냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

우리의 프로토콜은 수의학 및 생물 의학 연구를 위해 돼지 장 상피를 연구하는 도구를 제공합니다. 돼지의 장 오가노이드는 영양소 수송, 장벽 기능 및 숙주-미생물 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 돼지 장 상피 선와를 보존하여 나중에 3D 또는 2D 단층으로 오가노이드를 배양하는 데 사용할 수 있는 대량의 줄기 세포를 생성할 수 있습니다.

이 프로토콜은 공장에 대해 자세히 설명되어 있지만 십이지장, 회장 및 결장과 같은 다른 장 분절에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 900개의 냉동 크립트가 들어 있는 바이알을 빠르게 해동합니다. 크립트 용액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

실온에서 5분 동안 300 x g로 원심분리하고 상층액을 제거한다. 냉각된 팁으로 150 마이크로리터의 세포외 기질 또는 ECM을 첨가하여 ECM 25 마이크로리터당 150 크립트의 최종 농도를 얻는다. ECM에서 스크립트의 균질한 현탁액을 얻기 위해 위아래로 10회 피펫.

미리 예열된 48웰 플레이트에 웰당 25마이크로리터 방울로 6개의 웰을 시드합니다. ECM의 중합을 위해 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 30분 동안 배양합니다. 실온에서 배지의 배양 웰 당 250 마이크로 리터를 첨가하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양한다.

2-3 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 파종 10일 후 냉동 크립트에서 파생된 3D 오가노이드를 계대배양하기 위해 배양 배지를 제거하고 섭씨 37도에서 예열된 PBS 250마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션 후, PBS를 각 웰에서 섭씨 37도에서 10마이크로몰 암석 억제제로 보충된 250마이크로리터의 예열 효소 해리 시약으로 교체합니다.

P-1000 피펫으로 긁어내어 ECM의 오가노이드를 분리하고 5회 피펫팅하여 조심스럽게 균질화합니다. 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 5분 동안 배양한 후 위아래로 10회 피펫팅하여 세포를 해리합니다. 해리된 세포가 들어 있는 각 웰에 500마이크로리터의 DMEMc를 넣고 3밀리리터의 차가운 DMEMc가 들어 있는 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 최대 12개의 웰을 당깁니다.

섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1밀리리터의 차가운 DMEMc에 재현탁합니다. 세포 계수기를 사용하여 trypan blue에서 1-2로 희석하여 세포를 세십시오.

돔 당 3000 개의 살아있는 세포를 갖기 위해 필요한 양의 세포 용액을 원심 분리합니다. 얼음 위의 17개의 살아있는 세포당 3000마이크로리터의 차가운 DMEMc로 펠릿을 재현탁합니다. 필요한 수의 우물로 볼륨을 조정하십시오.

살아있는 세포 3000개당 33마이크로리터의 차가운 ECM을 천천히 추가합니다. 필요한 수의 우물로 부피를 조절하고 기포를 만들지 않고 균질화하십시오. 이어서, 예열된 24-웰 플레이트에서 웰 당 50 마이크로리터의 ECM 세포 현탁액을 갖는 웰을 보고, ECM의 중합을 위해 30분 동안 인큐베이션한다.

웰 당 500 마이크로 리터의 배양 배지를 첨가하십시오. 그런 다음 2-3 일마다 배양 및 배양 배지를 교체하십시오. 배양 삽입물을 코팅하기 위해, 차가운 PBS에서 밀리리터당 50 마이크로그램으로 희석된 콜라겐 IV를 함유하는 코팅 용액을 제조한다.

희석된 코팅 용액 150 마이크로리터를 각 세포 배양 삽입물에 첨가하고 밤새 또는 3시간 동안 배양한다. 분할 후 5일 후에 ECM이 있는 오가노이드를 P-1000 피펫으로 긁어 분리합니다. 배양 배지에서 피펫팅하여 조심스럽게 균질화하고, 얼음 위에 5 밀리리터의 차가운 DMEMc를 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다.

수집된 오가노이드를 섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g로 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인하고 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 예열 효소 해리 시약 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 오가노이드의 해리를 시작하기 위해 위아래로 10번 피펫.

효소 소화를 위해 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 10회 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 파쇄하고 얼음처럼 차가운 DMEMc 4ml를 추가합니다. 오가노이드 세포 펠릿을 1밀리리터의 DMEMc에 재현탁하기 전에 상층액을 원심분리하고 버립니다.

세포 계수기를 이용하여 트리판 블루로 세포를 계수하고, 배양 삽입물 당 10번째 세포에 2.5 곱하기 10을 시딩하는데 필요한 부피를 계산한다. 원심분리하여 배양 삽입물 당 5번째 세포의 2.5배에 해당하는 세포 현탁액의 필요한 부피를 원심분리한다. 원심분리하는 동안 배양 삽입물에서 코팅 용액을 조심스럽게 흡인하고 뚜껑 없이 후드 아래에서 5분 동안 건조시킵니다.

원심분리 후, 상층액을 버리고 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 필요한 부피의 2D 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 코팅된 투과성 멤브레인 상에 시드한다. 10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 500 마이크로리터의 2D 배지를 하부 구획에 추가하고 배양합니다.

멤브레인에서 고밀도의 세포가 관찰되어야합니다. 파종 후 하루 만에 에피컬 및 베이스 배지를 ROCK 억제제가 없는 새로운 2D 배지로 교체합니다. 매일 미디어를 바꾼다.

단층은 파종 후 언젠가 합류하여 실험에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 돼지 장에서 상피 선와를 채취하여 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 냉동 보존했습니다. 해동 후, 음와 줄기 세포를 ECM에 시딩하였다.

오가노이드는 3-4일 이내에 관찰되었으며 빠르게 성장하고 발아 구조가 발달했습니다. 해동 후 약 10일 후, 배양액을 확장하기 위해 오가노이드의 통과를 수행하였다. 배양의 최적 유지를 위해 포장에 사용되는 오가노이드는 성숙한 오가노이드에서 관찰되는 것처럼 루멘에 검은색 파편이 없는 깨끗하고 빈 루멘과 잘 정의된 가장자리를 제공해야 합니다.

세포는 하루 안에 완전히 합류하는 단층을 형성하고 형성하며, 이는 약 700 돔 평방 센티미터의 높은 경상피 전기 저항 (TEER)에 의해 확인됩니다. TEER은 3 일 동안 높게 유지됩니다. 액틴 염색은 상피 세포의 정점 측면이 3D 오가노이드에서 내강을 향하고 있음을 나타냅니다.

배양 삽입물에 시딩된 오가노이드 세포는 상피 세포의 합류 단층을 형성하며 정점 측면은 상부 구획을 향합니다. Occludin 염색은 3D 오가노이드 및 세포 단층에서 상피 세포의 정점 쪽에 밀착 접합부의 존재를 보여줍니다. 세포 단층을 시드하는 데 사용되는 오가노이드는 죽은 세포의 축적에 해당하는 검은색 파편 없이 빈 내강으로 투명하게 보여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

돼지 장 오가노이드의 단층은 기능 분석, 이미징 및 유전자 발현 분석을 사용하여 상피 장벽 기능에 대한 대사 산물 또는 미생물의 영향을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.