Name: 냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 배우세요 냉동보존 상피선에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드 배양 및 세포 단층 확립 방법을. 이 기술은 영양소 수송, 장벽 기능, 숙주-미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Institut Carnot France Futur Elevage ( "OrganoPig"프로젝트)와 INRAE HOLOFLUX ( "Holopig"프로젝트)의 지원을 받았습니다. 저자는 Genotoul 핵심 시설(TRI)에 감사드립니다. 신중한 교정을 해주신 Christelle Knudsen(GenPhySE, INRAE, Toulouse)에게 감사드립니다.

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이 프로토콜은 3D 오가노이드의 장기 보관 및 후속 배양을 위해 새끼 돼지 장에서 상피 선와를 냉동 보존하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 DMSO, FBS, Y27632 ROCK 억제제, DMEM 및 항생제를 포함하는 동결 용액을 사용합니다. 돼지를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 유사한 동결 용액에 냉동 보존된 지하실에서 오가노이드를 얻었지만 ROCK 억제제는 없었습니다15. Y27632 ROCK 억제제는 해동 후 상피 선와 세포가 해리되어 세포 사멸('anoikis')을 유발할 수 있기 때문에 세포자멸사를 방지하고 줄기 세포 풀을 유지하기 위해 포함되었습니다('anoikis')27,28. 흥미롭게도, 말 엔테로이드는 DMEM 및 DMSO16만을 함유하는 배양 배지에서 냉동된 상피 선와로부터 얻어졌다; 이 간단한 방법은 아직 돼지 상피 선와에 대해 테스트되지 않았습니다. 상피 궤도 대신 냉동 조직 또는 생검에서 인간 및 돼지 오가노이드를 성장시키는 다른 방법이 발표되었습니다 4,17. 이 방법의 장점은 시간과 실험실 장비가 필요한 지하실 분리 절차를 수행하지 않고 장 조직을 직접 냉동 보존 할 수 있다는 것입니다. 이것은 조직을 실험실에서 멀리 떨어진 곳에서 수집해야 할 때 편리할 수 있습니다. 그러나, 도축 직후에 선와를 분리 할 때, 장의 큰 부분은 매우 많은 수의 선와를 얻기 위해 처리 될 수 있으며, 이는 작은 냉동 조직 조각에서 시작할 때가 아닙니다. 상피 선와가 해동된 후, 파종 후 3-4일째부터 오가노이드를 관찰하고 10일 후에 분할하였다. 이는 신선한 상피 선와에서 배양을 시작할 때보다 성장 속도가 느리며, 이에 대해 오가노이드는 파종 후 1일째부터 얻었으며 일반적으로 약 5일째에 분할될 수 있습니다11. Khalil et al. 또한 냉동 지하실에서 시작할 때 돼지 엔테로이드의 성장이 지연된다고 보고했다15, 이는 줄기 세포가 증식 능력을 회복하는 데 시간이 필요할 수 있음을 시사한다. 우리는 또한 신선한 선와에 비해 냉동 선와에서 시작할 때 더 적은 수의 오가노이드를 얻었는데, 이는 냉동 과정에서 줄기 세포의 죽음으로 인한 것일 수 있습니다. 지하실 해동의 일부 시도(<20%)에서 우리는 아마도 차선의 냉동 보존 절차(예: 아마도 1시간 이상의 선와를 분리한 후 지연된 동결)로 인해 냉동 지하실에서 오가노이드를 얻지 못했습니다. 따라서 세어 볼 때까지 지하실을 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 얼리는 것이 좋습니다.
3D 오가노이드의 경우 인간을 위해 제조된 상업용 오가노이드 배양 배지를 사용하기로 결정했습니다. 실제로 이전 보고서에 따르면 돼지 장 오가노이드는 이 배지 8,11,14,19,25,26,29,30으로 효율적으로 성장합니다. 이 배양 배지는 즉시 사용할 수 있고 배치 내에서 표준화된 농도의 성장 인자를 갖는 것이 중요합니다. 그러나, 이 배양 배지는 비용이 많이 들고, 그 조성은 개시되지 않았으며, 따라서 그 조성을 조절하는 것은 불가능하다. 대조적으로, 다른 연구에서는 약리학적 억제제, 재조합 성장 인자 및/또는 조건 배지를 포함하는 맞춤형 배지에서 돼지 장 오가노이드를 배양했습니다 5,6,7,21. 이 방법은 매우 유연하고 저렴하지만 컨디셔닝 매질을 생산하는 데 시간이 많이 걸리고 컨디셔닝 매질에서 성장 인자 농도의 잠재적 변동성으로 인해 재현성이 부족할 수 있습니다. 따라서, 컨디셔닝 배지의 각 배치의 품질은 오가노이드 성장 또는 마커 유전자 발현을 측정하여 검증되어야 한다31.
한 연구에 따르면 여기에 사용된 것과 동일한 상업용 오가노이드 배양 배지에서 배양된 돼지 공장 오가노이드는 재조합 성장 인자 및/또는 컨디셔닝 배지를 함유한 배지로 배양한 엔테로이드에 비해 더 빨리 성장하고 덜 분화된 것으로 나타났습니다23. 높은 증식 상태는 3D 오가노이드의 배양을 용이하게 하지만 장내 생리학적 특성을 더 잘 나타내기 위해 분화 유도가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 3D 오가노이드의 통과를 위해 세포가 계수를 위해 완전히 해리되어 ECM에 시딩된 세포의 수를 제어할 수 있습니다. 이것은 오가노이드의 표현형의 재현성을 증가시키며, 이는 밀도에 크게 영향을 받습니다. 또한, 세포 수를 세면 배양 일정을 조정해야 하는 너무 낮거나 과밀한 배양을 얻는 것을 방지할 수 있습니다. 대부분의 다른 연구에서는 단일 세포에 완전히 해리되지 않은 오가노이드 단편을 준비하고 계대 배양을 위해 희석 비율을 사용했습니다. 이 방법은 더 간단하지만 배양의 오가노이드 밀도에 따라 변동성을 유발할 수 있습니다.
단층 배양의 경우, 오가노이드 세포는 ECM의 얇은 층으로 미리 코팅된 배양 삽입물에 시딩되어 세포의 부착을 허용하지만 3D에서 오가노이드의 성장을 방지합니다. 이 프로토콜은 이전에 돼지23에서 설명한 바와 같이 콜라겐 IV형을 ECM 단백질로 사용했습니다. 돼지 오가노이드 단층을 사용한 다른 연구에서는 3D 오가노이드 6,8,9,21,25,30을 배양하기 위해 여기에 사용된 것과 동일한 종양 유래 ECM을 사용했습니다. 콜라겐 사용의 장점은 종양 유래 ECM의 경우와 달리 완전히 정의된 조성으로 단백질 농도를 표준화할 수 있다는 것입니다. 세포 단층 배양의 성공을 위한 중요한 단계는 전구체 3D 오가노이드의 시각적 외관에 주의를 기울이는 것인데, 이는 가장자리가 잘 정의되어 있고 검은색 파편이 없는 빈 루멘이 있어야 합니다. 실제로, 성숙도가 높고 증식률이 낮은 오가노이드는 2D 배양을 위한 적절한 세포 공급원이 아닙니다. 따라서 3D 오가노이드가 단일 세포로 해리되는 시기는 이 단계의 성공에 매우 중요합니다.
단일 세포에서 2D 단층을 배양하면 시딩된 세포 수를 표준화할 수 있으며, 이는 다른 방법에서 수행되는 것처럼 오가노이드 단편에서 시작할 때 더 어렵습니다. 우리는 cm2 당 7.6 x 10 5 세포를 시딩했는데, 이는 cm2 당 0.25 x 10 5 세포에서cm2 당 1.78 x 10 5 세포에 이르는 낮은 세포 밀도를 사용한 돼지에서 대부분의 다른 연구21,22,23에 비해 높습니다. 많은 수의 오가노이드 세포가 필요하다는 것이 이 프로토콜의 한계를 구성하지만, 이를 통해 1일 후에 배양 삽입물을 완전히 덮는 융합 단층을 신속하게 얻을 수 있었습니다. 대조적으로, Vermeire et al.23은 더 낮은 밀도의 세포(0.25 x 10 5 cells/cm2에서 0.4 x 105 cells/cm2)로 4-7일 후에 합류성을 얻었습니다. 일부 연구에서는 바이러스 감염을 위해 배양 표면을 완전히 덮지 않은 돼지 오가노이드 세포 단층을 사용하기도했습니다 8,30. 이러한 조건에서 상피 세포의 정점 측면은 치료를 위해 접근할 수 있지만 영양소 흡수 또는 상피 투과성을 연구하는 것이 목적인 경우 완전히 합류하는 단층이 필요합니다.
오가노이드 세포 단층의 경우, 소 엔테로이드 유래 단층(zovine enteroid-derived monolayers)에 대한 최근 연구를 기반으로 20% FBS가 보충된 상업용 오가노이드 배양 배지가 사용되었다32. 우리의 테스트에서, 20 % FBS로 보충은 아마도 높은 성장 인자 요구 사항으로 인해 완전히 합류 단층을 얻기 위해 필요했습니다. 반대로, 동일한 상업적 매체를 사용하는 다른 연구에서는 추가 FBS 8,25,30 없이 완전한 합류도에 도달하지 못한 단층을 확립했습니다. 다른 연구에서도 돼지 오가노이드 세포 단층 배양을 위해 맞춤형 배지에 20% FBS 보충제를 사용했습니다21,22. 우리의 실험에서 TEER은 파종 후 1일(약 700 Ω·cm2)에 높고 3일째(약 1,500 Ω·cm2; 이것은 오클루딘의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 단단한 접합부의 형성과 일치합니다. Van der Hee et al. 공장 오가노이드 세포 단층21에 대해 72시간 동안 유사한 TEER 값을 얻었다. 그들은 또한 단층이 매일 배지 교체로 12-15일까지 유지될 수 있음을 입증했습니다. 대조적으로, 다른 연구에서는 돼지 오가노이드 세포 단층 6,22에 대해 훨씬 낮은 TEER 값(약 200 Ω·cm2)을 보고했습니다. 연구 간의 이러한 차이는 연구 된 장 세그먼트 또는 상피 분화에 영향을 미치는 데 사용되는 매체와 관련이있을 수 있습니다.
결론적으로, 냉동 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 성장시키기 위한 위의 프로토콜은 배양 작업의 조직을 용이하게 합니다. 살아있는 동물에서 신선한 조직을 얻을 필요가 없습니다. 또한 돼지 오가노이드에서 유래한 완전 융합 세포 단층을 3일 이내에 확립하는 방법도 설명합니다. 따라서 우리의 프로토콜은 수의학 또는 생물 의학 연구를 위해 돼지 장 상피를 연구하는 과학자들에게 유용한 자료가 될 수 있습니다.

장 상피는 내강 환경과의 경계면에서 소화 점막을 덮는 세포의 단층에 의해 형성됩니다. 이 위치는 줄기 세포와 여러 분화된 상피 세포 유형(흡수성, 장내분비 세포, 파네스 세포 및 잔 세포)의 존재에 의해 뒷받침되는 영양소 흡수 및 장벽 기능과 같은 다양한 기능과 관련이 있습니다1. 전통적으로 상피 세포 연구에 사용되는 불멸화 세포주는 장 상피의 세포 복잡성을 반영하지 않고 게놈 이상을 나타내기 때문에 큰 한계가 있다2. Sato et al.3에 의한 3 차원(3D) 오가노이드의 개발은 생리학적 관련성이 개선된 장 상피를 연구하기 위한 새로운 모델을 제공했습니다. 실제로, 장 오가노이드는 형질전환되지 않은 줄기 세포에서 유래하고 여러 세포 유형으로 구성되며 장 상피의 기능을 요약합니다. 장 오가노이드는 장 상피의 발달과 기능, 그리고 병원체, 영양소, 독소, 약물, 미생물군, 대사산물과의 상호작용을 이해하는 데 점점 더 많이 사용되고 있다2.
처음에는 인간과 생쥐를 위해 개발되었으나 장내 오가노이드 배양에 사용된 방법은 최근 돼지를 포함한 다른 종에도 적용되었다4. Gonzales et al.5는 공장으로부터 돼지 오가노이드를 최초로 배양하였다. 그 이후로, 돼지 오가노이드는 다른 장 분절(십이지장, 회장 및 결장)에 대해 설명되었으며6,7,8, 위치 특이적 표현형 9,10,11을 유지하는 것으로 나타났습니다. 돼지 장내 3D 오가노이드는 현재 영양소12,13 또는 장 감염 6,8,14의 효과를 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다.
대부분의 연구는 갓 분리된 상피 선와에서 시작하는 장 오가노이드의 배양을 설명했습니다. 그러나 이것은 특히 돼지와 같은 큰 동물과 함께 작업할 때 물류상의 이유로 항상 실현 가능한 것은 아닙니다. 실제로 돼지를 위한 동물 시설은 오가노이드를 배양하는 실험실에서 멀리 떨어져 있어 작업 조직이 복잡해집니다. 또한 오가노이드 배양은 시간이 많이 걸립니다. 따라서 예를 들어 서로 다른 장 분절 또는 여러 동물에서 여러 오가노이드 계통을 동시에 성장시키는 것은 실용적이지 않습니다. 이러한 문제를 피하기 위해 인간, 말 및 돼지를 대상으로 한 몇 가지 연구에서는 냉동 장 조직(또는 생검) 또는 분리된 상피 선와에서 오가노이드를 배양하는 방법을 설명했습니다 4,15,16,17. 이러한 방법을 사용하면 단일 동물의 여러 장 부분에서 장 상피 줄기 세포를 냉동 보존할 수 있으며, 필요할 때 오가노이드를 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이것은 줄기 세포의 기증자로 사용되는 살아있는 동물의 수를 크게 감소시킬 수 있는데, 이는 냉동 보존 된 크립트의 대량 재고가 생성 될 수 있기 때문입니다 (3R의 원리). 이 방법의 또 다른 장점은 표현형 또는 유전형 결과를 얻은 후 관심 동물에서만 장 오가노이드가 성장한다는 것인데, 이는 매우 비용 효율적입니다.
생체 내에서, 장 상피 세포는 분극화되고, 정점면은 내강을 향한다. 시험관 내, 3D 오가노이드에서 상피 세포의 정점 측면도 내강(즉, 오가노이드 내부)을 향하고 있습니다4. 이 조직은 상피 세포에 대한 내강 성분(예: 영양소, 미생물, 대사 산물)의 영향을 연구할 때 문제가 되는 정점 측면에 대한 접근을 방지합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 오가노이드 세포를 2D 단층으로 배양, 미세주입 및 극성 반전("apical-out organoid")과 같은 여러 방법이 개발되었습니다18,19. 오가노이드 세포 단층의 배양은 가장 효율적이고 다루기 쉬운 시스템으로 부상하고 있습니다. 원리는 3D 오가노이드를 단일 세포로 분리하고 이전에 세포외 기질(ECM)20의 얇은 층으로 코팅된 세포 배양 용기에 시드하는 것입니다. 이러한 배양 조건에서, 상피 세포의 정점 측면은 위쪽을 향하고 있으며, 따라서 실험적 처리에 접근할 수 있다20. 오가노이드 세포 단층의 배양은 최근 돼지 장21,22에 적응되었습니다. 돼지 3D 오가노이드에서 유래한 세포 단 층은 장 감염 연구 6,23,24,25, 영양소 수송연구 9, 소화기 질환 모델링 26 등 다양한 용도로 사용되어 왔다.
여기에서 이 연구는 먼저 냉동보존된 상피 선와에서 파생된 돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 유지를 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 그런 다음 돼지 장 3D 오가노이드에서 세포 단층을 확립하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 여기에 설명된 방법은 영양소 수송, 장벽 기능 및 숙주-미생물 상호 작용에 대한 돼지 장 상피를 연구하는 데 사용할 수 있는 실험 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트 </td><td>Corning</td><td>003526</td><td></td></tr><tr><td>48웰 세포 배양 플레이트 </td><td>Corning</td><td>003548</td><td></td></tr><tr><td>50mL 폴리프로필렌 코니컬 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Euromedex</td><td>A6003</td><td>4°C에 보관.</td></tr><tr><td>Centrifuge Universal 320 R</td><td>Hettich</td><td>1406</td><td></td></tr><tr>인간 태반 <td>Sigma</td><td>C5533</td>의<td>콜라겐 IV형</td><td>제조업체의 권장 사항에 따라 아세트산에 1mg/mL의 원액을 준비합니다. 부분 표본 (500 &micro; L)에 저장되고 -20 &deg;C에 저장됩니다. </td></tr><tr><td>CoolCell LX 세포 동결 용기</td><td>Corning</td><td>432003</td><td>crypt와 organoid를 동결 보존하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td>Countess 3 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16842556</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>630-1845</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube ClearLine 1 mL</td><td>Clear line </td><td>390706</td><td>crypt 및 organoid를 동결 보존하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>제조업체에 따라 물에 5mg/mL의 원액을 준비합니다. s 권장 사항. 부분 표본 (20 &micro; L) -20 &deg에서 보관하십시오. C </td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT) </td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td>4 &deg;C에 저장하십시오.</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31966047</td><td>4°C에 보관.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td> <td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td><td>VWR</td><td>631-9483 </td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>-20°C에서 5mL 부분 표본을 보관합니다.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 세포 스트레이너</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>크립트 분리에 사용됩니다. </td></tr><tr><td>고정 틸트 3D 플랫폼 로테이터 </td><td>VWR</td><td> 97025-564 </td><td>면역 염색 프로토콜의 배양에 사용됩니다. </td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010015</td><td>4°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>효소 해리 시약. 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG, Alexa fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>2차 항체. 4 &deg;C에 보관하십시오. 작업 희석 1:1000. </td></tr><tr><td>IntestiCult 오가노이드 성장 배지 (인간)</td> <td>줄기 세포 기술</td><td>6010</td><td>오가노이드 배양 배지. -20°C에서 보관하십시오.기초 배지와 오가노이드 보충제를 실온에서 해동하고 혼합합니다(1:1). 믹스를 4°C에 보관하십시오. C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td>플레이트 24웰용 PET 멤브레인 투명 Falcon 포함</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td> Eclipse TS2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>오가노이드의 3D 배양에 사용되는 종양 유래 세포 외 매트릭스. 마트리겔은 실온에서 중합됩니다. 냉각된 팁을 사용하여 Matrigel을 피펫팅합니다. 500 &micro를 준비하십시오. L 분취 및 -20 &deg;C에서 보관합니다.</td></tr><tr>DAPI <td>Vectashield</td><td>H1250</td><td>을 사용한 형광용 장착 매체</td><td> 4°C에 보관하십시오. </td></tr><tr><td>오클루딘 다클론 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>71-1500</td><td>1차 항체. -20 &deg;C에 보관하십시오. 작업 희석 1:200. </td></tr><tr><td>파라포름알데히드 32%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714</td><td>PBS 35mL에 32% PFA 5mL를 첨가하여 화학적 후드 아래에 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다. 10mL씩 분취하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td>항균. 5mL 부분 표본을 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Phalloidin TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>액틴 염색용 프로브.1mg/mL 원액. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>박테리아, 마이코플라스마 및 곰팡이에 작용하는 일차 세포용 항균제. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td><td>ATCC</td><td>ACS-3030</td><td>줄기세포의 유지를 위해 사용된다. 제조업체의 권장 사항에 따라 멸균 수에서 10mM에서 원액을 준비하고 부분 표본을 보관하십시오(50 &micro; L) -20 &deg;C에서.</td></tr><tr><td>회전 쉐이커 믹스 XL</td><td>Clear line </td><td>062646CL</td><td>크립트 분리에 사용됩니다. </td></tr><tr><td>스트라이프, 혈청학 피펫, 10 mL</td>, <td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr>, <tr><td>조직 배양 접시</td>, <td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton X100</td>, <td>Sigma</td><td>8787</td>, <td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Trypan 블루 염색 0.4% </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>진공 시스템 Vacusip</td><td>Integra</td><td>159000</td><td>오가노이드 웰의 매체를 제거하는 데 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3d 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

장 오가노이드는 소화기 질환 모델링을 위해 장 상피를 연구하거나 약물, 영양소, 대사 산물, 병원체 및 미생물군과의 상호 작용을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 장내 오가노이드를 배양하는 방법은 이제 돼지를 포함한 여러 종에 사용할 수 있으며, 돼지는 농장 동물로서 그리고 예를 들어 인수공통전염병을 연구하기 위한 인간의 번역 모델로서 주요 관심 종입니다. 여기에서는 냉동 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 데 사용되는 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 돼지 장에서 상피 선와를 냉동 보존하는 방법과 3D 장 오가노이드를 배양하기 위한 후속 절차를 설명합니다. 이 방법의 주요 장점은 (i) 3D 오가노이드 배양에서 스크립트 분리의 시간적 해리, (ii) 여러 장 세그먼트 및 여러 동물에서 한 번에 파생된 냉동 보존된 크립트의 대량 준비, 따라서 (iii) 살아있는 동물에서 신선한 조직을 샘플링할 필요성의 감소. 우리는 또한 영양소, 미생물 또는 약물과의 상호 작용 부위인 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 설정하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 전반적으로 여기에 설명된 프로토콜은 수의학 및 생물의학 연구에서 돼지 장 상피를 연구하는 데 유용한 리소스입니다.

위에서 설명한 프로토콜에 따라 돼지 장에서 상피 자와를 채취하여 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 냉동 보존합니다(그림 1 및 그림 2A). 해동 후, crypt 줄기 세포는 ECM에 파종됩니다 (그림 2B). crypt 구조는 일반적으로 ECM에서 crypt 구조의 붕괴로 인해 이 단계 후에 손실됩니다. 오가노이드는 3-4일 이내에 관찰할 수 있으며, 그 후 빠르게 성장하고 발아 구조가 발달합니다(그림 2B). 우리는 시도의 &gt;80%에서 냉동 크립트를 해동한 후 오가노이드를 성공적으로 얻었습니다. 해동 후 약 10일 후(오가노이드의 성장률에 따라) 배양을 확장하기 위해 오가노이드의 계대가 수행됩니다(그림 3). 오가노이드는 분열 후 더 빨리 성장하며 일부 낭성 오가노이드와 대부분의 신진 오가노이드와 함께 다양한 형태를 나타냅니다. 배양의 최적 유지를 위해 계대배양에 사용되는 오가노이드는 성숙한 오가노이드에서 관찰되는 바와 같이 깨끗하고 비어 있는 내강과 잘 정의된 가장자리(예: 녹색 화살표로 표시)를 나타내야 하며, 내강에 검은색 파편(빨간색 화살표로 표시)이 없어야 합니다(그림 3). 우리는 흑혈구 파편이 통과 후 6일째 되는 날에 축적되기 시작한다는 것을 발견했습니다. 따라서 계대배양 후 4-5일에 오가노이드를 분할하거나 동결하는 것이 좋습니다.
오가노이드의 성숙 단계는 또한 세포 단층을 얻는 데 중요한 포인트입니다. 성숙도가 높은 오가노이드(루멘에 흑색 세포 파편이 있는 것으로 표시됨)는 단층을 시드하는 데 최적이 아닙니다. 우리는 일반적으로 2D 배양을 위한 세포를 수집하기 위해 통과 후 4일 후에 3D 오가노이드를 해리합니다. ECM의 50μL 돔당 3,000개 세포에서 배양된 약 1-3개의 3D 오가노이드 웰은 2.5 x 105 세포로 하나의 배양 삽입물을 파종하는 데 필요합니다. 세포는 부착되어 1일 이내에 완전히 합류하는 단분자층을 형성하며(그림 4A), 이는 약 700 Ω·cm2 의 높은 TEER로 확인됩니다(그림 4B). 그러나 세포 가장자리는 이 초기 시점에서 명시야 현미경으로 시각화하기 어려운데, 이는 아마도 낮은 분화 수준 때문일 것입니다. TEER은 3일 동안 높은 상태를 유지합니다(그림 4B).
액틴 염색은 3D 오가노이드에서 상피 세포의 정점 쪽이 내강을 향하고 있음을 나타냅니다(그림 5A). 배양 삽입물에 파종된 오가노이드 세포는 상피 세포의 합류 단층을 형성하며, 정점 쪽은 상부 구획을 향합니다(그림 4B, C). Occludin 염색은 3D 오가노이드 및 세포 단층에서 상피 세포의 정점 쪽에 밀착 접합부의 존재를 보여줍니다(그림 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> 그림 1: 3D 오가노이드 및 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 배양하는 데 사용되는 방법의 개략도. 상피 선와(Epithelial crypt)는 새끼 돼지 장에서 분리됩니다. 이러한 크립트는 i) 3D 오가노이드를 배양하는 데 즉시 사용하거나 ii) 액체 질소의 바이오뱅크에 냉동 및 보관할 수 있습니다. 냉동보존된 크립트는 해동하여 3D 오가노이드 배양에 사용할 수 있습니다. 3D 오가노이드 배양은 연속적인 분할로 유지되거나 바이오뱅크에 냉동 및 저장될 수 있습니다. 세포 단분자층은 3D 오가노이드 배양에서 얻어 세포의 정점 측면에 접근하고 상피 장벽 기능을 연구할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> 그림 2: 냉동보존된 상피선와에서 돼지 장 3D 오가노이드 배양. (A) 갓 분리된 공장 지하실의 대표적인 현미경 이미지. (B) 공장 선와를 해동한 후 얻은 3D 오가노이드의 대표적인 현미경 이미지. 오가노이드는 48웰 플레이트의 ECM 돔 25μL에서 배양되었습니다. 그림은 파종 후 4일, 7일, 8일, 9일 및 10일째의 3D 오가노이드 이미지를 보여줍니다. 스케일 바는 500μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> 그림 3: 첫 번째 계대 후 냉동보존된 상피 선와에서 유래한 돼지 장 3D 오가노이드의 형태. 4일차부터 7일차까지 첫 번째 계대 후 냉동보존된 공장음와에서 유래한 오가노이드의 발달을 보여주는 대표적인 현미경 이미지. 녹색 화살표는 단층의 통과 또는 파종에 적합한 투명한 오가노이드를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 단층을 분할하거나 파종하는 데 적합하지 않은 성숙한 오가노이드를 나타냅니다. 따라서 이 형태가 발현되기 전에 우물을 사용해야 합니다. 스케일 바는 500μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> 그림 4: 돼지 장내 3D 오가노이드에서 유래한 세포 단층의 특성 . (A) 3일 동안의 단층 형태의 대표적인 현미경 이미지. 공장 오가노이드 세포를 2.5 x 105 세포에서 50 ng/mL의 콜라겐 IV로 코팅된 0.33 cm2 세포 배양 삽입물에 시딩했습니다. 눈금 막대는 500μm를 나타냅니다. (B) 3일 동안 오가노이드 세포 단층의 경상피 전기 저항(TEER). 선으로 연결된 점들은 서로 다른 시간에 같은 우물에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> 그림 5: 3D 또는 2D로 배양된 돼지 공장 오가노이드의 이미징. (A) 분할 5일 후 3D 오가노이드 및 파종 3일 후 (B,C) 오가노이드 세포 단층의 공초점 현미경 이미징(B: XZ 섹션; C: XY 섹션). DNA(청색)는 DAPI로 염색하였다. 액틴(적색)은 팔로이딘으로 염색하였다. Occludin(녹색)은 다클론 항체로 염색되었습니다. 흰색 화살표는 밀착 접합부에 국한된 폐색도를 나타냅니다. 스케일 바는 20μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 냉동보존된 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 확립하여 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다.

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

우리의 프로토콜은 수의학 및 생물 의학 연구를 위해 돼지 장 상피를 연구하는 도구를 제공합니다. 돼지의 장 오가노이드는 영양소 수송, 장벽 기능 및 숙주-미생물 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 돼지 장 상피 선와를 보존하여 나중에 3D 또는 2D 단층으로 오가노이드를 배양하는 데 사용할 수 있는 대량의 줄기 세포를 생성할 수 있습니다.이 프로토콜은 공장에 대해 자세히 설명되어 있지만 십이지장, 회장 및 결장과 같은 다른 장 분절에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 900개의 냉동 크립트가 들어 있는 바이알을 빠르게 해동합니다. 크립트 용액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.실온에서 5분 동안 300 x g로 원심분리하고 상층액을 제거한다. 냉각된 팁으로 150 마이크로리터의 세포외 기질 또는 ECM을 첨가하여 ECM 25 마이크로리터당 150 크립트의 최종 농도를 얻는다. ECM에서 스크립트의 균질한 현탁액을 얻기 위해 위아래로 10회 피펫.미리 예열된 48웰 플레이트에 웰당 25마이크로리터 방울로 6개의 웰을 시드합니다. ECM의 중합을 위해 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 30분 동안 배양합니다. 실온에서 배지의 배양 웰 당 250 마이크로 리터를 첨가하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양한다.2-3 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 파종 10일 후 냉동 크립트에서 파생된 3D 오가노이드를 계대배양하기 위해 배양 배지를 제거하고 섭씨 37도에서 예열된 PBS 250마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션 후, PBS를 각 웰에서 섭씨 37도에서 10마이크로몰 암석 억제제로 보충된 250마이크로리터의 예열 효소 해리 시약으로 교체합니다.P-1000 피펫으로 긁어내어 ECM의 오가노이드를 분리하고 5회 피펫팅하여 조심스럽게 균질화합니다. 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 5분 동안 배양한 후 위아래로 10회 피펫팅하여 세포를 해리합니다. 해리된 세포가 들어 있는 각 웰에 500마이크로리터의 DMEMc를 넣고 3밀리리터의 차가운 DMEMc가 들어 있는 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 최대 12개의 웰을 당깁니다.섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1밀리리터의 차가운 DMEMc에 재현탁합니다. 세포 계수기를 사용하여 trypan blue에서 1-2로 희석하여 세포를 세십시오.돔 당 3000 개의 살아있는 세포를 갖기 위해 필요한 양의 세포 용액을 원심 분리합니다. 얼음 위의 17개의 살아있는 세포당 3000마이크로리터의 차가운 DMEMc로 펠릿을 재현탁합니다. 필요한 수의 우물로 볼륨을 조정하십시오.살아있는 세포 3000개당 33마이크로리터의 차가운 ECM을 천천히 추가합니다. 필요한 수의 우물로 부피를 조절하고 기포를 만들지 않고 균질화하십시오. 이어서, 예열된 24-웰 플레이트에서 웰 당 50 마이크로리터의 ECM 세포 현탁액을 갖는 웰을 보고, ECM의 중합을 위해 30분 동안 인큐베이션한다.웰 당 500 마이크로 리터의 배양 배지를 첨가하십시오. 그런 다음 2-3 일마다 배양 및 배양 배지를 교체하십시오. 배양 삽입물을 코팅하기 위해, 차가운 PBS에서 밀리리터당 50 마이크로그램으로 희석된 콜라겐 IV를 함유하는 코팅 용액을 제조한다.희석된 코팅 용액 150 마이크로리터를 각 세포 배양 삽입물에 첨가하고 밤새 또는 3시간 동안 배양한다. 분할 후 5일 후에 ECM이 있는 오가노이드를 P-1000 피펫으로 긁어 분리합니다. 배양 배지에서 피펫팅하여 조심스럽게 균질화하고, 얼음 위에 5 밀리리터의 차가운 DMEMc를 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다.수집된 오가노이드를 섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g로 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인하고 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 예열 효소 해리 시약 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 오가노이드의 해리를 시작하기 위해 위아래로 10번 피펫.효소 소화를 위해 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 10회 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 파쇄하고 얼음처럼 차가운 DMEMc 4ml를 추가합니다. 오가노이드 세포 펠릿을 1밀리리터의 DMEMc에 재현탁하기 전에 상층액을 원심분리하고 버립니다.세포 계수기를 이용하여 트리판 블루로 세포를 계수하고, 배양 삽입물 당 10번째 세포에 2.5 곱하기 10을 시딩하는데 필요한 부피를 계산한다. 원심분리하여 배양 삽입물 당 5번째 세포의 2.5배에 해당하는 세포 현탁액의 필요한 부피를 원심분리한다. 원심분리하는 동안 배양 삽입물에서 코팅 용액을 조심스럽게 흡인하고 뚜껑 없이 후드 아래에서 5분 동안 건조시킵니다.원심분리 후, 상층액을 버리고 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 필요한 부피의 2D 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 코팅된 투과성 멤브레인 상에 시드한다. 10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 500 마이크로리터의 2D 배지를 하부 구획에 추가하고 배양합니다.멤브레인에서 고밀도의 세포가 관찰되어야합니다. 파종 후 하루 만에 에피컬 및 베이스 배지를 ROCK 억제제가 없는 새로운 2D 배지로 교체합니다. 매일 미디어를 바꾼다.단층은 파종 후 언젠가 합류하여 실험에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 돼지 장에서 상피 선와를 채취하여 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 냉동 보존했습니다. 해동 후, 음와 줄기 세포를 ECM에 시딩하였다.오가노이드는 3-4일 이내에 관찰되었으며 빠르게 성장하고 발아 구조가 발달했습니다. 해동 후 약 10일 후, 배양액을 확장하기 위해 오가노이드의 통과를 수행하였다. 배양의 최적 유지를 위해 포장에 사용되는 오가노이드는 성숙한 오가노이드에서 관찰되는 것처럼 루멘에 검은색 파편이 없는 깨끗하고 빈 루멘과 잘 정의된 가장자리를 제공해야 합니다.세포는 하루 안에 완전히 합류하는 단층을 형성하고 형성하며, 이는 약 700 돔 평방 센티미터의 높은 경상피 전기 저항 (TEER)에 의해 확인됩니다. TEER은 3 일 동안 높게 유지됩니다. 액틴 염색은 상피 세포의 정점 측면이 3D 오가노이드에서 내강을 향하고 있음을 나타냅니다.배양 삽입물에 시딩된 오가노이드 세포는 상피 세포의 합류 단층을 형성하며 정점 측면은 상부 구획을 향합니다. Occludin 염색은 3D 오가노이드 및 세포 단층에서 상피 세포의 정점 쪽에 밀착 접합부의 존재를 보여줍니다. 세포 단층을 시드하는 데 사용되는 오가노이드는 죽은 세포의 축적에 해당하는 검은색 파편 없이 빈 내강으로 투명하게 보여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.돼지 장 오가노이드의 단층은 기능 분석, 이미징 및 유전자 발현 분석을 사용하여 상피 장벽 기능에 대한 대사 산물 또는 미생물의 영향을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

엔테로이드는 조직 생리학 및 병태생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 연구하기 위한 새로운 모델로 부상하고 있습니다. 여기서는 관련 조직 세포 유형과의 공동 배양을 허용하는 소 일차 세포 2D 장내 유래 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 모델은 위장 연구 모델링을 위한 중개적 이점을 제공합니다.

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

배우세요 냉동보존 상피선에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드 배양 및 세포 단층 확립 방법을. 이 기술은 영양소 수송, 장벽 기능, 숙주-미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

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