Name: 제1형 당뇨병의 쥐 상처 모델을 구축하기 위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 학습하세요 스트렙토조토신으로 유도된 제1형 당뇨병 쥐 상처 모델 구축 방법을. 이 프로토콜은 혈관신생 감소와 재상피화 지연을 재현하여 당뇨병 상처 치유 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82104877)의 재정 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 모든 동물 실험은 청두 중의과 대학 관리위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호 2021-13).
1. 스트렙토조토신 주사제의 제조
<ol><li>생후 8주령에 체중이 220g± 20g인 SD 수컷 특이적 병원체가 없는(SPF) 쥐 15마리를 선택합니다. 간단한 무작위 배정 방법을 사용하여 쥐를 당뇨병 그룹 (n = 10)과 정상 그룹 (n = 5)으로 나눕니다.</li>
	<li>쥐의 초기 체중을 측정하고 55mg/kg의 투여를 통해 STZ의 용량을 결정합니다. 알림: 사전 실험에 따르면 55mg/kg이 최적의 STZ 용량입니다.</li>
	<li>STZ 분말의 무게를 정확하게 측정하고 차광 용기에 넣습니다.</li>
	<li>적절한 양의 0.1 mol/L 구연산 나트륨 완충액(pH 4.5)을 첨가하여 STZ를 1% 농도로 용해시킵니다. 알림: 구연산나트륨 완충액은 사용하기 전에 2°C 냉장고에서 4시간 동안 미리 냉각해야 합니다. STZ 용액의 준비는 무균 상태를 보장해야합니다.</li>
	<li>약물 발진기를 사용하여 30초 동안 흔들어 줍니다. 아이스 박스에 넣고 따로 보관하십시오. 알림: 주사는 15분 이내에 사용해야 합니다.</li>
</ol>2. T1DM 모델의 유도
<ol><li>STZ 주사 전에 쥐를 18 시간 동안 금식시키고 물에 자유롭게 접근 할 수 있도록하십시오.</li>
	<li>1 % STZ 용액을 복강 내 주사하십시오.<ol><li>쥐를 잡고 복부 피부와 주사 부위 (두 허벅지의 뿌리와 복부의 정중선을 연결하는 선의 교차점)를 노출시킵니다.</li>
		<li>75% 알코올에 적신 면봉을 사용하여 주사 부위를 두 번 소독합니다(시계 방향으로 한 번, 시계 반대 방향으로 한 번). 쥐의 머리를 복부 아래에 놓습니다.</li>
		<li>바늘을 복부 정중선과 평행하게 45° 각도로 삽입하고 피부를 뚫은 후 바늘 각도를 30°로 줄인 후 바늘을 2-3mm 삽입합니다. 바늘 플러그를 부드럽게 당겨 혈액이나 액체가 주사기로 빨려 들어가지 않도록 합니다. STZ 용액을 주입하고 바늘을 빼낸 다음 면봉으로 출혈을 멈춥니다. 알림: 노란색 액체가 주사기로 다시 당겨지면 바늘이 방광을 관통했을 수 있으며 짙은 녹색 액체를 뽑으면 바늘이 대장이나 맹장을 관통했을 수 있습니다. 두 경우 모두 바늘을 즉시 제거해야 합니다. 동물은 수의사가 평가해야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>STZ 유도 후 09일째 00일과 3일째 오전 7시에 캐주얼(비공복 또는 공복) 혈당 수치를 측정합니다. 알림: 무작위로 혈당을 측정하는 시간은 고정되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 오전 09:00에 고정됩니다. 그러나 사용 된 유일한 시간은 아닙니다. 바늘 구멍에 의해 꼬리 정맥에서 채취 한 혈액은 절단 된 꼬리에서 채취 한 혈액보다 조직액에 덜 민감하므로 혈당 값이 더 정확합니다.<ol><li>쥐 고정제를 사용하여 쥐를 고정시킵니다(그림 1).</li>
		<li>꼬리 정맥의 위치를 찾으십시오. 75 % 알코올에 적신 면봉을 사용하여 쥐의 꼬리를 두 번 소독하십시오.</li>
		<li>꼬리 정맥에 구멍을 뚫어 출혈을 유도하고 혈당계를 이용하여 혈당을 측정한다. 면봉으로 출혈을 멈추십시오. 참고: STZ 주사 후 16.7일째에 7mmol/L보다 높은 포도당 수치는 T1DM으로 간주됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>매주 쥐의 체중을 측정하고 혈당 수치와 식단, 물 섭취량 및 소변량을 포함한 기타 매개변수를 측정합니다.</li>
	<li>STZ 유도 후 8주 동안 동물에게 정상적으로 먹이십시오.</li>
</ol>3. 상처 모델의 구성
<ol><li>상처 모델링 1 일 전에 전기 면도기로 쥐를 면도하십시오. 쥐의 등쪽에 5cm x 5cm의 면도 부위가 일반적으로 이상적입니다.</li>
	<li>면도한 부위를 따뜻한 생리식염수로 닦고 건조시킨 후 제모 크림을 5분간 발라줍니다. 거즈로 해당 부위를 청소하고 따뜻한 생리 식염수로 잔여 제모 크림을 씻으십시오.</li>
	<li>쥐의 체중을 측정하고 35mg/kg 표준을 기준으로 Nembutal의 필요한 용량을 계산합니다. 생리 식염수를 사용하여 Nembutal을 3 % 농도로 녹입니다. 케타민/자일라진 또는 이소플루란과 같은 다른 전신 마취제를 이 절차에 사용할 수 있습니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 협력하여 무엇이 최선인지 확인하십시오. 알림: 효능을 보장하려면 용액을 새로 준비해야 하며 Nembutal 분말과 용액을 빛으로부터 보호해야 합니다.</li>
	<li>마취 전에 12 시간 동안 쥐를 금식시킵니다. 마취를 복강 주사하십시오. 마취 투여 후 안구 건조를 예방하기 위해 테트라사이클린 눈 연고 또는 일반 눈 윤활제를 사용하십시오. 참고: 쥐의 근육이 비교적 이완되고, 안구 운동이 사라지고, 호흡이 규칙적이고, 고통스러운 자극에 대한 반응이 작을 때 마취는 중등도로 간주되었습니다.</li>
	<li>요오드에 적신 면봉 (시계 방향으로 한 번, 시계 반대 방향으로 한 번)과 75 % 알코올 (대체 라운드)을 사용하여 등쪽 피부를 두 번 소독하십시오.</li>
	<li>건조 후 직경 20mm 원형 생검 펀치로 피부를 자릅니다.</li>
	<li>멸균 집게로 피부를 텐트 한 다음 멸균 수술 용 가위를 사용하여 펀치 컷 마크를 따라 전체 두께의 피부를 제거합니다. 생리 식염수 면봉으로 출혈을 멈추십시오. 참고: 상처의 위쪽 경계는 하부 견갑골 경계에서 5-10mm, 쥐 척추의 오른쪽/왼쪽으로 5-10mm에 있어야 합니다(그림 2). 상처는 두 개의 상처가 구성될 때 척추를 따라 대칭입니다.</li>
	<li>바셀린 거즈를 사용하여 상처를 덮고 고무 테이프로 고정된 거즈와 통기성 붕대로 감쌉니다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 하루에 한 번 카프로펜을 피하(5mg/kg) 주사합니다. 상처 붕대를 하루에 한 번 교체하십시오 (통증 완화를 위해 카프로펜 사용). 알림: 붕대를 감은 후 쥐의 움직임과 호흡에 이상이 있는지 관찰하고 통기성 붕대가 적절하게 조여졌는지 확인하십시오.</li>
	<li>상처 아래에 자를 놓고 14일까지 디지털 카메라로 상처를 촬영합니다. 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 14일째에 쥐를 안락사시킵니다. 상처 가장자리에서 5mm 떨어진 상처 피부 조직을 자릅니다. 조직 샘플을 두 부분으로 나누고 PBS로 세척하여 눈에 보이는 혈액 얼룩을 제거한 다음 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정합니다.</li>
</ol>4. ImageJ 소프트웨어를 사용한 상처 부위 계산
<ol><li>소프트웨어를 연 후 파일 버튼을 클릭한 다음 드롭다운하고 열기 를 클릭하여 상처 사진을 엽니다.</li>
	<li>직선 도구를 선택하고 상처 그림에서 눈금자를 따라 1cm의 직선을 그립니다.</li>
	<li>해석(Analyze) 메뉴에서 배율 설정(Set Scale) 명령을 클릭하고 알려진 거리(Known distance) 를 1 로 설정합니다.</li>
	<li>[자유형 선택 도구]를 선택하고 그림에 상처의 윤곽을 스케치합니다.</li>
	<li>분석 메뉴에서 측정 명령을 클릭하고 결과가 나타난 후 영역 값을 읽습니다.</li>
</ol>5. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
<ol><li>고정액에서 피부 조직을 제거하고 흄 후드에 메스로 얇은 부분으로 자르고 탈수 카세트에 넣습니다.</li>
	<li>탈수 카세트를 탈수 기계에 넣고 다음 단계에서 조직을 탈수하십시오 : 4 시간 동안 75 % 알코올; 2 시간 동안 85 % 알코올; 2 시간 동안 90 % 알코올; 1 시간 동안 95 % 알코올; 무수 에탄올 I 및 II를 각각 30분; 5-10 분 동안 알코올 벤젠; 크실렌 I 및 II를 각각 5-10 분; 왁스 I, II 및 III을 각각 1시간 동안 사용합니다.</li>
	<li>티슈를 왁스에 묻습니다. 냉동조대에서 -20°로 식히고 왁스 블록을 깔끔하게 보정합니다.</li>
	<li>파라핀 절편기를 사용하여 왁스 블록을 세로로 3μm 두께의 절편으로 자릅니다.</li>
	<li>섹션을 크실렌 I 및 II에 각각 20분, 무수 에탄올 I 및 II에 각각 5분, 수돗물에 5분 동안 순차적으로 담근다.</li>
	<li>3-5분 동안 헤마톡실린 얼룩으로 조직을 범람시키고, 0.5% 염산 수용액 분화, 0.5% 암모니아 수용액으로 다시 파란색으로 만들고 물로 헹굽니다.</li>
	<li>조직 절편을 85 % 및 95 % 알코올로 탈수하십시오. 조직을 에오신 염색 용액으로 5분 동안 침수합니다. 참고: 일반적으로 에오신 염색은 30초에서 2분 정도 소요되며 염색 결과 및 요구 사항에 따라 시간을 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>무수 에탄올 I, 무수 에탄올 II, 무수 에탄올 III, 자일렌 I 및 크실렌 II를 각각 5분 동안 다음 용액으로 섹션을 순차적으로 탈수합니다. 마지막으로 유리 슬라이드를 중성 발삼으로 덮습니다.</li>
	<li>H&E로 염색된 조직을 현미경으로 40x, 20x, 10x로 검사하고 사진을 찍어 각 슬라이드의 대표 이미지를 유지합니다.</li>
</ol>6. CD31 면역형광염색
<ol><li>조직 절편을 크실렌 I 및 II에 각각 15분, 무수 에탄올 I 및 II에 각각 5분, 85% 알코올에 5분, 75% 알코올에 5분 동안 담그고 증류수로 헹굽니다.</li>
	<li>항원 복구<ol><li>pH 6.0의 적당한 10mM 구연산 완충액을 전자레인지 용기에 넣고 센 불로 가열한 다음 유리 슬라이드를 넣습니다.</li>
		<li>중불에서 8분간 끓이다가 8분간 끓인 후 다시 중불에서 7분간 끓인다.</li>
		<li>슬라이드를 식히고 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 셰이커를 사용하여 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>원에 5% 염소 혈청을 한 방울 떨어뜨리고 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>폐쇄 용액(5% 염소 혈청)을 부드럽게 털어내고 토끼 항-CD31 항체(PBS를 사용하여 1:200 비율로 희석)를 섹션에 적가합니다. 절편을 젖은 상자에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>슬라이드를 탈색 진탕기 상에서 PBS(pH 7.4)로 각각 5분 동안 3회 세척한다. 섹션을 가볍게 흔들어 건조시킨 다음 FITC로 표시된 염소 항토끼 IgG를 원형으로 떨어뜨립니다. 실온에서 어둠 속에서 50분 동안 배양한다.</li>
	<li>슬라이드를 탈색 진탕기 상에서 PBS(pH 7.4)로 각각 5분 동안 3회 세척한다. 가벼운 흔들림으로 섹션을 자연 건조하고 DAPI 염색 용액을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 절편을 배양하십시오.</li>
	<li>절편을 건조시킨 후 PepPen으로 조직 주위에 원을 그리고(항체 손실을 방지하기 위해) 자가형광 소광제(0.3% 수단 블랙 B)를 원에 5분 동안 추가한 다음 흐르는 물에 10분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>슬라이드를 탈색 진탕기 상에서 PBS(pH 7.4)로 각각 5분 동안 3회 세척한다. 섹션을 약간 흔들고 페이드 방지 장착 매체로 밀봉합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 단면을 40x, 20x 및 10x로 관찰하고 사진을 찍습니다. 참고: DAPI UV 여기 파장은 330-380nm이고 방출 파장은 420nm(청색광)입니다. FITC 여기 파장은 465-495 nm이고 방출 파장은 515-555 nm (녹색광)입니다.</li>
</ol>7. 통계 분석
<ol><li>SPSS를 사용하여 데이터를 수집하고 분석합니다.</li>
	<li>데이터를 평균 ± 표준 편차로 보고합니다.</li>
	<li>독립 표본 t-검정을 사용하여 당뇨병 그룹과 정상군 간의 차이를 분석합니다.</li>
	<li>통계적 유의성을 **p < 0.01 및 *p < 0.05로 설정합니다.</li>
</ol>

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<li>Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+STZ-induced+impaired+wound+healing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells+not+only+ameliorate+blood+glucose+but+also+protect+vascular+endothelium+from+diabetic+damage+through+a+paracrine+mechanism+mediated+by+MAPK%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258(2022).</li>
<li>Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+animal+models+from+2015+to+2020+for+preclinical+chronic+wounds+relevant+to+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health.</a> Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).</li>
</ol>

모든 저자는 이 원고에 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 T1DM 상처 모델링에서 논쟁의 여지가 있는 작업을 명확히 합니다. STZ 주사 프로토콜, T1DM 유도 성공 기준, 혈당 안정화 시간, 상처 위치 및 크기에 대한 우려가 이 작업에서 해결되었습니다. 또한, T1DM 상처 치유 평가를 위한 병리학적 특성 및 측정 가능한 매개변수가 명확해졌습니다.
쥐는 STZ의 효능에 영향을 미칠 수 있는 β 세포에 대한 포도당 또는 그 유사체의 경쟁적 결합을 피하기 위해 STZ 주사 전에 18시간 동안 금식했습니다. T1DM을 유도하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 단일 고용량의 STZ이며, 이는 섬을 손상시키고 인슐린 분비를 감소시켜 혈당을 증가시킨다21. 실험 전 시험에서 높은 성공률과 낮은 사망률에 대한 최적의 STZ 용량은 55mg/kg으로 이전 연구에서 보고된 최적 용량보다 낮은 것으로 나타났습니다22,23,24. 이 프로토콜에서 T1DM은 55mg/kg STZ의 단일 복강내 주사를 사용하여 유도되었습니다.
혈당 수치는 STZ 주사 3일 후 모두 16.7mmol/L 이상이었습니다. 그러나 STZ 주사 후 7일째에 혈당 수치가 16.7mmol/L보다 높으면 쥐마다 섬 손상 정도가 다르고 진단 시간을 적절하게 연장하면 위음성률을 줄일 수 있기 때문에 성공적인 T1DM 모델링을 위한 권장 기준입니다. 또한, 혈당 변동은 STZ 주사 후 5 주 후에 안정화되었으며,이 기간 동안 쥐의 체중이 점차 증가하여 이전 결과25,26과 일치합니다. 이는 T1DM 모델의 혈당 수준이 최소 6주 동안 안정화되어야 하고, 6주 후 쥐 체중의 증가가 상처 모델링 동안 사망률을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 따라서 이 프로토콜은 STZ 주사 후 8주에 상처 모델링을 수행했습니다.
상처 후 7일째와 14일째의 상처 봉합률은 정상 상처군보다 당뇨병 환자에서 유의하게 낮았으며, 이는 느린 치유를 나타냅니다. 또한, 상처 재상피화 및 혈관신생은 정상군보다 당뇨병 환자에서 유의하게 낮았다. 이는 T1DM 상처 모델이 정상 쥐에서보다 느린 상처 치유 및 지연된 재상피화를 나타낸다는 것을 보여주며, 이는 감소된 상처 혈관신생의 병리학적 변화와 관련될 수 있습니다. 그러나 14일째에는 T1DM 상처 치유율도 90% 이상이었는데, 이는 인간 당뇨병성 상처의 만성 비치유 특성과 다릅니다. 설치류의 상처 치유 생리학적 기전이 인간의 생리학적 기전과 다르기 때문일 수 있다27. 결과적으로 최상의 상처 직경은 최소 20mm이며, 이는 당뇨병성 상처 연구에서 중재의 효능을 평가할 시간을 허용할 만큼 충분히 큽니다. 상처 위치는 견갑골과 척추를 피해야 하며, 이 두 부위의 지속적인 움직임은 상처 치유를 방해할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜의 방법을 이용한 T1DM 상처 모델의 구축이 효과적이다. 이 프로토콜은 정상 쥐 상처에 비해 느린 상처 치유, 지연된 재상피화 및 혈관신생 감소와 같은 만성 당뇨병 상처의 일부 특성을 복제합니다. 그러나 모델이 당뇨병성 상처의 다른 만성 표현형을 복제할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 또한, 이 프로토콜은 쥐의 피부 수축 문제를 설명하지 않는 가장 기본적이고 널리 사용되는 방법을 설명합니다. 향후 연구에서는 상처 부목의 사용을 이 프로토콜에 통합하거나 만성 당뇨병 상처의 추가 모델을 탐색할 수 있으며, 이는 향후 연구자들에게 중요한 과제가 될 것입니다.

제1형 진성 당뇨병(T1DM)은 고혈당증과 췌장 β 세포의 파괴를 특징으로 하는 만성 대사 질환입니다1. T1DM 상처는 만성적으로 치유되지 않는 상처이며 인간에서 당뇨병의 가장 흔하고 치명적인 합병증이다 2,3. 동물 모델은 상처 치유 중 병리학적 변화와 잠재적 치료제의 안전성 및 효능을 연구하는 데 가장 적합한 프로토타입이다4. 다른 유형에 비해 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐는 스트렙토조토신(STZ)에 더 민감하고 관련 사망률이 낮아 당뇨병성 상처 연구에서 인기가 있습니다 5,6.
T1DM 상처 모델을 구성하기 위한 수많은 방법이 설명되었습니다. T1DM 모델과 관련하여 연구는 주로 STZ 주사 방법이 당뇨병 유도 성공률에 미치는 영향에 초점을 맞추었습니다 7,8. 그러나 모델링 프로세스는 이 동일한 단계의 일관되지 않은 작업으로 인해 어려움을 겪습니다. 한 연구에서 쥐는 STZ 주사 전에 18시간 동안 금식했습니다. STZ 주사 1주일 후 혈당 수치가 16.67mmol/L 이상인 쥐는 당뇨병으로 간주되었고, 3주 후에 당뇨병성 상처가 나타났다9. 반대로, 관련 연구에서 Zhu et al. STZ 주사 전 12시간 동안 쥐를 금식했습니다. 주사 후 72 시간에 혈당 수치가 16.7 mmol / L보다 높은 쥐는 당뇨병으로 간주되었고, 당뇨병 상처는 4 주 후에 도입되었다10. 전반적으로 STZ 주사 프로토콜, 당뇨병 진단 기준 및 상처 도입 시간에 불일치가 있습니다.
상처 모델링의 관점에서, 대부분의 연구에서, 성공적인 당뇨병 유도 후 T1DM 상처를 구성하기 위해 등쪽 피부의 전체 두께를 절제한다11,12,13. 이 모델은 쥐의 피부 구축에 취약하지만 노동 집약적이고 저렴하기 때문에 상처 치유 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다14,15. 그럼에도 불구하고 이 전층 절제 기술에 대한 방법 기반 연구는 부족합니다. 또한, 상처 크기 및 위치에 관한 기존 연구에는 균일한 기준이 없다12,16. 상처의 크기와 위치는 실험 설계의 일관성과 결과의 과학적 타당성에 간접적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구자들을 위한 참고자료로서 T1DM 유도 및 상처 모델링을 위한 표준 프로토콜이 절실히 요구되고 있다. 이 연구의 목표는 T1DM 상처 연구의 참조로 사용할 수 있는 T1DM 상처 모델링을 위한 특정 프로토콜을 시각화하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>퇴색 방지 장착 매체</td><td>Southern Biotechnology Associates, Inc.</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluo Quencher</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td> (주)<td>G1221</td><td></td></tr><tr><td>자동 슬라이드 염색기</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>바리스테인&트레이드; 쌍둥이 자리 ES</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>GB11063-2</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 항원 회수 솔루션</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Citotest Labware 제조 Co., Ltd.</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>서비스바이오 테크놀러지 주식회사</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>탈색 셰이커</td><td>Scilogex</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>광저우 Ruixin 생명 공학 Co., Ltd.</td><td>&엠대시;</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 벤젠</td><td>Chengdu Kelong 화학제품 Co., 주식 회사.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>약물 발진기</td><td>Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd.</td><td>VM-370</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd.</td><td>FC5908</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 머신</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>청두 Kelong 화학 Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Fitc 라벨이 붙은 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB22303</tr><tr><td>염소 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>16210064</tr><tr><td>Hematoxylin 및 eosin 염색 솔루션</td><td>Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>이미지 J 소프트웨어</td><td>국립 보건원</td> <td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>Midea Group Co., Ltd.&nbsp;</td><td>M1-L213B</td><td></td></tr><tr><td>미니 원심 분리기</td><td>Scilogex</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>중립 발삼</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>PBS 버퍼</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 혈당 측정기</td><td>Sinocare Inc.</td><td>GA-3</td><td></td></tr><tr><td>고속 조직 처리기</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>쥐 고정기</td><td>Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd</td><td>GEGD-Q10G1</td><td></td></tr><tr><td>슬라이싱 머신</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.</td><td>80312-3181</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 완충액</td><td>Beijing Solarbio Science & 공급자:Technology Co., Ltd.</td><td>c1013</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토조토신</td><td>시그마</td><td>57654595</td><td></td></tr></tbody></table>

제1형 당뇨병의 쥐 상처 모델을 구축하기 위한 프로토콜

A Protocol for Constructing a Rat Wound Model of Type 1 Diabetes

고용량의 스트렙토조토신을 한 번 주사한 후 쥐의 등쪽에 전층 피부 절제술을 하는 것은 제1형 당뇨병 상처의 동물 모델을 구성하는 일반적인 방법입니다. 그러나 부적절한 조작은 쥐의 모델 불안정성과 높은 사망률로 이어질 수 있습니다. 안타깝게도 제1형 당뇨병성 상처 모델링에 대한 기존 지침은 거의 없으며 세부 사항이 부족하고 구체적인 참조 전략을 제시하지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 제1형 당뇨병 상처 모델을 구성하기 위한 전체 절차를 자세히 설명하고 당뇨병 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 분석합니다. 제1형 당뇨병성 상처 모델링은 스트렙토조토신 주사의 준비, 제1형 당뇨병의 유도 및 상처 모델의 구축을 포함하는 단계를 포함한다. 상처 부위는 상처 발생 후 7일째와 14일째에 측정하고, 랫트의 피부 조직을 적출하여 조직병리학적 및 면역형광 분석을 하였다. 그 결과 55mg/kg 스트렙토조토신에 의해 유발된 제1형 당뇨병이 사망률이 낮고 성공률이 높은 것으로 나타났습니다. 혈당 수치는 유도 5주 후에 비교적 안정적이었다. 당뇨병성 상처 치유율은 7일째와 14일째에 정상 상처보다 현저히 낮았지만(p < 0.05), 둘 다 14일째에 90% 이상에 도달할 수 있었습니다. 정상군과 비교하여, 14일째에 당뇨병성 상처의 표피층 폐쇄는 불완전하였고, 재상피화를 지연시켰으며, 혈관신생이 유의하게 낮았다 (p < 0.01). 이 프로토콜을 기반으로 구축된 제1형 당뇨병성 상처 모델은 정상 쥐 상처에 비해 폐쇄 불량, 재상피화 지연, 혈관신생 감소 등 만성 상처 치유의 특성을 가지고 있습니다.

총 10마리의 SD 랫트를 단일 STZ 복강내 주사하여 T1DM 모델을 유도하였다. 1마리의 랫트가 조기에 사망했지만(10%), 모든 래트에서 당뇨병이 유발되었다(100%). STZ 주사 3일 후, 모든 쥐의 혈당 수치는 16.7mmol/L보다 높았고, 혈당 수치는 유도 후 5주 후에 안정화되었습니다(그림 3A). 당뇨병 그룹의 체중은 STZ 주사 후 점진적으로 증가했지만 3주차에 감소한 다음 4주차부터 다시 천천히 증가했습니다(그림 3B). 이에 반해 정상군에서는 쥐의 체중이 꾸준히 증가하였고, 당뇨 유발 3일 후의 평균 체중은 당뇨군보다 높았다(도 3B). 당뇨병 쥐는 모두 갈증, 다뇨증 및 체중 감소의 전형적인 증상을 나타냈으며, 이는 Hao et al.17의 결과와 유사합니다.
상처 발생 후 7일째 및 14일째에, 거시적 분석은 재상피화가 당뇨병 그룹보다 정상 그룹의 쥐에서 더 두드러지는 것으로 나타났다(도 4A). 정량적 결과는 7일째와 14일째에 정상군보다 당뇨병 환자군에서 상처 치유율이 현저히 낮았다는 것을 밝혀냈다(p &lt; 0.01). 그러나, 14일째에, 상처 치유율은 또한 당뇨병 그룹에서 90% 이상일 수 있었다(p &lt; 0.05, 도 4B). 이것은 T1DM 상처 모델이 열악한 폐쇄를 특징으로 하지만 인간 당뇨병 상처에서 볼 수 있는 만성 비치유 정도는 아님을 시사합니다.
상처 치유 14일째의 H&amp;E 염색은 정상 그룹에 비해 당뇨병 그룹에서 불완전한 상처 표피, 각질세포의 느린 증식 및 지연된 재상피화를 나타냈다. 당뇨병 상처는 모낭과 피지선의 부분적인 손실을 보였다. 또한 눈에 보이는 모세혈관도 더 적었습니다(그림 5).
당뇨병은 내피 세포 기능 장애, 세포외 기질 단백질의 당화, 혈관 탈신경화를 유발한다18. 이러한 합병증은 당뇨병성 상처에서 정상보다 낮은 상처 혈관신생을 초래한다18. 혈관신생은 상처 치유에 필요하며, 상처 혈관신생은 CD31 면역염색에 의해 자주 분석됩니다(그림 6A)19,20. CD31 발현의 평균 광학 밀도 (AOD)에 기초하여, 상처 부위에서의 혈관신생은 당뇨병 그룹에서보다 정상에서 유의하게 더 높았다 (p &lt; 0.01, 도 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig01.jpg"> 그림 1: 고정 장치에 의해 고정된 쥐의 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig02.jpg"> 그림 2: 쥐 상처 위치의 다이어그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig03.jpg"> 그림 3: 실험 쥐의 혈당 수치와 체중. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig04.jpg"> 그림 4: 실험용 쥐의 등에 있는 전층 피부 상처(직경 20mm). (A) 0일, 7일, 14일째 상처의 거시적 모습. 0일, 7일, 14일의 상처 형태 이미지를 디지털 카메라로 캡처했습니다. (B) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 상처 면적을 측정하고 상처 치유율을 계산하는 데 사용했습니다. 상처 치유율(%)은 다음과 같이 계산하였다: (초기 상처 면적 - 지시된 시점에서의 상처 면적)/초기 상처 면적 × 100. 값은 평균 ± SD(n = 14)로 표시됩니다. 통계적 유의성은 **p &lt; 0.01 및 *p &lt; 0.05로 설정하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig05.jpg"> 그림 5: 상처 형성 후 14일째의 대표적인 조직병리학적 H&amp;E 이미지. 파란색 화살표는 모세혈관을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 각질세포의 증식을 나타냅니다. 왼쪽 눈금: 막대 1개 = 200μm; 오른쪽 스케일: 1bar = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig06v2.jpg"> 도 6: CD31의 발현에 대한 면역형광염색 분석. CD31 수준을 사용하여 혈관신생의 상태를 측정하였다. (A) 당뇨병 및 정상군에서 CD31 면역형광 염색의 대표 이미지. 각 피부 샘플에 대한 통합 광학 밀도(IOD) 값과 픽셀 면적(AREA)은 Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어로 계산되었습니다. 평균 광학 밀도(AOD) 값(AOD = IOD/AREA)도 도출되었습니다. AOD 값은 CD31의 양성 발현에 정비례하였다. (B) 당뇨병 환자와 정상군에서 CD31 양성 발현의 정량적 비교. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. ** p &lt; 0.01. 스케일: 막대 1개 = 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig06largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

수컷 SD 쥐의 스트렙토조토신 유발 당뇨병성 상처 모델은 현재 제1형 당뇨병의 상처 치유를 연구하는 데 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 프로토콜은 이 모델을 생성하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 또한 잠재적인 문제를 제시 및 해결하고 당뇨병성 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 검사합니다.

A single high dose of streptozotocin injection followed by full-thickness skin excision on the dorsum of rats is a common method for constructing animal ...

제1형 당뇨병 상처 모델링 프로세스의 많은 세부 사항은 오류가 발생하기 쉽습니다. 경험 많은 연구자에게는 어려운 도전입니다. 따라서 이 프로토콜을 활용해야 합니다.가능한 가장 간단한 방법으로 이 기술은 상처 치유 없음, 지연된 재상피화 및 혈관신생 감소와 같은 만성 당뇨병 상처의 일부 특성을 효과적으로 복제할 수 있습니다. 스트렙토 조토신 용액은 준비 직후에 사용해야합니다. 상처를 만들 때 상처의 크기와 위치를 조절해야합니다.스트렙토 조토신 분말을 리터당 0.1 몰의 적절한 양으로 구연산 나트륨 완충액에 용해시켜 1 %의 농도를 달성하고 좋은 상자에 넣기 전에 약물 발진기를 사용하여 30 초 동안 흔들어줍니다. 1 % 스트렙토 조토신 용액의 복강 내 주사의 경우, 쥐를 잡고 주사 부위의 복부 피부를 노출시킨다. 75% 알코올에 적신 면봉을 사용하여 주사 부위를 두 번 소독하고 쥐의 머리를 복부 아래에 놓습니다.바늘을 복부 정중선과 평행하게 45도에 삽입합니다. 그런 다음 바늘 각도를 30도까지 줄이고 2-3 밀리미터를 삽입하십시오. 면봉을 바르기 전에 바늘 플러그를 부드럽게 당기고 스트렙토 조 토신 용액을 주입하고 바늘을 빼냅니다.3일차와 7일차 오전 9:00에 인과 혈당 수치를 측정하려면 꼬리 정맥의 위치를 찾으십시오. 꼬리 정맥에 구멍을 뚫어 출혈을 유도하기 전에 75% 알코올을 사용하여 쥐 꼬리를 두 번 소독하고 혈당계를 사용하여 혈당을 측정합니다. 완료되면 면봉으로 출혈을 멈춥니다.상처 모델링 하루 전에 전기 면도기로 쥐의 등쪽에 있는 5 x 5cm 영역을 면도합니다. 면도한 부위를 따뜻한 생리식염수로 닦고 건조시켜 제모 크림을 5분 동안 바릅니다. 거즈로 해당 부위를 청소하고 따뜻한 생리 식염수로 잔여 제모 크림을 씻으십시오.그런 다음 요오드에 적신 면봉을 사용하여 등쪽 피부를 두 번 소독하고 대체 라운드에서 75% 알코올을 사용합니다. 건조 후 직경 20mm의 원형 생검 펀치로 피부를 자릅니다. 집게로 피부를 관리한 다음 수술용 가위를 사용하여 펀치 컷 마크를 따라 피부의 전체 두께를 제거합니다.완료되면 생리 식염수 면봉으로 출혈을 멈춥니다. 바셀린 거즈를 사용하여 상처를 덮으십시오. 당뇨병은 스트렙토조토신 주사 3일 후에 모든 래트에서 유도되었으며, 혈당 수준은 리터당 16.7밀리몰 이상이었다.포도당 수준은 유도 5주 후에 안정화되었다. 당뇨병 그룹의 체중은 스트렙토 조토신 주사 후 점차 증가했다. 체중은 3주차에 감소했다가 4주차부터 다시 서서히 증가했습니다.대조적으로, 정상 그룹 쥐의 체중은 꾸준히 증가하였다. 당뇨병 유도 3일 후의 평균 체중은 당뇨병 그룹보다 높았다. 상처 후 7 일과 14 일에 수행 된 거시적 분석은 재 상피화가 당뇨병 그룹보다 정상 그룹의 쥐에서 더 두드러지는 것으로 나타났습니다.7일차와 14일차의 정량적 결과는 당뇨병 환자군에서 정상군보다 상처 치유율이 현저히 낮은 것으로 나타났다. 그러나 14일째 되는 날에는 당뇨병 환자군에서 상처 치유율이 90%를 상회하였다. 당뇨병 상처는 눈에 보이는 모세혈관이 더 적은 모낭과 피지선의 부분적인 손실을 보여주었습니다.CD31 면역염색에 의해 분석된 상처 혈관신생에서, CD31 발현의 평균 광학 밀도는 상처 부위에서의 혈관신생이 당뇨병 환자군에서보다 정상군에서 유의하게 더 높은 것으로 나타났다. 상처를 모델링할 때 표피, 진피 및 피하 조직을 포함하여 전방 두께의 피부가 제거되었는지 확인합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 중앙 동맥과 신경 및 두개골 neurovascular 번들을 나누어 토끼 허혈성 귀에 상처 모델을 만들려면 최소한 침략적 기법을 개발했습니다. 피하 터널 그러면 모두 피하 조직이 생기죠. 이 절차는 최소한의 피부에 혼란을 초래하고 안전하게 당뇨병 동물에서 사용할 수 있습니다.

허혈성 상처 모델 생산을위한 단순화된 테크닉

생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.

상처 치유의 생쥐 모델

쥐가 크기 때문에, 가용성, 오히려 유순 한 행동에, 몇 년 동안 연구 모델로 이용되고있다. 이 프로토콜의 목적은 만성 상처의 병태 생리에 대한 통찰력을 제공하는 허혈성 상처 치유 피부 모델로서 쥐를 이용하는 것이다.

쥐 허혈성 피부 상처 모델의 데모

지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

만성 상처는 전체 두께 의 상처 후 산화 스트레스의 높은 수준을 유도하여 당뇨병 마우스 모델에 급성 상처에서 개발된다. 상처는 카랄라제와 글루타티온 과산화효소에 대한 억제제로 처리되어 피부 미생물군유전체에 존재하는 박테리아에 의한 치유 및 생물막 발달을 방해합니다.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

쥐 모델에 임플란트를 배치하는 것은 임상 연구에 필수적인 실험 절차입니다. 이 연구는 당뇨병 및 골다공증이 있는 쥐 모델의 경골에 티타늄 임플란트를 이식하기 위한 포괄적인 수술 프로토콜을 제시합니다.

당뇨병 및 골다공증의 쥐 경골 모델을 위한 외과적 뼈 이식 기술

치유 과정의 다양한 단계에서 생리학적 또는 병리학적 조건에서 다양한 치료제를 평가할 수 있는 쥐 피부 상처 모델이 기술되었습니다. 또한, 조직 복구 기간 동안 상처 수축 속도를 모니터링하기 위한 수동 평면측정 프로토콜도 상세히 안내되어 있습니다.

쥐 수술 피부 상처 모델: 상처 치유 연구 및 생체재료 평가를 위한 접근법

이 비디오는 여러 스토리지 형식으로 인간의 췌장을 처리를위한 해부 절차를 보여줍니다. 해부 학적 방향이 지역의 섬 조성 및 밀도의 정의를 허용하도록 췌장 영역에 걸쳐 유지됩니다.

인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을...

당뇨병과 신진 대사 메모리의 Zebrafish 모델

쥐의 혈당과 Intralipid 만성 주입을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 모델은 기관의 기능과 생리 학적 매개 변수에 대한 영양 과잉의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

쥐의 만성 영양 주입의 모델

학습하세요 스트렙토조토신으로 유도된 제1형 당뇨병 쥐 상처 모델 구축 방법을. 이 프로토콜은 혈관신생 감소와 재상피화 지연을 재현하여 당뇨병 상처 치유 메커니즘 연구에 활용됩니다.

제1형 당뇨병의 쥐 상처 모델을 구축하기 위한 프로토콜

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