Name: 소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 소변 유래 세포에서 영장류 유도 만능줄기세포를 생성하고 유지하는 방법을. 비침습적 채취와 Sendai 바이러스 재프로그래밍을 활용하여 다능성을 평가하는 이 프로토콜은 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비침습적 방식으로 얻을 수 있습니다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 추가 논의가 필요합니다. 첫째, 비멸균 소변에서 세포를 분리할 때 오염 위험을 줄이기 위해 광범위한 항균 시약으로 배지를 보충하는 것이 중요합니다. 항생제 사용에도 불구하고 미생물 오염의 증가가 명백 해지면 전체 배양 물을 버리고 해당 지역을 소독하는 것이 좋습니다. 또한, 우리의 경험에 따르면, 지속적인 배양은 건강하게 성장하는 요 세포를 생성하지 않습니다. 둘째, 세포 재프로그래밍을 시작할 때 과잉 밀도로 인한 ...

인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다6,7,8,9,10,11,12,13,14.
iPSC를 생성하려면 다시 프로그래밍할 1차 셀을 획득해야 합니다. 소변에서 분리된 세포는 영장류로부터 비침습적으로 샘플링할 수 있고, 줄기세포와 유사한 분자 프로파일로 인해 쉽게 재프로그래밍할 수 있다는 장점이 있다15. 영장류 iPSC를 유지하기 위한 배양 조건은 재프로그래밍만큼 중요합니다. 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 배양에는 필수 영양소와 배아 줄기 세포(ESC)를 위한 스캐폴드를 제공하는 정의되지 않은 혈청 기반 배지와 마우스 배아 섬유아세포(소위 영양세포)의 공동 배양이 필요했습니다16. 화학적으로 정의되고 피더가 없는 배양 시스템(17,18)의 개발 이후, 현재 상업적으로 이용 가능한 iPSC 배양 배지 및 매트릭스의 다양한 옵션이 있습니다. 그러나 이러한 배양 조건의 대부분은 인간 ESC 및 iPSC에 최적화되어 있으므로 NHP iPSC 배양에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 소변 세포 배양에서 파생된 인간 및 NHP iPSC를 생성하고 유지하기 위한 지침을 제공합니다.
2006년 섬유아세포에서 정의된 인자의 강제 발현에 의한 iPSC 생성이 처음 보고된 이후, 이 방법은 다양한 기원의 다양한 세포 유형에 적용되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. 그 중에서도 소변 유래 세포만 완전히 비침습적으로 얻을 수 있습니다. 앞서 기술한 Zhou et al.33의 프로토콜에 따르면, 광범위한 항생제를 보충함으로써 비멸균 샘플에서도 영장류의 소변에서 세포를 분리하고 확장할 수 있다15. 특히, 이 프로토콜에 의해 샘플링된 소변 유래 세포는 섬유아세포의 기존 재프로그래밍(20-30일, 우리의 경험에서)보다 더 짧은 기간(콜로니가 5-15일 후에 볼 수 있음) 내에 iPSC를 생성할 수 있는 높은 잠재력을 나타내며 충분히 높은 성공률로 나타납니다. 이러한 소변 유래 세포는 중간엽 줄기세포 유사 세포와 방광 상피 세포의 혼합 집단으로 분류되어 높은 재프로그래밍 효율을 일으켰다(15).
1차 셀의 변화 외에도 iPSC를 생성하는 재프로그래밍 방법도 사용 목적에 따라 다릅니다. 인간 체세포에 대한 종래의 재프로그래밍 절차는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 재프로그래밍 인자의 과발현에 의해 수행되었으며, 이는 게놈 5,34,35에서 외인성 DNA의 통합을 허용하였다. 생성된 iPSC를 게놈적으로 온전하게 유지하기 위해 연구자들은 절제 가능한 PiggyBac 벡터 36,37, 에피솜 벡터38,39, 센다이 바이러스 40 및 아데노바이러스 41과 같은 비통합 바이러스 벡터, mRNA 형질감염 42, 단백질 형질감염 43,44 및 화학 화합물 처리 45. 효율성과 취급 용이성으로 인해 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍 벡터가 이 프로토콜에 사용됩니다. 일차 세포의 감염은 플레이팅 전에 5의 감염 다중도(MOI)에서 세포 및 바이러스의 1시간 현탁 배양에서 수행됩니다. 이 변형된 단계는 바이러스가 부착된 세포 배양물에 직접 첨가되는 종래의 방법에 비해 세포 표면과 바이러스 사이의 접촉 가능성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 더 많은 iPSC 콜로니를 생성할 수 있다15.
인간 및 NHP 만능 줄기 세포의 계대는 덩어리 계대증 및 단세포 계대증에 의해 수행될 수 있습니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 칼슘과 마그네슘 이온을 결합하여 카데린과 인테그린의 부착 활성을 방지하는 비용 효율적인 킬레이트제입니다. EDTA는 또한 미분화 세포가 다른 접착 분자로 인해 분화 된 세포보다 먼저 분리되기 때문에 온화하고 선택적인 해리 시약으로 사용됩니다. 완전한 해리는 단백질 키나아제(Rho/Rock) 매개 미오신 과활성화를 포함하는 Rho/Rho 관련 코일 코일을 통해 영장류 iPSC의 대규모 세포 사멸을 유도합니다. 따라서 배양 배지에 Rho/Rock 억제제를 보충하는 것은 현탁액46,47의 단일 세포가 필요한 실험에 필수적입니다. 이 프로토콜에서는 일상적인 패시징 방법으로 덩어리 패시징을 권장하고 정의된 셀 번호의 시딩이 필요한 경우 또는 하위 클로닝 중에 필요한 경우에만 단일 셀 패시징을 권장합니다.

<table><tbody><tr><td>Accumax&trade; 세포 분리 솔루션 (Detachment solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B-Solution</td><td>Merck</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>희석: 1/200</td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 PE 결합 항체&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td><td>희석: 1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&trade; (세포 동결 매체)</td><td>Nippon Genetics</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 멀티 웰 플레이트, 12 웰 CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess &trade; II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>CryoKing&reg; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td><td>다양한 유형의 극저온관을 동결에 사용할 수 있습니다. 2D 바코드 튜브는 샘플 정보를 고유한 튜브 정보와 함께 데이터베이스에 저장할 수 있다는 장점</td></tr>이 있습니다.<tr><td>사이토튠&트레이드; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&trade;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High 포도당</td><td>TH. Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 w L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 고용량 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor&trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor&trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>칼슘 없음 DPBS 마그네슘</td><td>TH. Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM 재조합 Polyclonal Rabbit 항체 (22 HCLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>희석 : 1/500</td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL 원뿔형 바닥</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 mL 원뿔형 바닥</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청, 인증, 열 비활성화, 브라질 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 추출한 663441 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&trade; LDEV-Free, hESC 인증, 감소 성장 인자 기저막 매트릭스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade; 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 240i CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HeraSafe 안전 캐비닛</td><td>Kendro</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF, 프리미엄 등급</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>Fiji</td><td>Version 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 Nikon eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>마우스 안티 알파-스무스 근육 액틴 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1420</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>마우스 안티 베타-III 튜불린 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1195</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1</td><td>STEMCELL Technolgies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>4903S</td><td>희석: 1/400</td></tr><tr><td>Normocure&trade; (항균 시약)</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Rabbit 항체&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2750S</td><td>희석 : 1/400</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토 마이신 (10.000 U / ml) (PS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>페니실린-스트렙토 마이신 혼합물은 100 U / mL 페니실린과 100 &micro를 포함합니다. g/mL 스트렙토마이신.</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 PDGF-AB</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>냉장 벤치탑 원심분리기</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>4-16KS</td><td></td></tr><tr><td>신장 상피 세포 기초 매체</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-030</td><td></td></tr><tr><td>신장 상피 세포 성장 키트</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) 마우스 mAb #4900</td><td>세포 신호 기술</td><td>4900S</td><td>희석: 1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) 마우스 mAb</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>StemFit&reg; Basic02</td><td>Nippon Genetics</td><td>3821.00</td><td>이 배지의 생산은 중단되었으며, 인간 세포주에는 StemFit Basic04CT를 사용하거나 인간이 아닌 영장류에는 StemFit Basic03을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; 효소 선택 (1x), 페놀 레드 없음 (Dissociation enzyme)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath Precision GP 05</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td><td>Biozol</td><td>BYT-ORB153635</td><td></td></tr><tr><td>항체 희석 완충액</td><td></td><td></td><td>조성은 보충 자료를 참조하십시오. 표 S1</td></tr><tr><td>차단 완충액</td><td></td><td></td>: <td>조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오:</td></tr><tr><td>REMC 매체</td><td></td><td></td>, <td>조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오</td></tr><tr><td>: 1차 소변 매체</td><td></td><td></td>, <td>조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오</td></tr>. <tr><td>PSC 배양 배지</td><td></td><td></td>, <td>조성에 대해서는 보충 표 S1</td></tr>, <tr><td>PSC 생성 배지</td>를 참조하십시오.<td></td><td></td><td>구성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오</td></tr>. 소<tr><td>변 세척 완충액</td><td></td><td></td>에 <td>대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오</td></tr></tbody></table>.

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.
소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.

인간 및 NHP 소변에서 세포를 분리할 때 분리 직후 다양한 유형의 세포를 식별할 수 있습니다. 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설됩니다. 여성의 소변은 남성의 소변보다 훨씬 더 많은 편평 세포를 함유하고 있습니다(그림 1B - 0일; 보충 그림 S1). 1차 소변 배지에서 5일 동안 배양한 후 첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있습니다(그림 1A, B - 5일). 이 시점에서, 배지의 절반은 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 REMC 증식 배지로 대체된다. 대략 13일째에, 부착 세포는 계대배양될 수 있는 큰 콜로니로 성장한다(도 1B - 13일째). 이러한 콜로니는 형태학적으로 구별되는 두 가지 세포 유형으로 형성될 수 있는데, 하나는 세포가 밀접하게 부착되어 성장하는 상피와 유사한...

본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

영장류 IPSC는 유용하지만 윤리적 및 기술적 문제로 인해 얻기가 어려운 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 영장류 IPSC의 생성 및 유지에 가장 접근하기 쉬운 경로를 제공합니다. IPSC의 주요 공급원으로 비뇨기 세포를 사용하면 특별한 기술 없이 완전히 비침습적인 방식으로 얻을 수 있기 때문에 큰 이점이 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 Wolfgang M.S.Laboratory의 박사 과정 학생인 Jessica Radmer입니다. 시작하려면 소변이 들어 있는 튜브를 400G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 1 밀리리터를 남기고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.암포테리신을 함유하는 소변 세척 완충액 10밀리리터를 첨가하여 세포를 세척하고 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 조심스럽게 혼합합니다. 원심 분리 후, 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 0.2 밀리리터 미만을 남긴다. 초기에 처리된 소변 50밀리리터당 암포테리신을 함유한 1차 소변 배지 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다.젤라틴을 제거하고, 1 밀리리터의 현탁액을 젤라틴으로 코팅된 12 웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 제조하기 위해, 웰 당 500 마이크로리터의 기저막 매트릭스를 추가한다.접시를 움직여 액체를 분배하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 배양 후 기저막 매트릭스를 900 마이크로 리터의 REMC 배지로 교체하고 사용할 때까지 섭씨 37도에서 보관하십시오. 방정식을 사용하여 5 개의 감염 다중도에 필요한 센다이 바이러스의 양을 계산하십시오.센다이 리프로그래밍 키트의 구성 요소를 섭씨 37도에서 템퍼링된 수조에서 빠르게 해동합니다. 센다이 바이러스의 계산 된 부피를 추가하고 혼합하기 전에 총 100 마이크로 리터의 REMC 배지를 튜브에 첨가하십시오. 원고에 기술된 바와 같이 비뇨기 세포를 해리시킨 후, 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 원하는 수의 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.원심 분리에 의해 펠릿을 얻고, 제조 된 센다이 바이러스 혼합물 100 마이크로 리터에 재현 탁시킨다. 현탁액 감염을 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 기저막 매트릭스가 코팅된 12 웰 플레이트에 파종하기 전에 총 1 밀리리터의 REMC를 첨가한다.형질도입 후, 유도만능줄기세포(IPSC)가 발달할 때까지 배지를 2일마다 교체하고, 5일째에 PSC 생성 배지로 전환하여 콜로니를 생성한다. IPSC 콜로니가 덩어리 계대배양을 위해 충분히 커지면 배양된 세포에서 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 DPBS로 세포를 조심스럽게 세척합니다. DPBS를 제거한 후, 500 마이크로리터의 0.5 밀리몰 EDTA를 웰에 첨가하고, 2 내지 5분 동안 배양한다.콜로니가 분리되기 시작할 때까지 현미경으로 세포를주의 깊게 관찰하십시오. 콜로니의 가장자리가 벗겨지기 시작하고 세포 사이의 틈이 보이게되면 EDTA를 제거하고 조심스럽게 500 마이크로 리터의 DPBS를 첨가하십시오. DPBS를 흡인하고 P-1000 피펫을 사용하여 500마이크로리터의 PSC 배양 배지로 웰을 플러시합니다.콜로니를 적절한 크기의 덩어리로 분산시키기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다. 컨플루언시드, 시딩된 세포의 원하는 밀도 및 IPSC 클론 선호도에 따라, 세포 덩어리 현탁액의 1/10 내지 1/50을 새로운 웰로 옮긴다. 접시를 앞뒤로 여러 번 부드럽게 움직여 덩어리가 우물에 고르게 분포되도록 합니다.덩어리가 부착되도록 섭씨 30도에서 최소 37분 동안 플레이트를 배양합니다. 콜로니가 통과할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 2-3일마다 배지를 교체하십시오. 분리 후, 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설되는 것을 볼 수 있습니다.첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있으며, 이러한 세포는 계대할 수 있는 큰 콜로니로 성장합니다. 두 가지 뚜렷한 세포 유형을 볼 수 있는데, 하나는 상피와 유사한 표현형을 나타내고 다른 하나는 길쭉한 모양을 가진 더 중간엽과 유사한 표현형을 나타냅니다. 첫 번째 통과 후, 비뇨기 세포는 단층으로 자랍니다.IPSC가 생성되는 동안 일부 부착 세포를 볼 수 있으며 이러한 세포는 형태학적 변화를 보이기 시작하여 세포의 재프로그래밍을 나타냅니다. 또한, 콜로니를 형성하는 세포는 전형적인 배아 줄기 세포 형태를 나타낸다. 생성된 모든 IPSC는 명확하게 정의된 가장자리를 가진 촘촘하게 채워진 세포를 특징으로 하는 전형적인 배아 줄기 세포와 유사한 콜로니 형태를 공유합니다.면역세포화학은 고릴라 IPSC에서 만능 관련 마커의 발현을 테스트하는 데 사용되었습니다. 또한, 유세포 분석 결과 분석된 오랑우탄 IPSC가 TRA-1-60에 양성인 것으로 나타났습니다. 또한 고릴라 IPSC는 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로 분화할 수 있습니다.분화된 세포의 수가 증가하고 경계 무결성 및 균일성이 손실되면 IPSC 품질이 좋지 않음을 나타냅니다. 대조적으로, 정의된 경계, 촘촘한 세포 패키징 및 두드러진 핵소체는 고품질 IPSC를 의미합니다. 관상 동맥 가변성으로 인해 영장류 IPSC가 건강하게 성장할 수 있도록 분할 비율, 통과 타이밍 및 덩어리 크기와 같은 클론 특정 조건을 최적화해야 합니다.확립된 IPSC의 품질 관리로서 마커 유전자 발현을 확인하는 것 외에도 in vitro EV 분화와 같은 직접 또는 간접 분화 유도를 통해 사전 효능을 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍  을 수반합니다.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.

피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

배우세요 소변 유래 세포에서 영장류 유도 만능줄기세포를 생성하고 유지하는 방법을. 비침습적 채취와 Sendai 바이러스 재프로그래밍을 활용하여 다능성을 평가하는 이 프로토콜은 재생의학 연구에 활용됩니다.

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

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