합니다.

식도는 상피층, 고유판, 점막하 및 외근과 같은 여러 층으로 나뉩니다(그림 1A). 섬유아세포는 기질이라고 하는 점막하층과 고유판 내에 존재합니다. 이 프로토콜에서 근외근은 기계적으로 제거되며(그림 1B), 이는 기질에 존재하는 섬유아세포(PdgfrαH2BeGFP+)의 손실로 이어지지 않습니다(그림 1C). 해리되기 전에 상피는 간질에서 분리되어 두 개의 조직 세그먼트를 생성합니다(그림 1B). 두 층을 분리하는 것은 깨지기 쉬운 간질 층에 비해 더 견고한 상피층에 대한 해리 시간을 증가시킬 수 있는 기회를 제공합니다. 이러한 방식으로, 생존 가능한 상피 전구 세포와 기질 섬유아세포를 모두 생성하는 효율적인 분리 프로토콜이 확립됩니다(그림 1B). 식도 전구 세포는 높은 INTEGRIN-β4 및 E-CADHERIN 발현에 따라 분류됩니다(그림 1C,D).
섬유아세포의 하위집단은 별개의 마커를 사용하여 분리될 수 있다. 이 프로토콜에서는 일반적으로 사용되는 섬유아세포 마커 PDGFRα 및 DPP4(CD26)에 기초한 섬유아세포 분리를 위한 전략이 제공됩니다. PdgfrαH2BeGFP 리포터 발현 또는 DPP4 항체에 의한 분리는 분리된 세포의 약 50%가 섬유아세포임을 보여줍니다(그림 1E,F). 또한, PDGFRα+ 섬유아세포의 70%는 DPP4+이며, 이는 대체로 겹치지만 동일하지는 않은 섬유아세포 집단이 얻어진다는 것을 나타낸다. 상피 및 기질 세포 집단을 모두 분리한 후, 식도 전구 세포는 단독으로 또는 매트릭스 돔에서 섬유아세포와 함께 배양됩니다. 오가노이드 형성에 대한 섬유아세포의 기여를 연구하기 위해, 공동 배양은 성장 인자 감소 배지에서 유지된다(도 1G).
식도 전구 세포는 EGF, NOGGIN 및 RSPO(ENR)의 존재 하에 오가노이드를 형성합니다. NOGGIN 제거 및 RSPO 투여량 감소(25ng/μL; ER이낮음)은 오가노이드 형성을 방지하기에 충분하다(도 2A). 흥미롭게도, ER저배지의 식도 전구 세포에 DPP4+ 또는 PDGFRα+ 섬유아세포를 추가하면 오가노이드 형성 능력이 회복되어 두 섬유아세포 집단 모두에 대한 지지 기능을 입증합니다(그림 2A-D). PdgfrαH2BeGFP 이식유전자의 시각화는 섬유아세포가 오가노이드 형성 동안 상피 전구 세포와 밀접하게 접촉한다는 것을 보여줍니다(그림 2A). 6일째에 PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포는 여전히 공동 배양에 풍부하게 존재합니다. 섬유아세포는 돔 전체에 존재하며, 오가노이드에 가까이 접하거나(full arrow), 오가노이드에 부착(arrowhead; 그림 2D).
전체 마운트 염색은 섬유아세포와 오가노이드의 상호작용을 3D로 표현한 것입니다(그림 3). 투명 용액을 사용하지 않고 전체 마운트 프로토콜을 수행할 수 있지만 오가노이드의 투명도와 레이저 투과율이 감소합니다(그림 3B, z-view). 오가노이드를 장착할 때 스페이서는 오가노이드 형태를 유지하는 데 도움이 됩니다. 대조적으로, 커버슬립을 오가노이드에 직접 도금하면(스페이서 없이) 오가노이드가 평평해지고 오가노이드 구조가 손실됩니다(그림 3A, B).
DPP4+ 및 PDGFRα+ 섬유아세포는 모두 오가노이드를 감싸고 있는 것으로 밝혀졌습니다(그림 3C, 비디오 1 및 비디오 2). 식도 오가노이드의 분화는 다른 마커를 사용하여 평가할 수 있습니다. 그림 4는 제공된 염색 프로토콜이 염색하기 쉬운 케라틴(KRT14/13)과 염색하기 어려운 전사 인자(TRP63/KLF4)에 적합하다는 것을 보여줍니다. 공동 배양 프로토콜은 생체 내13,14에서 입증되고 ENR 배지에서 성장한 오가노이드에서 볼 수 있듯이 유사한 분화 패턴을 가진 오가노이드를 생성합니다. KRT14+ 또는 TRP63+ 전구세포는 외부층을 형성하고 KRT13+ 또는 KLF4+ 분화된 세포는 안쪽을 향합니다.
이 프로토콜은 시험관 내에서 식도 줄기 세포 틈새를 연구하고 오가노이드와 섬유아세포 사이의 상호 작용을 시각화하는 도구를 제공합니다. 항체를 사용하여 섬유아세포를 분리하기 위한 프로토콜을 구현함으로써, 상기 방법은 적응 가능하며, 형질전환 마우스의 필요 없이 섬유아세포 서브집단을 연구하는데 사용될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> 그림 1: 식도에서 전구 세포와 섬유아세포 하위 집단의 분리. (A) 식도의 여러 층에 대한 개략도. 간질에는 고유판과 점막하층이 있습니다. (B) 격리 프로토콜의 개략도. 근육 (muscularis externa)은 집게를 사용하여 기계적으로 제거됩니다. 나머지 식도는 절단되어 Thermolysin에서 배양되어 간질에서 상피층을 분리합니다. 상피와 간질은 분리되고, 기계적으로 다져지고, 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 소화됩니다. 이어서, 해리된 세포를 염색하고 FACS를 준비한다. (C) 간질에서 PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포를 보여주는 근외근에서 벗겨진 식도의 단면. INTEGRIN-β4(ITGβ4) 및 E-CADHERIN(ECAD) 이중 양성 세포는 식도의 상피 전구 세포입니다. 스케일 바 = 100 μm. (D) 모든 단일 세포에서 살아있는 세포(상부 패널)의 백분율을 보여주는 상피 세포 분리의 대표적인 유세포 분석 플롯. 하단 패널은 모든 살아있는 세포에서 분리된 ITGβ4+ ECAD+ 전구세포(Prog.) 세포의 백분율을 보여줍니다. (E) 살아있는 세포의 백분율을 보여주는 기질 세포 분리의 대표적인 유세포 분석 플롯(왼쪽 상단 패널). 모든 살아있는 세포의 분리된 DPP4+ 섬유아세포(Fibr.; 우측 상단 패널) 및 Pdgfrα+ 섬유아세포(좌측 하단 패널)의 백분율을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. Pdgfrα+ 섬유아세포의 70%도 DPP4+(오른쪽 하단 패널)입니다. (F) DPP4+ 단독 세포(2.5%), DPP4+ PDGFRα+ 세포(37.5%) 및 PDGFRα+ 단독 세포(17.7%)를 보여주는 기질의 대표적인 유세포 분석 플롯. 백분율은 모든 살아있는 세포의 백분율입니다. (G) 상피 전용 세포는 50ng/μL EGF, 100ng/μL NOGGIN 및 250ng/μL RSPO(ENR)의 존재 하에 또는 EGF 및 저농도 RSPO(25ng/μL)의 존재 하에 섬유아세포와 함께 매트릭스 돔에 도말됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> 그림 2: 오가노이드 공동 배양의 대표적인 결과. (A) 1일차부터 6일차까지 오가노이드의 성장을 보여주는 명시야 이미지. PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포와 공동 배양된 오가노이드의 명시야 이미지도 핵 eGFP 신호를 보여줍니다. 스케일 바 = 25 μm. (B) 6일째 전체 매트릭스 돔의 명시야 이미지. 왼쪽 열은 ER low 또는 E low R low배지에서 Pdgfrα+ 섬유아세포의 존재 하에 성장한 오가노이드 공동 배양을 보여줍니다. 중간 컬럼은 ER low 또는 E low R low배지에서 DPP4+ 섬유아세포의 존재 하에 성장한 오가노이드 공동 배양을 보여줍니다. 오른쪽 열은 ENR 배지에서 성장한 오가노이드 단일 배양을 보여줍니다. ENR 배지 = EGF(50ng/μL), NOGGIN(100ng/μL) 및 RSPO(250ng/μL). ER낮음 = EGF 및 25ng/μL RSPO. Elow Rlow = 5 ng/μL EGF 및 25 ng/μL RSPO. 스케일 바 = 500 μm. (C) 오가노이드 형성 효율(%)을 나타내는 그래프(즉, 상이한 배양 조건에서 오가노이드를 형성하는 세포의 비율). 각 점은 행렬 돔을 나타내고 막대는 조건당 모든 점의 평균을 나타냅니다. (D) PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포와 공동 배양한 6일차 오가노이드의 명시야 및 형광 이미지. PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포는 돔 전체에 존재하며 오가노이드에 부착되고(화살촉) 부착되지 않았지만 오가노이드와 접촉합니다(전체 화살표). 스케일 바 = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> 그림 3: 섬유아세포-오가노이드 상호작용 연구를 위한 전체 마운트 염색 프로토콜. (A) 전체 마운트 면역형광 프로토콜의 개략도. AB = 항체. (B) 투명화되지 않은 오가노이드에 비해 레이저 광의 투명성 및 침투율이 감소함을 보여주는 투명화되지 않은 전체 마운트 염색의 면역형광 사진. 스페이서가 없으면 오가노이드가 평탄화되고 오가노이드 형태가 손실됩니다. (C) 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 이미지는 VIMENTIN+ 섬유아세포(Fibr.)가 오가노이드를 감싸고 밀접하게 접촉한 오가노이드의 3D 표면을 보여줍니다. 3D 단면과 2D 평면 이미지는 오가노이드의 내강을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> 그림 4: 전체 마운트 이미지는 뚜렷한 기저 및 기저 상부 세포 집단을 보여줍니다. (A) 외층의 KRT14+ 기저 세포와 KRT13+ 분화된 기저 상부 세포를 보여주는 PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포를 사용한 단일 및 공동 배양 오가노이드의 전체 마운트 염색. 스케일 바 = 50 μm. (B) 외층의 TRP63+ 기저 세포와 KLF4+ 분화된 기저 상부 세포를 보여주는 PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포를 사용한 단일 및 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 염색. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 오가노이드 배양 배지 성분을 설명하는 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동영상 1: PdgfrαH2BeGFP+ 섬유아세포가 오가노이드를 감싸고 밀접하게 접촉하고 있습니다. 비디오는 그림 3C의 상단 패널과 함께 제공됩니다. 그림 3C 의 스케일 바는 50 μm이고 오가노이드는 직경이 ~120 μm입니다. VIMENTIN은 흰색, E-CADHERIN은 빨간색, PdgfrαH2BeGFP는 녹색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2: DPP4+ 섬유아세포가 오가노이드를 감싸고 밀접하게 접촉합니다. 비디오는 그림 3C의 하단 패널과 함께 제공됩니다. 그림 3C 의 스케일 바는 50 μm이고 오가노이드는 직경이 ~120 μm입니다. VIMENTIN은 흰색, E-CADHERIN은 빨간색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

오가노이드-섬유아세포 공동배양은 생체 내 줄기세포 틈새를 연구하기 위한 모델을 제공한다. 여기서, 식도 오가노이드-섬유아세포 공동배양을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 또한 전체 마운트 이미징을 사용하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 시각화합니다.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

따라서 전구 세포는 환경과 상호 작용하여 조직 항상성을 유지합니다. 그리고 이 프로토콜을 사용하여 섬유아세포가 식도 전구 세포 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 시작할 수 있습니다. 공동 배양 시스템은 정상적인 식도 전구체 틈새를 모방한 먼저 분리된 세포를 사용합니다.이미징 전에 오가노이드를 제거하면 세포 상호 작용과 오가노이드 형태를 모두 분석할 수 있습니다. 이 방법은 인간 식도 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 건강한 환자나 암 환자의 재료를 사용합니다.그렇게 함으로써 우리는 암 관련 섬유아세포의 특정 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 상피 및 기질 세포의 해리는 생존 가능한 오가노이드를 얻는 데 중요합니다. 소화 중에는 세포 수율이 낮아지고, 과다 소화는 세포 생존력과 오가노이드 형성 능력을 감소시킵니다.시작하려면 해부 현미경과 집게를 사용하여 식도의 근외근을 기계적으로 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 해부된 식도의 말단부를 잡고 다른 집게를 사용하여 식도의 원위부에서 근위부까지 근육을 잡고 당깁니다. 근육층을 제거하고 버립니다.식도를 세로로 열려면 식도의 한쪽 끝을 잡고 미세 해부 스프링 가위의 볼을 내강에 삽입하여 조직 손상을 방지합니다. 끝을 잡고 식도를 잘라내어 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 또는 24 웰 플레이트에 넣습니다. 열린 식도를 HBSS에 밀리리터당 0.5밀리그램의 써모리진에 담그고 섭씨 37도에서 로커 셰이커에서 15분 동안 배양합니다.thermolysin 용액에서 식도를 제거한 후 식도 상피를 간질에서 조심스럽게 분리하십시오. 상피 및 기질 층을 HBSS에서 200 마이크로리터의 해리 용액이 있는 두 개의 분리된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고, 이들을 얼음 위에 놓는다. 날카로운 메스를 사용하여 식도 상피를 다지고 200 마이크로 리터의 해리 용액으로 페트리 접시에서 다진 조직을 수집합니다.1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 800 마이크로 리터의 신선한 해리 용액을 첨가하고 다진 상피층이있는 튜브를 섭씨 37도에서 60 분 동안 로커 셰이커에 놓습니다. 15분마다 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 용액을 약 20회 위아래로 피펫팅합니다.해부 가위를 사용하여 200 마이크로 리터의 해리 용액이 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에서 기질 층을 미세한 조각으로 자르고 800 마이크로 리터의 신선한 해리 용액을 첨가한다. 튜브를 섭씨 37도의 로커 셰이커에 30분 동안 놓습니다. 기질 용액에 대해 30분 동안 인큐베이션하고 상피 용액에 대해 60분 동안 인큐베이션한 후, 용액을 추가로 20회 동안 위아래로 피펫팅합니다.기질 용액을 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 통과시키고, 상피 용액을 40 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 새로운 1.5 밀리미터 마이크로 원심분리 튜브에 통과시킨다. 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리하고 1밀리리터 피펫으로 과잉 액체를 제거하여 상층액을 버립니다. 펠릿을 200 마이크로 리터의 항체 혼합물에 재현탁하십시오.혼합물을 유세포 분석 튜브로 옮긴 후 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 3밀리리터의 1% FBS를 추가하고 5분 동안 다시 원심분리합니다. 그런 다음 최소 200마이크로리터의 1%FBS에 세포를 다시 일시 중단합니다.10, 000 희석된 죽은 세포 염색 마커를 팩스 분류 5분 전에 추가하여 살아있는 세포를 분리합니다. 분류된 상피 세포와 섬유아세포를 튜브에 1:2의 비율로 혼합합니다. 300G에서 5분 동안 원심분리한 후 200마이크로리터 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.펠릿을 차가운 염기성 오가노이드 배지에 재현탁하고 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 얼음 위에 놓고 200 마이크로 리터 피펫으로 조심스럽게 제거하여 상청액을 버립니다. 돔 당 10 마이크로 리터의 매트릭스 믹스로 세포를 재현탁하고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.섭씨 37도 인큐베이터에서 예열 된 48 웰 플레이트를 가져 와서 웰 당 하나의 매트릭스 돔을 만듭니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 오가노이드 공동 배양을 포함하는 매트릭스 돔에 200마이크로리터의 사전 예열된 ER 저 배지를 추가하고 상피 오가노이드만 포함하는 각 매트릭스 돔에 ENR 배지를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다.그리고 처음 이틀 동안은 배지에 10 마이크로 몰 암석 억제제를 보충하십시오. 오가노이드 배지를 제거하고 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 매트릭스 돔에 추가합니다. 플레이트를 5 내지 10분 동안 얼음 위에 놓은 후, 위아래로 피펫팅하고, 용액을 0.6 밀리리터의 비부착성 튜브로 옮긴다.오가노이드가 바닥에 가라앉을 수 있도록 100G에서 30-60초 동안 잠시 원심분리합니다. 과잉 액체를 제거한 후 얼음처럼 차가운 PBS를 튜브에 넣고 30-60초 동안 다시 원심분리합니다. 앞서 그림과 같이 여분의 액체를 제거하고 얼음 위에서 200분 동안 PBS 용액에 4마이크로리터의 차가운 포름알데히드로 오가노이드를 30분 동안 고정합니다.오가노이드가 가라앉도록 튜브를 똑바로 세우고 포름알데히드를 제거합니다. 500마이크로리터의 차가운 PBS를 첨가하여 남은 포름알데히드를 씻어냅니다. 과량의 PBS를 제거한 후, 500 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 첨가한다.튜브를 실온에서 60분 동안 로커 셰이커에 놓습니다. 블로킹 버퍼를 제거하고 1차 항체가 있는 200마이크로리터의 블로킹 버퍼에 오가노이드를 다시 현탁합니다. 오가노이드를 섭씨 4도에서 밤새 로커 셰이커에 다시 놓습니다.1차 항체 혼합물을 제거하고 PBS에서 0.02% Triton X 100 500마이크로리터를 사용하여 실온에서 60분 동안 오가노이드를 세척합니다. 이것을 세 번 반복하십시오. 유사하게, 세척 완충액을 제거하고, 섭씨 4도에서 밤새 블로킹 완충액에 200 마이크로리터의 형광 접합 2차 항체를 첨가한다.PBS에서 0.02% Triton X 100을 사용하여 오가노이드를 다시 세척한 다음 500마이크로리터의 PBS를 사용합니다. 과량의 액체를 모두 제거한 후 오가노이드에 10마이크로리터의 투명 용액을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 0.05mm 양면 끈적끈적한 4웰 스페이서를 놓습니다.오가노이드와 함께 10마이크로리터의 세척 용액을 하나의 웰에 추가하고 스페이서 위에 커버 슬립을 놓습니다. 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다. 식도 전구 세포는 고도로 통합된 베타 4 및 e-cadherin 발현에 따라 분류됩니다.상피 세포 분리의 대표적인 유세포 분석 플롯은 모든 단일 세포에서 살아있는 세포의 백분율을 보여줍니다. 모든 살아있는 세포로부터 단리된 인테그린 베타4 및 e-카데린 전구체 세포의 백분율이 여기에 제시되어 있다. 여기에 표시된 유세포 분석 플롯은 분리된 DPP4+ 및 Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포의 백분율을 나타냅니다.Pdgf 수용체 알파 H2 BEGFP 양성 섬유아세포와 공동 배양된 오가노이드를 사용한 명시야 이미지는 핵 EGFP 신호를 보여줍니다. 6일째 되는 날 전체 매트릭스 돔의 명시야 이미지가 여기에 표시됩니다. 오가노이드 형성 효율은 이 그래픽 이미지로 표현됩니다.각 점은 행렬 돔을 나타내고 막대는 조건당 모든 점의 평균을 나타냅니다. Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포와 공동 배양한 6일째 오가노이드의 명시야 및 형광 이미지가 여기에 표시됩니다. 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 이미지는 비멘틴 양성 섬유아세포가 오가노이드를 감싸고 밀접하게 접촉하는 오가노이드의 3D 표면을 보여줍니다.Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포가 있는 단일 및 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 염색은 뚜렷한 기저 및 기저상 세포 집단을 나타냅니다. 오가노이드 형성 효율 뿐만 아니라 오가노이드 크기는 공배양에 포함된 섬유아세포에 의해 영향을 받습니다. 다른 섬유아세포 하위 집단을 사용할 때 변형 및 결과가 예상됩니다.동일한 전략을 사용하여 마우스와 인간 모두에서 종양 관련 섬유아세포를 특성화할 수 있습니다.

functional-characterization-visualization-esophageal-fibroblasts

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 탈세포화된 돼지 골격 내에서 1차 인간 식도 섬유아세포와 편평 상피 세포를 공동 배양하여 인간 유기형 식도 구조를 생성하는 체외 배양 기술에 대해 설명합니다. 이러한 3D 배양 모델은 생체 내 조직 모델의 기능과 생리학을 모방합니다.

식도 3D 뗏목 배양 모델: 인간 식도 점막 모델을 생성하는 체외 배양 기술

우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

생체 재료 기술의 발전으로 3차원 다세포 유형의 구조를 개발할 수 있게 되었습니다. 우리는 기도의 주요 구조 세포를 배양하기 위해 3개의 개별 골격을 생산하여 기도 세기관지 벽의 3D 체외 모델을 제공하는 전기 방사 프로토콜을 개발했습니다.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델 

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

본 프로토콜은 종양 진행의 여러 단계를 나타내는 식도 오가노이드 모델의 확립 및 조직학적 분석을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정상 조직에서 암 조직으로 전환하는 동안 세포 형태, 공간 조직 및 분자 마커 발현 패턴의 변화를 연구할 수 있습니다.

정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

이 프로토콜은 식도 편평세포암(ESCC) 환자에서 동일한 환자에서 암세포, 암 관련 섬유아세포(CAFs), 비종양 관련 섬유아세포(CF)를 동시에 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 환자 맞춤형 자료의 활용은 환자 간 변동성 문제를 피하고 ESCC 연구에 적합한 실험 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

동일한 식도암 환자로부터 종양 오가노이드, 암 관련 섬유아세포 및 대응 섬유아세포의 형성

학습하세요 오가노이드-섬유아세포 공동 배양 기법을 통해 식도 전구세포와 섬유아세포 간 상호작용을 시각화하고 분석하는 방법을. 이 모델은 식도 생물학 및 암 연구에 활용됩니다.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화) (동영상) | JoVE Journal

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

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