짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

이 프로토콜은 비오티닐화 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 추출물에서 단백질 결합 파트너를 추출하여 알려진 RNA 서열의 단백질 결합 파트너를 식별할 수 있도록 합니다. RNA에서 단백질을 분리하기 위해 세제 또는 고온이 필요한 방법과 비교할 때, 이러한 프로토콜은 잠재적 인 단백질 복합체를 보존 할 수있는 매우 온화한 조건을 대신 사용합니다. 절차를 시연하는 것은 제 규정에 따라 박사 과정 학생인 Jakob Rupert가 될 것입니다.

HEK 293T 세포 플레이트의 웰로부터 배지를 제거함으로써 총 단백질 수확을 시작하고, 6개의 웰 플레이트의 웰을 1밀리리터의 PBS로 세척한다. PBS를 버리고 플레이트를 얼음으로 옮긴 후 200마이크로리터의 용해 완충액을 각 웰에 첨가합니다. 두 개의 웰에서 추출한 세포 추출물을 동일한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리하고 분해합니다.

얼음 및 원심 분리에서 30 분 동안 배양 한 후, 상청액을 사전 냉각 된 튜브로 옮긴다. 다음으로, 1.5 밀리그램의 단백질에 해당하는 단백질 추출물의 부피를 계산하십시오. 그런 다음 용해 완충액을 사용하여 모든 샘플을 600마이크로리터의 최종 부피로 가져옵니다.

사용할 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 비드를 준비하려면 튜브를 튕겨 저장 버퍼에 혼합합니다. 샘플 당 100 마이크로 리터의 슬러리 매체를 계산 한 후 계산 된 슬러리 부피를 자기 랙에 넣습니다.

비드를 세척하려면 저장 용액을 제거하고 1밀리리터의 용해 완충액을 첨가하고 수동으로 뒤집어 비드를 세척합니다. 그런 다음 마그네틱 랙을 사용하여 버퍼를 제거하고 세척 단계를 반복합니다. 비드에 슬러리 배지의 초기 부피와 동일한 부피의 용해 완충액을 추가하고 샘플만큼 많은 1.5 밀리리터 튜브에 배지를 균일하게 분배하기 전에 튜브를 튕겨 혼합합니다.

비드 블로킹을 위해, 마그네틱 랙을 사용하여 완충액을 제거하고, 용해 완충액에서 제조된 효모 TRNA 용액의 밀리리터당 0.25 밀리그램의 600 마이크로리터를 첨가한다. 회전하는 바퀴에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 600마이크로리터의 용해 완충액을 추가하기 전에 마그네틱 랙을 사용하여 TRNA 용액을 제거하고 수동으로 혼합하여 세척합니다.

세척 단계를 반복하고 버퍼를 버립니다. 초기 100 마이크로리터의 슬러리 배지를 함유하는 각각의 튜브에 대해, 600 마이크로리터의 용해 완충액에 200 마이크로그램의 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 올리고를 비드에 넣고 회전하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

비드로부터 용액을 제거하고, 실온에서 각각 5분 동안 튜브를 회전시킴으로써 600 마이크로리터의 용해 완충액으로 2회 세척한다. 버퍼를 삭제합니다. 비드에 대한 단백질 결합의 경우 600마이크로리터 단백질 용액에서 부피의 5% 또는 30마이크로리터를 분리하고 추가 분석을 위해 입력 또는 IN으로 유지합니다.

나머지 단백질 혼합물을 로드된 비드의 각 튜브에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 천천히 회전하면서 배양합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 비드에서 결합되지 않은 단백질 분획을 제거합니다. 부피의 5% 또는 30마이크로리터를 절약하고 흐름을 통해 또는 FT라고 표시합니다. 세척 버퍼 1 1밀리리터를 비드에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시킵니다.

버퍼를 버리고 이 세척을 한 번 반복합니다. 비드에 세척 버퍼 2 1밀리리터를 추가합니다. 그리고 회전자에서 섭씨 4도에서 5분 동안 배양한 후 상층액을 버립니다.

특정 결합제를 용리하기 위해, 100 마이크로리터의 용출 완충액 1을 비드에 첨가한다. 플릭으로 수동으로 혼합한 후 실온에서 5분간 배양한다. 튜브를 열 믹서에 넣고 섭씨 95도에서 5분 동안 세게 흔듭니다.

그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 용출된 분획을 깨끗한 튜브에 수집합니다. 완료되면 벤치 원심분리기로 비드를 빠르게 회전시켜 용리액의 회수율을 극대화합니다. 그리고 추가 분석을 위해 총 용리액 또는 EL 부피의 5% 또는 5마이크로리터를 절약할 수 있습니다.

용출된 단백질은 질량분석법으로 확인하였다. 화산 플롯에서 상당히 농축된 단백질을 플로팅한 결과, 총 단백질 함량과 RNA에서 용출된 농축 단백질이 RNA보다 훨씬 더 높았으며, 이는 RNA가 더 많은 수의 특정 상호작용을 확립할 수 있음을 시사합니다. 예측된 결과와 얻은 결과 사이의 일치의 예로서, 인간 프로테옴의 단백질과 플러스 RNA 및 마이너스 RNA에 대한 상호작용 점수는 HNRNPH3가 플러스 RNA에 선택적으로 결합하고 PCBP2가 RNA와 특이적으로 상호작용할 것으로 예측되었음을 보여주었습니다.

또한, 단백질 RBM41은 두 RNA 올리고뉴클레오티드 모두에 대해 난잡한 것으로 예측되었다. 단백질 풀다운 분석 샘플의 질량 분광법 분석은 RNA에서 HNRNPH3의 존재와 마이너스 RNA에서 PCBP2의 존재를 확인했습니다. RBM41은 둘 다와 상호 작용하는 것으로 밝혀졌습니다.

웨스턴 블롯은 결과 및 프로토콜 최적화 단계에서 TDP-43의 존재를 검출하기 위해 사용되었다. RNA에서 TDP-43은 입력 샘플과 용출액에서 관찰되어 처음부터 존재함을 나타냅니다. TDP-43은 세척 단계 동안 RNA에 의해 유지되었고, 마지막에 고염 완충액으로 용출되었다.

단백질 RNA 상호작용을 매핑함으로써 이 방법은 많은 생리학적 경로 뒤에 있는 거대분자 네트워크를 밝힐 수 있습니다. 예를 들어, 전사 조절 또는 암 및 신경변성을 포함하는 병리학적 기전.