Name: 단일 가닥 DNA 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 배우세요 단일 가닥 DNA 면역형광을 사용하여 난소암 세포의 복제 스트레스를 정량화하는 방법을. 이 기법은 고효율·재현성이 높아 대규모 스크리닝에 적합하며, 화학요법 반응 바이오마커 연구에 활용됩니다.

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PV는 The Foundation for Barnes-Jewish Hospital을 통한 Alvin J. Siteman Cancer Center의 Inaugural Pedal the Cause Grant, Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research의 파일럿 연구 보조금, Mary Kay Ash Foundation 및 V-Foundation의 암 연구 보조금의 지원을 받습니다. NR은 세인트루이스 워싱턴 대학교에 대한 NIH 세포 및 분자 생물학 교육 T32 보조금의 지원을 받습니다.

참고: 난소암 세포주인 OVCAR3이 이 단계에서 사용되었지만 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 파생된 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 셀 도금
<ol><li>폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 만듭니다.<ol><li>폴리-L-라이신 용액이 담긴 12mL 원뿔형 튜브에 오토클레이브 50mm 직경 커버슬립을 추가하고 로커에 15분 동안 놓습니다.</li>
		<li>조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버슬립을 세척하고 커버슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오.</li>
		<li>코팅된 커버슬립을 멸균 접시에 펼치고 남아 있는 물을 흡인합니다. 커버슬립을 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 접시를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>하나의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 24웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다. 폴리 라이신 커버슬립의 사용은 사전 추출 단계 동안 커버슬립에서 세포가 분리되는 것을 방지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>OVCAR3 세포가 70%-80% 밀도에 도달하면 트립신화합니다.<ol><li>70%-80% 합류성인 10cm 배양 접시를 트립신화하려면 플레이트에서 배지를 흡인하고 5-7mL의 PBS로 세척합니다.</li>
		<li>PBS를 흡인하고 0.25% 트립신 1mL를 첨가한 후 접시를 37°C 인큐베이터에 8-10분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려질 때까지 놓습니다.</li>
		<li>5-10 mL의 배지로 세포를 모으고 원추형 튜브에 첨가하십시오.</li>
		<li>표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>25,000 cells/mL로 희석하고 24웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리-L-라이신 커버슬립에 세포 1mL를 추가합니다. 다른 세포주의 경우, 세 번의 집단 배가 후 세포가 약 70%-80% 합류하도록 숫자를 결정합니다.</li>
	<li>표준 조건하의 배양 배지에서 세포를 성장시킨다.</li>
</ol>2. IdU로 세포 펄스
<ol><li>세포가 커버 슬립에 제대로 퍼지기 위해서는 한 개체군을 두 배로 늘리면 충분합니다. 한 집단 배가 후, 두 개의 후속 집단 배가에 대해 10μM 5-요오도-2'-데옥시유리딘(IdU)(IdU를 재구성하는 방법에 대한 재료 표 참조)으로 세포를 펄스합니다. 참고: 우리는 브로모데옥시유리딘(BrdU), 5-클로로-2′-데옥시유리딘(CIdU) 및 IdU를 포함한 다양한 티미딘 유사체를 시도했습니다. 세 가지 아날로그 중에서 IdU는 최고의 신호 대 잡음비를 제공합니다. 세 가지 다른 유사체로 펄싱된 세포의 비교 이미지가 그림 3에 나와 있습니다. 두 가지 음성 대조군을 사용하는 것이 좋습니다: (i) IdU 펄스 샘플이 없고 (ii) 1차 항체 대조군이 없습니다. 주어진 치료로 인해 ssDNA의 형성을 평가해야 하는 경우 IdU 배가의 첫 번째 라운드 후에 약물을 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>두 개의 집단 배가를 위해 IdU로 펄싱한 후 이미징을 위해 세포를 수확합니다.<ol><li>매체를 얼음 위에서 얼음처럼 차가운 0.5% PBSTx(PBS + 0.5% Triton X-100)로 5분 동안 교체합니다. 이 사전 추출 단계는 세포질 및 염색질 결합되지 않은 단백질을 방출하여 염색질 결합 단백질을 그대로 유지하는 데 도움이 됩니다. 특정 세포주는 사전 추출 중에 쉽게 벗겨질 수 있습니다. 이러한 시나리오에서 0.5% CSK 완충액(10mM PIPES(pH 6.8), 100mM NaCl, 300mM 수크로스, 3mMMgCl2, 1mM EGTA 및 0.5% 트리톤 X-100)을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 고정
<ol><li>PBSTx를 흡인하고, 실온에서 3% PFA(Table of Materials)로 15분 동안 인큐베이션한 다음, 1x PBS로 3 내지 4회 세척한다. 고정된 셀은 추가 단계까지 4°C에서 유지될 수 있다. 주의: PFA는 독성이 강하고 발암성이 있습니다. 피부, 눈, 점막과의 접촉을 피하십시오. 흄 후드에서 PFA로 모든 단계를 수행하고 재료를 적절하게 폐기하십시오.</li>
</ol>4. 투과화 및 차단
<ol><li>고정 후, 얼음 위에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과화시킨다. 전체 커버슬립을 덮을 수 있는 충분한 양을 사용합니다(일반적으로 500μL에서 1mL 사이).</li>
	<li>실온에서 0.2% PBST(1X PBS + 0.2% Tween-20)로 세포를 3 내지 4회 세척한다. PBST 1mL는 각 웰을 세척하기에 충분합니다. 배양 없이 연속적으로 세척을 수행합니다.</li>
	<li>PBST를 흡인하고, 실온에서 30분 동안 1x PBS(blocking buffer)로 만든 5% BSA(Table of Materials)를 사용하여 시료를 차단한다.</li>
</ol>5. IdU 항체를 이용한 면역염색
<ol><li>면역 염색을 위해 가습 챔버 (평평한 바닥 타파웨어에 젖은 종이 타월)를 준비하십시오. 24웰 플레이트의 뚜껑을 파라필름으로 덮고 가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버슬립을 놓습니다.</li>
	<li>4.2 단계의 차단 완충액에 1:200으로 희석하여 항-BrdU 1차 마우스 항체(재료 표)를 준비합니다.항-BrdU 항체는 이전에 IdU를 검출하는 것으로 나타났습니다.</li>
	<li>커버슬립 상단에 IdU 항체 희석액 60μL를 추가합니다. 커버슬립을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.<ol><li>또는 커버슬립을 파라필름에 피펫으로 피펫팅한 1:200 항체 희석액 한 방울(20-25μL)로 뒤집는 경우 항체 용액을 덜 사용하십시오. 이것은 또한 배양 중에 용액이 건조 될 가능성을 감소시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1시간 배양 후, 1차 항체를 흡인한다. 커버슬립을 다시 24웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.</li>
	<li>2차 항체의 경우, 단계 5.1에 기술된 것과 동일한 가습 챔버를 사용한다. 항-마우스 접합 2차 항체(Table of Materials)를 블로킹 완충액(1:200)에 희석한다. coverslips에 이차 항체의 60 μL를 추가하고, 1 h.This 이차 항체를 위해 어둠에 있는 실내 온도에 인큐베이션합니다 빛에 과민합니다.</li>
	<li>2차 항체를 흡인합니다. 커버슬립을 다시 24웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 장착 매체(재료 표)를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 슬라이드를 실온의 어두운 곳에서 24시간 동안 보관하십시오. 장착 매체를 경화 또는 경화해야 하는 경우 24시간 배양하는 것이 좋습니다. 참고: 그런 다음 형광 현미경으로 이미지화하기 전에 슬라이드를 4°C에 보관할 수 있습니다. 대표 이미지는 그림 4에 나와 있습니다.</li>
</ol>6. IdU 병소의 자동 정량화
참고: 이 분석의 힘은 빠르고 효율적인 정량화를 위해 분석을 자동화하는 능력에 있습니다. 여기에서는 주어진 이미지 필드에서 IdU 초점을 정량화하는 데 사용할 수 있는 자동화된 분석 파이프라인을 제시합니다. 주어진 실험 내의 모든 이미지를 동일한 노출 설정으로 촬영하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 정량화를 신뢰할 수 없습니다. 염색되지 않은 대조군을 음성 대조군으로 포함하는 것도 가치가 있을 수 있으며, 적어도 이 실험이 처음으로 실행될 때에는 가치가 있을 수 있습니다(그림 5). 아래 프로토콜은 NIS 일반 분석 소프트웨어에만 해당되지만 다른 상용 소프트웨어에도 동일한 원칙을 적용할 수 있습니다.
<ol><li>보기( View ) 탭에서 분석 제어(Analysis Controls) | 분석 탐색기. 그러면 해석 결과 탐색기라는 새 측면 창이 열립니다. Create New(새로 만들기) | 일반 분석 3. 그러면 해석 결과 순서도 작성 소프트웨어가 열립니다.</li>
	<li>소스 탭으로 이동하여 왼쪽 메뉴에서 채널 명령을 작업 영역으로 끕니다. DAPI 및 IdU 초점에 대한 두 채널은 자동으로 이진 상자로 팝업됩니다(그림 5에서 빨간색 윤곽선이 있는 상자로 표시됨).</li>
	<li>Preprocessing 탭으로 이동하여 왼쪽 메뉴에서 Local Contrast 명령을 작업 영역으로 끕니다. 로컬 대비를 IdU 초점 채널과 연결합니다. 세그멘테이션 탭에서 임계값 명령(각 채널에 하나씩)을 끕니다.</li>
	<li>각 채널을 임계값 명령에 연결합니다. 이미지 테두리에 있는 핵을 제거하려면 이진 처리 탭으로 이동하여 접는 테두 리 명령을 끌어 DAPI 임계값에 연결합니다.</li>
	<li>측정 탭의 Aggregate Children 명령을 사용하여 두 채널의 데이터를 병합합니다. DAPI 채널을 상위(A)로 정의하고 초점 채널을 하위(B)로 정의합니다. Aggregate Children 명령의 드롭다운 메뉴에서 child is inside the parent 옵션을 선택합니다. 이 단계는 핵 (부모) 당 초점 (자식)의 수를 계산하는 데 도움이됩니다.<ol><li>데이터를 테이블 형식으로 내보내려면 데이터 관리 탭에서 열 수정 명령을 클릭합니다. Modify Columns 명령의 드롭다운 메뉴에서 DAPI-ID(지정된 이미지 내의 각 핵에 고유 번호를 할당하는 데 도움이 됨) 및 IdU 수(각 핵의 IdU 초점 수 제공)를 선택합니다. 데이터를 CSV 형식으로 내보내려면 참조 탭에서 CSV로 표 명령을 사용합니다. 이제 GA3를 설명이 포함된 제목으로 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석을 위해 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.<ol><li>6.1단계에서와 같이 분석 탐색기 탭을 열고 새로 만든 GA3을 찾습니다. GA3 파일을 두 번 클릭하면 DAPI 및 IdU 채널에 대한 임계값을 설정할 수 있는 GA3 마법사 라는 새 창이 열립니다.</li>
		<li>창의 슬라이더를 사용하여 각 채널에 대한 최소 및 최대 임계값을 설정하고 신호를 정의합니다. 좋은 임계값은 각 핵 및 IdU 초점의 경계가 명확하게 정의되는 위치입니다. 임계값이 충족되면 지정된 실험의 모든 파일을 분석하기 위해 이 숫자를 유지합니다.</li>
		<li>실행 버튼을 클릭하여 IdU 초점/핵당 개수를 얻습니다. 참고: 이 소프트웨어는 핵당 초점 표를 생성하며, 이후 모든 그래프 작성 목적으로 사용할 수 있습니다(그림 5).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

프로토콜에서 언급했듯이 분석이 작동하는지 확인하기 위해 몇 가지 실험 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 IdU 처리되지 않은 샘플과 1차 항체 처리되지 않은 샘플이 포함됩니다. 두 음성 대조군 모두 DAPI에 의해 염색되었지만 IdU 신호를 포함하지 않는 세포를 생성해야 합니다.
사용된 실험 조건 및 세포주에 따라 최상의 형광 신호를 얻기 위해 다양한 항체 희석이 필요할 수 있습니다. 신호가 너무 많으면 개별 초점을 정량화할 수 없는 반면, 신호가 너무 적으면 샘플 간의 실험적 차이를 식별할 수 없습니다. 추출 전 및 투과화 시간을 조정하면 추출되지 않은 핵질 내용물에서 발생할 수 있는 배경 신호가 너무 많은 경우에도 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 두 개의 개체군 배가에 걸쳐 IdU 통합이 필요하기 때문에 각 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 배가 시간이 다른 두 세포주를 비교할 때 각 세포주의 ...

게놈 DNA는 다양한 내인성 및 외인성 출처의 여러 공격에 자주 노출된다1. 내인성 손상의 빈도는 난소암을 포함한 여러 암 유형에서 본질적으로 더 높은 활성산소종 또는 알데히드와 같은 대사 부산물의 수준과 직접적인 상관관계가 있다 2,3. DNA 손상을 효율적으로 해결하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 유전 독성 병변을 조장하여 결과적으로 돌연변이 유발을 일으킬 수 있습니다. 유전독성 병변을 복구하는 세포의 능력은 오류 없는 DNA 복구 경로의 기능과 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 주기 진행의 효율적인 조절에 달려 있습니다. 특히, 많은 난소암은 p53에 기능적으로 비활성화 돌연변이를 가지고 있으며, 따라서 결함이 있는 G1/S 체크포인트를 가지고 있어 복구되지 않은 게놈 병변이 있음에도 불구하고 세포가 DNA 복제를 시작하도록 유도합니다 4,5. 난소암의 DNA 손상 정도는 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 50% 이상이 BRCA1 및 BRCA2 매개 상동 재조합, 오류 없는 DNA 복구 경로에 결함이 있고 약 20%가 유전자 CCNE1에서 증폭되어 G1 세포를 S상6으로 조기에 밀어 넣는다는 관찰에 의해 더욱 복잡해집니다 . 높은 빈도의 내인성 DNA 손상, 결함 있는 체크포인트 및 오작동하는 복구 경로가 함께 난소암에서 게놈 병변의 축적을 기하급수적으로 향상시킵니다. 이러한 병변은 DNA 복제 및 전사와 같은 중요한 세포 과정의 진행에 장애가 될 수 있습니다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 이러한 장애는 세포에서 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 촉매합니다.
DNA의 이중 나선은 자발적인 정화 및 탈피리미딘, 시토신 데아미나제의 활성, 산화적 DNA 손상과 같은 여러 돌연변이 유발 과정으로부터 게놈을 보호하는 데 중요합니다 1,7. 대조적으로, ssDNA는 이러한 돌연변이 사건에 매우 취약합니다. 세포의 여러 과정으로 인해 ssDNA가 생성될 수 있습니다(그림 1). 여기에는 다음이 포함됩니다.
(i) DNA 복제 기계의 정지: 이것은 DNA 헬리카제와 중합효소의 분리로 이어져 ssDNA 8,9의 스트레칭을 남깁니다.
(ii) 전사 기계의 실속: RNA 중합효소의 지속적인 실속은 R-루프라고 하는 3가닥 하이브리드 DNA/RNA 구조의 생성으로 이어집니다. R-루프 형성은 변위되고 전사되지 않은 DNA를 단일 가닥10으로 노출시킵니다.
(iii) DNA 말단 절제술: 상동성 지향 복구의 개시는 상동 서열11에 대한 탐색을 촉매하기 위해 3' ssDNA의 생성을 필요로 한다.
(iv) D-루프: 상동성 재조합 동안 가닥 침범은 비주형 상보적 가닥의 변위를 초래하여 ssDNA12를 초래할 수 있습니다.
(v) 복제 결합 갭: DNA 복제 중에 지연 가닥 합성이 불연속적인 방식으로 발생하여 오카자키 조각이 먼저 생성된 다음 결찰됩니다. 오카자키 단편 처리의 지연 또는 결함도 ssDNA 형성을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 선행 가닥의 복제 포크가 실속 병변, DNA 중합효소 및 프리마제를 만나면 PRIMPOL은 합성 다운스트림을 리프라이밍하여13,14 뒤에 ssDNA 갭을 남길 수 있습니다.
분명히, 이러한 사건의 대부분은 DNA 복제 기계가 게놈 병변에 직면하거나 복제 결합 복구 중에 발생하며, 이는 DNA 손상이 높을수록 ssDNA 수치가 증가함을 시사합니다. 이러한 사건의 많은 부분이 복제와 관련되어 있기 때문에 ssDNA의 형성은 세포15,16에서 "복제 스트레스"의 마커로 간주됩니다.
여기에서는 세포에서 ssDNA를 안정적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 분석법을 설명합니다. 이 접근법의 단순성, 재현성 및 비용 이점으로 인해 세포의 복제 스트레스 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 신흥 연구는 ssDNA의 수준이 또한 PARP1/2 효소의 억제제, ATR, 및 Wee1 키나제 17,18,19,20,21과 같은 화학요법에 대한 반응의 예측인자일 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이들 억제제는 여러 HGSOCs2의 치료 요법에서 추구되고 있다. 따라서, 이 분석은 또한 난소암 세포에서 화학요법 반응을 예측하는 유용한 도구가 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>3% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0179595</td><td>10g 자당 + 100mL 10X PBS + 물을 925mL로 만듭니다. 75 mL 40% 메탄올 프리 PFA를 첨가하고, 혼합하고, 보관하기 전에 50 mL의 부분 표본을 만듭니다 보관: -20°C에 보관; C</td></tr><tr><td>5-요오도-2'-데옥시우리딘(IdU)</td><td>시그마 알드리치</td><td>I7125-5G</td><td>MW = 354.10g/mol. 10 mM 재고의 경우: 3.541 mg IdU를 1 mL 1 N 액체 암모니아 용해 저장: -20 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>Anti-BrdU 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>저장 : 4 °C에 보관; C</td></tr><tr><td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 2차 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32766</td><td>감광성 - 어두운 곳에 보관 보관: 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>둔감한 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>PBS의 양에 특정한 질량을 추가해서 만드는 저장: 4개의 &deg에 있는 저장; C</td></tr><tr><td>원형 커버 유리&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>NIS GA3 소프트웨어&nbsp;</td><td>니콘&nbsp;</td><td></td><td></td>77010604</tr><tr><td>OVCAR3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>성장 매체: L-글루타민, 0.01 mg/mL 소 인슐린이 보충된 RPMI; 최종 농도 20%까지의 소 태아 혈청 및 1X Pen Strep 저장: 동결 매체: 성장 매체 + 5% DMSO 및 -80°에 보관; C</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832-50ML</td><td>저장: 4°C에 보관; </td></tr><tr><td>C ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운트란트와 DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36962</td><td>저장: 4도에 보관; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>저장: 4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>물, 멸균 여과</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td>저장: 4°C에 보관; 씨</td></tr></tbody></table>

단일 가닥 dna 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

복제 스트레스는 여러 난소암의 특징입니다. 복제 스트레스는 이중 가닥 절단, 전사-복제 충돌 또는 증폭된 종양 유전자를 포함한 여러 소스에서 나타날 수 있으며, 필연적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 초래합니다. 따라서 ssDNA를 정량화하면 다양한 세포 유형과 다양한 DNA 손상 조건 또는 치료에서 복제 스트레스 수준을 평가할 수 있습니다. 새로운 증거는 또한 ssDNA가 DNA 복구를 표적으로 하는 화학요법 약물에 대한 반응의 예측 인자일 수 있음을 시사합니다. 여기에서는 ssDNA를 정량화하기 위한 상세한 면역형광 기반 방법론을 설명합니다. 이 방법론은 티미딘 유사체로 게놈을 표지한 다음 비변성 조건에서 염색질에서 유사체의 항체 기반 검출을 포함합니다. ssDNA의 스트레치는 형광 현미경으로 초점으로 시각화할 수 있습니다. 병소의 수와 강도는 핵에 존재하는 ssDNA의 수준과 직접 관련이 있습니다. 또한 ssDNA 신호를 정량화하기 위한 자동화된 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 빠르고 재현 가능합니다. 또한 이 방법론의 단순성으로 인해 약물 및 유전자 스크리닝과 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다.

24시간 동안 0.5 mM 하이드록시우레아로 처리된 미처리 세포 및 세포로부터 유래된 핵으로부터의 IdU 초점의 대표 이미지 및 정량화가 도 4에 제시되어 있다. 두 핵 모두 염색되어 DAPI 채널에서 식별 가능합니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64920/64920fig01.jpg"> 그림 1: ssDNA 생성 메커니즘. 세포에서 ssDNA가 생성될 수 있는 다양한 메커니즘을 보여주는 개략도. 여기에는 (A) 복제 기계의 스톨, (<str...

여기에서는 세포에서 단일 가닥 DNA의 수준을 정량화하는 면역형광 기반 방법을 설명합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 방법은 여러 난소암에서 흔히 볼 수 있는 특징인 복제 스트레스를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 분석은 자동화된 분석 파이프라인과 호환되어 효율성을 더욱 높입니다.

단일 가닥 DNA 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

당사의 프로토콜은 다양한 세포주에서 복제 스트레스의 마커인 단일 가닥 DNA를 정량화하는 매우 효율적이고 쉽게 재현 가능한 방법을 제시합니다. 또한 단순성으로 인해 처리량이 많은 응용 프로그램과 화면이 가능합니다. 특히, 이 방법은 여러 난소암의 특징인 복제 스트레스의 신속한 정량화를 가능하게 합니다.또한 호스트 자동 분석 소프트웨어를 사용할 수 있어 효율성을 더욱 높일 수 있습니다. 단일 가닥 DNA는 현재 DNA 복구 경로를 표적으로 하는 화학 요법에 대한 반응을 위한 바이오마커로 활발히 고려되고 있습니다. 따라서 이 방법은 해당 시나리오에 매우 적합합니다.복제 스트레스는 난소암 맥락 또는 BRCA1, BRCA2 결핍 암을 넘어 존재합니다. 따라서, 이 방법은 다양한 다른 세포 유형 또는 질병 맥락에 적용될 수 있다. 시작하려면 오토클레이브 12mm 직경의 커버 슬립과 폴리라이신 용액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 추가하여 폴리라이신 코팅 커버 슬립을 만들고 로커에 15분 동안 놓습니다.조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버 슬립을 세척하고 커버 슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 커버 슬립을 세 번 씻은 후 튜브에서 물을 흡입하고 커버 슬립을 멸균 접시에 펼칩니다.남은 물을 흡인하고 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 Parafilm으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 놓습니다. 사전 추출 단계 동안 커버 슬립으로부터 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해, 하나의 폴리리신 코팅된 커버 슬립을 24-웰 플레이트의 각 웰에 배치한다.OVCAR3 세포가 70 내지 80% 밀도에 도달하면, 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 세포를 5 내지 7 밀리리터의 PBS로 세척한다. 플레이트에서 PBS를 흡인합니다. PBS를 흡인 한 후 1 밀리리터의 0.25 % 트립신을 넣고 섭씨 37 도의 인큐베이터에 8-10 분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려 질 때까지 접시를 놓습니다.5 내지 10 밀리리터의 배지로 세포를 모으고 세포 현탁액을 원추형 튜브에 첨가한다. 표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계산합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 희석하고, 3 개의 집단 후에 70-80 %의 confluency를 산출 할 수있는 수를 얻는다.24-웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리라이신 커버 슬립에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하고, 표준 조건 하에서 배양 배지에서 세포를 성장시킨다. 한 집단 배가 후, 플레이트에서 기존 배지를 흡인하고 두 개의 후속 집단 배가를 위해 10 마이크로몰 IdU로 세포를 펄스합니다. 세포를 채취하기 위해, 배지를 얼음 위에서 5분 동안 얼음 위의 얼음 차가운 0.5% PBSTx로 교체한다.세포 고정을 위해 PBSTx를 흡인하고 실온에서 3% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 3-4회 세척한 후 추가 사용이 있을 때까지 고정 셀을 섭씨 4도로 유지하십시오. 고정 후 얼음 위에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과시켜 전체 커버 슬립을 덮도록 합니다.세포를 실온에서 0.2% PBST 1밀리리터로 3 내지 4회 세척한 후, PBST를 흡인하고 PBS로 만든 5%BSA를 사용하여 시료를 실온에서 30분 동안 차단하였다. 면역 염색을 위해 평평한 바닥 Tupperware에 젖은 종이 타월을 올려 통합 챔버를 준비하십시오. 24웰 플레이트 뚜껑을 Parafilm으로 덮습니다.가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립 상단에 희석된 항-BrdU 1차 마우스 항체 60마이크로리터를 추가합니다. 또는 항체가 건조되는 것을 줄이고 부피를 줄이려면 희석된 항체 한 방울을 파라필름에 떨어뜨리고 커버 슬립을 뒤집습니다.그런 다음 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 1차 항체를 흡인한다. 커버를 다시 24-웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척한다.앞서 설명한 대로 커버 슬립에 희석된 2차 항체를 추가하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 장착 매체를 경화 또는 경화해야 하는 경우 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 24시간 동안 보관하십시오.0.5 밀리몰 하이드록시우레아로 처리되지 않고 처리된 세포에서 유래된 핵을 염색하고 DAPI 및 IdU 채널에서 식별할 수 있었습니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.IdU 펄스 시간은 더 길거나 더 짧은 배가 기간 동안 변할 수 있으므로 선택한 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 또는 복제 단백질 A에 대해 세포를 조사하여 결과를 확인하고 세포의 다양한 복제 스트레스 반응을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 단일 변형된 DNA의 축적을 검사하기 위해 DNA 손상 유도제와 함께 많은 세포주에 사용됩니다.따라서 이 방법은 널리 접근 가능하고 적용 가능합니다.

quantifying-replication-stress-ovarian-cancer-cells-using-single

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 실시간으로 개인 replisomes하여 DNA 복제를 시각화하기위한 간단한 단일 분자 형광 현미경 기술을 보여줍니다.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을...

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 비디오는 암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 접근 방식을 보여줍니다. 하이드록시우레아(Hydroxyurea) 처리된 세포는 면역형광을 통해 검출되는 단일 가닥 DNA를 생성합니다. 녹색 형광 초점의 수는 암세포의 복제 스트레스 수준을 나타냅니다.

암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 방법

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

본 프로토콜은 환자 유래 난소암 오가노이드에서 DNA 손상 복구 단백질을 평가하는 방법을 설명합니다. 여기에는 포괄적인 도금 및 염색 방법과 상세하고 객관적인 정량 절차가 포함됩니다.

면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

난모세포 게놈 무결성을 유지하는 것은 결과 배아에서 유전적 충실도를 보장하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 포유류 암컷 생식 세포에서 DNA 이중 가닥 절단을 검출하기 위한 정확한 프로토콜을 제시합니다.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

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세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

배우세요 단일 가닥 DNA 면역형광을 사용하여 난소암 세포의 복제 스트레스를 정량화하는 방법을. 이 기법은 고효율·재현성이 높아 대규모 스크리닝에 적합하며, 화학요법 반응 바이오마커 연구에 활용됩니다.

단일 가닥 DNA 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화

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