Name: 연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 정량 평가하는 방법을 광학, 투과전자, 공초점 현미경을 활용하여. 이 프로토콜은 연령 관련 황반변성 연구에 필수적인 정량적 데이터를 제공합니다.

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저자는 광학 현미경 검사를 위해 조직을 준비한 Satoshi Kinoshita와 University of Wisconsin(UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory(TRIP)에 감사드립니다. 이 핵심은 UW 병리학 및 진단검사의학과, 위스콘신 대학교 카본 암 센터(P30 CA014520) 및 NIH 국장실(S10OD023526)의 지원을 받습니다. 컨포칼 현미경은 UW Department of Biochemistry Endowment의 지원으로 설립된 UW Biochemistry Optical Core에서 수행되었습니다. 이 작업은 또한 국립 안과 연구소 (R01EY022086 to A. Ikeda; R01EY031748에서 C. Bowes Rickman에게; P30EY016665 UW의 안과 및 시각 과학과에; P30EY005722 듀크 아이 센터로; NIH T32EY027721에서 M. Landowski에게; F32EY032766 to M. Landowski), Timothy William Trout 회장직 (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); 실명 예방 연구(Duke Eye Center)의 무제한 보조금.

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<li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-topographic+maps+for+regionally+enhanced+analysis+of+visual+space+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).</li>
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</ol>

이 프로토콜의 작성자는 공개 및 이해 상충이 없습니다.

이 기사에서는 마우스 모델의 구조적 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 소개했습니다. 우리는 빛, 투과 전자 및 컨포칼 현미경을 포함한 다양한 이미징 기술을 위해 눈을 처리하는 데 필요한 단계와 이러한 이미징 방법을 통해 관찰되는 일반적인 병리의 정량화에 대해 설명했습니다. 우리는 Tmem135 TG 및 24개월 된 WT 마우스를 검사하여 RPE 표현형 프로토콜의 효과를 입증했는데, 이 마우스는 RPE 병리30,31,32를 나타내기 때문입니다. 이 프로토콜은 BLamD6,7뿐만 아니라 RPE 얇아짐, 공포화, 이동 및 이형성과 같은 RPE 병리를 가질 수 있는 유전자 변형 또는 약리학적으로 처리된 모든 마우스에 적용할...

연령 관련 황반변성(AMD)은 55세 이상의 인구에게 영향을 미치는 흔한 실명 질환입니다1. 많은 연구자들은 망막 색소 상피(RPE) 내의 기능 장애가 AMD2의 초기이자 중요한 병리생물학적 사건이라고 믿습니다. RPE는 인접한 광수용체와 맥락막 혈관의 항상성을 유지하는 역할을 하는 분극 세포의 단층이다3. 세포 배양 모델 4,5 및 마우스 6,7,8을 포함하여 RPE 내에서 질병 관련 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 모델이 존재합니다. 최근 보고서에서는 RPE 세포 배양 모델4에 대한 표준화된 프로토콜과 품질 관리 기준을 설명했지만, 마우스 모델에서 RPE의 표현형을 표준화하려는 시도는 없었다. 사실, AMD의 마우스 모델에 대한 많은 출판물에는 RPE에 대한 완전한 설명이나 RPE 병리의 정량화가 부족합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 AMD 마우스 모델을 사용하는 과학자들을 위해 편견 없는 정량적 평가와 함께 표준 RPE 표현형 분석 방법을 제시하는 것입니다.
이전 간행물에서는 세 가지 이미징 기술을 통해 마우스에서 여러 RPE 병리의 존재에 주목했습니다. 예를 들어, 연구자들은 광학 현미경을 통해 쥐 망막의 전체적인 형태를 볼 수 있으며(그림 1A) RPE 얇아짐, 공포화 및 이동과 같은 RPE 병리를 감지할 수 있습니다. AMD 마우스 모델의 RPE 얇아짐은 해당 컨트롤에서 RPE 높이의 편차로 예시됩니다(그림 1B). RPE vacuolization은 미세 vacuolization (그림 1C)과 macrovacuolization (그림 1D)의 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. RPE 미세 공화는 전체 높이에 영향을 미치지 않는 RPE의 액포의 존재로 요약되는 반면, 거대 공화는 광 수용체의 바깥 부분으로 돌출 된 액포의 존재로 표시됩니다. RPE 이동은 망막 단면에서 RPE 단층 위의 색소의 초점 응집체로 구별됩니다(그림 1E). AMD 공여자의 눈에서 이동하는 RPE 세포는 분화 클러스터 68 (CD68)9과 같은 면역 세포 마커에 대한 면역반응성을 나타내며, RPE 파편을 삼키는 면역 세포 또는 형질전환9을 겪고 있는 RPE를 나타낼 수 있다는 점에 유의해야 한다. 투과 전자 현미경이라고 하는 또 다른 이미징 기술을 통해 연구자들은 RPE와 기저막의 미세 구조를 시각화할 수 있습니다(그림 2A). 이 기술은 기저 층류 퇴적물(BLamD)로 알려진 마우스의 우세한 하위 RPE 침전물을 식별할 수 있습니다(그림 2B)10. 마지막으로, 컨포칼 현미경은 이미징 RPE 플랫 마운트를 통해 RPE 세포의 구조를 밝힐 수 있습니다(그림 3A). 이 방법은 RPE가 고전적인 벌집 모양에서 벗어난 RPE 이형성을 밝힐 수 있습니다(그림 3B). 또한 RPE 세포 내에 3개 이상의 핵이 존재하는 RPE 다핵형성을 감지할 수 있습니다(그림 3C). 현재 AMD 마우스 모델에 존재하는 RPE 병리의 유형에 대한 요약을 위해, 본 발명자들은 문헌 6,7의 이러한 문헌을 참조한다.
AMD를 연구하는 연구원은 표현형 프로토콜 이전에 RPE 병리를 조사하기 위해 마우스를 사용하는 것의 장점과 단점을 알고 있어야 합니다. 마우스는 상대적으로 짧은 수명과 비용 효율성, 유전적 및 약리학적 조작 가능성 때문에 유리합니다. 마우스는 또한 AMD 기증자 눈 11,12,13,14,15,16,17에서 관찰되는 RPE 이동, 이형성 및 다핵 형성을 포함한 RPE 퇴행성 변화를 나타냅니다. 이것은 유사한 메커니즘이 생쥐와 인간에서 이러한 RPE 병리의 발달의 기초가 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 마우스 연구의 번역 가능성을 인간 AMD로 제한하는 주요 차이점이 있습니다. 첫째, 마우스는 AMD에서 우선적으로 영향을 받는 시력에 필요한 인간 망막의 해부학적으로 구별되는 영역인 황반을 가지고 있지 않습니다. 둘째, 생쥐의 RPE 희석 및 공포화와 같은 일부 RPE 병리는 일반적으로 AMD 기증자의 눈에서 나타나지 않는다18. 셋째, 생쥐는 AMD 병리의 특징인 드루젠(drusen)을 발달시키지 않는다19. 드루젠은 RPE 기저층과 Bruch 막(BrM)의 내부 콜라겐 층 사이에 형성되는 기저막 단백질이 거의 없는 지질 및 단백질 함유 침전물입니다19. Drusen은 생쥐의 일반적인 하위 RPE 침전물인 BLamD와 구성과 해부학적 위치 모두에서 다릅니다. BLamD는 BrM의 RPE 기저층과 RPE20의 기저 접힘 사이에 형성되는 연령 및 스트레스 의존적 세포외 기질 풍부 이상입니다. 흥미롭게도, BLamD는 생쥐와 인간 모두에서 유사한 단백질 조성과 외관을 가지고 있다 6,10,21. 최근 연구에 따르면 BLamD는 AMD의 후기 단계로의 진행에 영향을 미침으로써 AMD의 병리학에서 작용할 수 있습니다18,22; 따라서 이러한 침전물은 마우스 망막에서 병든 RPE를 나타낼 수 있습니다. 이러한 이점과 한계에 대한 지식은 마우스 연구의 결과를 AMD로 번역하는 데 관심이 있는 연구자에게 매우 중요합니다.
이 프로토콜에서는 RPE 병리를 시각화하기 위해 빛, 투과 전자 및 컨포칼 현미경에 대해 눈을 준비하는 방법에 대해 논의합니다. 또한 통계적 테스트를 위해 편향되지 않은 방식으로 RPE 병리를 정량화하는 방법을 설명합니다. 개념 증명으로 우리는 RPE 표현형 프로토콜을 사용하여 막횡단 단백질 135-(Tmem135) 과발현 마우스와 노화된 야생형(WT) C57BL/6J 마우스에서 관찰된 구조적 RPE 병리를 조사합니다. 요약하면, 현재 사용 가능한 표준 프로토콜이 없기 때문에 AMD 마우스 모델에서 RPE를 특성화하기 위한 표현형 방법론을 설명하는 것을 목표로 합니다. AMD 마우스 모델에서도 영향을 받는 광수용체 또는 맥락막의 병리를 검사하고 정량화하는 데 관심이 있는 연구원은 이 프로토콜이 연구에 유용하지 않을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 M 카코딜레이트 완충액 pH7.2</td><td>PolyScientiifc R& D Company</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 용량 슬라이드 박스</td><td></td><td></td><td>이 프로토콜에는 두 개가 필요합니다(하나는 H& E-스테인드 슬라이드와 RPE 플랫 마운트용 슬라이드)</td></tr><tr><td>100% 에탄올&nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>는 이 프로토콜에서 희석된 에탄올 용액을 만드는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td></td><td></td> <td>이 프로토콜에서는 사전 제작된 1x PBS를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2.0mL 마이크로튜브</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 캐비티 임베딩 캡슐 대체 금형</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>24인치 PVC 튜브(루어 엔드 포함</td><td>) Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 메쉬 길더 얇은 막대 사각 메쉬 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>MDS 창고</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>방수 수분 장벽이 있는 흡수성 언더패드 (23 인치 by 24 인치)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>조절 가능한 237 ml&nbsp; 스프레이 병</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 복합 당나귀 안티-래빗 IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 정밀 글라이드 19 게이지 주사기 바늘</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z192546</tr><tr><td>고사리 집게; 곡선; 미세한 십자가 톱니; 4" 길이, 1mm 팁 너비</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5211</td><td>이 프로토콜에서는 곡선 겸자로 알려져 있습니다.</td></tr><tr><td>낙타 털 브러시</td><td>전자 현미경 과학</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 안락사 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 유량계</td><td></td><td></td><td></td></tr> 이<tr><td>산화탄소 탱크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castaloy 프롱 확장 클램프</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>주철 L자형 베이스 지지 스탠드</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>세포 증식 프로그램</td><td></td><td></td><td>다운로드 가능: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost Microscope Slides Lavender</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>이 프로토콜에는 Milli-Q 정제 시스템의</td> <td>증류된 H20</td><td></td><td></td> 물이 사용되었습니다.</tr><tr><td>Dumont 얇은 팁 핀셋; 패턴 #55</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-4984</td><td>이 프로토콜에서는 끝이 가는 집게로 알려져 있으며 이 프로토콜에는 3개가 필요합니다(해부용 2개, 전자 현미경 처리용 1개).</td></tr><tr><td>전자 현미경 그리드 홀더</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 수지</td><td>전자 현미경 과학</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It 조직 마킹 옐로우 염료</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22050460</td><td>이 조직 표시 염료를 사용할 때는 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>Epredia 마운팅 미디어</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>H 장착에 사용 & E 슬라이드.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series, 150 w 할로겐 광원</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td><td>현미경 해부용 광원.</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 프로그램</td><td></td><td></td><td>다운로드 가능: https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Flexaframe Castaloy Hook Connector</td><td>Thermo Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액의 흄 후드</td><td></td><td></td> 글루타르알데히드 2.5%, pH 7.4, 32% 전자 현미경 과학 16537-05 <td></td></tr><tr><td>JEM-1400 투과 전자 현미경(JEOL) ORIUS(1000) CCD 카메라</td><td></td><td></td><td></td></tr> 실험실 <tr><td></td> 벤치탑 셰이커 포함 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>이 실험에는 두 가지가 필요합니다. 하나는 실온에 있어야 하고 다른 하나는 섭씨 4도의 냉장실에 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>레이저 극저온 태그 라벨</td><td>전자 현미경 과학</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>리드 시트레이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>라이카 EM UC7초박 라이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>카 라이커트 울트라컷 S 마이크로톰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>리프터슬립스</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>22X22I24788001LS</td><td>RPE 플랫 마운트에는 가장자리가 돌출되어 있고 RPE의 두께를 수용할 수 있으므로 이 커버슬립을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 마이크로 해부 스프링 가위</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5600</td><td>프로토콜에서 마이크로 해부 가위로 알려져 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td></td><td></td>: <td>모든 AMD 마우스 모델 및 해당 컨트롤이 이 프로토콜에 대해 작동할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위; 표준 버전; 곡선; 날카로운 점; 24mm 블레이드 길이; 4.5" 전체 길이</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5913</td><td>이 프로토콜에서는 곡선 가위로 알려져 있습니다.</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브 랙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1RS 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Number 11 멸균 일회용 메스 블레이드</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 32%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>연필</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-ZO-1 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>20412</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>마우스 관류</td><td></td><td></td><td></td>용 얕은 트레이</tr><tr><td>Shandon Eosin Y Alcoholic</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker</td><td>Staples</td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>Staining</td><td>Grainger</td><td>49WF31</td><td></td></tr><tr><td>스퀘어 커버 유리 슬립</td>용 슬라이드 랙 <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>커버</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td> 얼룩 접시 <td>H 용 15 필요& E 염색 절차.</td></tr><tr><td>타겟 올 플라스틱 일회용 루어슬립 50 mL 주사기&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>S7510-50</td><td>주사기 배럴만 사용하십시오.</td></tr><tr><td>타이머</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 장착 Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>RPE 플랫 마운트 장착에 사용합니다.</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>22050283</tr><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 광학 현미경</td><td></td><td></td><td>이 현미경은 스티칭된 20x 이미지를 생성할 수 있습니다. 광학 현미경이 이러한 용량을 가지고 있지 않으면 서로 약간 겹치는 전체 망막의 이미지를 촬영하십시오. Adobe Photoshop을 사용하여 이러한 이미지를 함께 연결합니다. 이미지 스티칭에 대해서는 Adobe Photoshop 프로그램의 설명서를 참조하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 해부 현미경</td><td>전자 현미경 과학</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

연령 관련 황반변성(AMD)은 고령화 인구에서 쇠약하게 만드는 망막 장애입니다. 망막 색소 상피(RPE)의 기능 장애는 AMD의 주요 병리학적 사건으로 널리 알려져 있습니다. RPE 기능 장애로 이어지는 메커니즘을 이해하기 위해 연구자들은 마우스 모델을 활용할 수 있습니다. 이전 연구에 의해 마우스가 RPE 병리를 일으킬 수 있다는 것이 확인되었으며, 그 중 일부는 AMD 진단을 받은 개인의 눈에서 관찰됩니다. 여기에서는 마우스의 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 광학 현미경 및 투과 전자 현미경을 사용한 망막 단면의 준비 및 평가와 컨포칼 현미경에 의한 RPE 플랫 마운트의 준비 및 평가가 포함됩니다. 우리는 이러한 기술에 의해 관찰되는 쥐 RPE 병리의 일반적인 유형과 통계적 테스트를 위한 편견 없는 방법을 통해 이를 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 개념 증명으로 이 RPE 표현형 프로토콜을 사용하여 막횡단 단백질 135(Tmem135)를 과발현하는 마우스와 노화된 야생형 C57BL/6J 마우스에서 관찰된 RPE 병리를 정량화합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 AMD의 마우스 모델을 사용하는 과학자들을 위한 편견 없는 정량적 평가와 함께 표준 RPE 표현형 방법을 제시하는 것입니다.

이 기사에 설명된 RPE 표현형 프로토콜의 완성은 AMD의 마우스 모델에서 일반적으로 관찰되는 구조적 RPE 이상에 대한 정량적 분석을 제공합니다. 이 프로토콜의 효과를 확인하기 위해 우리는 닭 베타-액틴 프로모터(Tmem135 TG)30 및 노화된 C57BL/6J 마우스31,32에 의해 구동되는 WT Tmem135를 과발현하는 형질전환 마우스를 포함하여 RPE 병리를 나타내는 것으로 알려진 마우스에 사용했습니다. 이 실험의 목적은 마우스 모델을 처음 접하는 연구자에게 이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 결과를 보여주는 것입니다.
우리는 광학 현미경을 사용하여 RPE 병리를 평가하기 위해 WT 및 Tmem135 TG 마우스의 눈을 처리하고 평가하기 위해 프로토콜...

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

이 프로토콜은 광 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 RP 병리에 대한 마우스 크기를 처리하고 평가하는 방법을 설명하는 최초의 프로토콜입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 통계적 비교를 위해 이 세 가지 이미징 기술을 사용하여 RP 병리의 정량적 평가를 포함한다는 것입니다. 이 프로토콜에 설명된 기술은 또한 RPE 건강에 중요한 분자 경로에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다.이전에 마우스 크기를 해부하지 않은 개인은 이 프로토콜에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 이러한 개인이 이 프로토콜에 설명된 기술을 마스터하기 위해 일부 마우스로 연습할 것을 제안합니다. 시작하려면 흄 후드의 심장 관류를 위한 흡수성 언더패드에 중력 공급 관류 시스템을 준비합니다.갓 준비한 고정 완충액 40ml를 관류 시스템의 주사기 배럴에 붓습니다. 버퍼가 튜빙 라인을 통해 흐를 수 있도록 밸브를 튜빙 라인과 평행하게 돌립니다. 라인에서 모든 기포가 제거될 때까지 라인을 세척합니다.그런 다음 밸브를 튜빙 라인에 수직으로 돌려 버퍼가 튜빙 라인으로 흐르는 것을 막습니다. 심장 관류를 수행하려면 안락사 된 마우스를 관류 시스템 근처의 얕은 트레이로 옮깁니다. 복부가 위를 향하게.복부에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 구부러진 가위와 집게를 사용하여 흉곽 아래 마우스 왼쪽의 피부와 복벽을 통해 5cm 하부 절단을 만듭니다. 하부 절개 상단의 피부와 복벽을 통해 3 센티미터의 내측 절개를 진행하십시오. 흉곽 아래 마우스의 가장 오른쪽에 있는 피부와 복벽을 통해 내측 절개 끝에서 5cm 더 하부 절개를 합니다.구부러진 집게로 복부 피부 플랩을 제거하기 위해 또 다른 3cm 내측 절개를하십시오. 다음으로 횡격막과 흉골을 잘라 심장을 노출시킵니다. 게이지 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 밸브를 돌립니다.구부러진 가위로 우심방을 잘라 혈액과 고정제가 심장에서 빠져 나갈 수 있도록합니다. 10 밀리리터의 고정 완충액을 1-2 분 동안 또는 간이 옅은 색으로 변하고 우심방에서 혈액이 흘러 나오지 않을 때까지 마우스를 관류시킵니다. 관류가 완료되면 밸브를 튜빙 라인에 수직으로 돌려 버퍼 흐름을 중지합니다.눈을 핵으로 만들려면 얕은 트레이에서 마우스를 꺼내 흄 후드의 흡수성 언더 패드에 놓습니다. 그런 다음 왼쪽 눈이 실험자를 향하고 오른쪽 눈이 보이지 않도록 마우스의 머리 방향을 지정합니다. 눈의 위쪽에 티슈 마킹 염료로 주석을 답니다.엄지와 검지로 눈구멍 주위를 부드럽게 눌러 눈구멍에서 눈이 튀어나오도록 합니다. 그런 다음 구부러진 가위를 사용하여 칼날로 눈 소켓에서 30도 각도로 눈을 잡고 눈 주위를 자릅니다. 구부러진 집게로 머리에서 안구를 제거하고 흡수성 언더 패드에 놓습니다.11번 메스 날로 각막에 닉을 꽂고 구부러진 집게가 있는 눈을 2밀리리터의 고정 완충액이 들어 있는 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 양쪽 눈을 핵으로 만든 후 4도 방의 셰이커에서 75rpm의 속도로 하룻밤 동안 고정 완충액에서 배양합니다. 다음날, 고정 완충액을 2밀리리터의 PBS로 교체하고, 실온 및 75 rpm에서 쉐이커 상에서 10분 동안 인큐베이션한다.다음으로 후방 세그먼트를 생성하기 위해 해부 현미경으로 PBS로 채워진 페트리 접시에 눈을 놓습니다. 끝이 가는 집게로 안구에서 지방과 근육을 부드럽게 들어 올립니다. 안구가 균일한 청흑색이 될 때까지 미세 해부 가위로 안구와 평행 방향으로 지방과 근육을 조심스럽게 다듬습니다. 끝이 가는 집게를 각막 천자 부위에 놓고 미세 해부 가위로 천자 부위부터 각막 주변을 잘라 안구에서 각막과 홍채를 제거합니다.그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 안구에서 수정체를 부드럽게 제거하여 뒤쪽 부분을 만듭니다. 뒤쪽 세그먼트를 2밀리리터 PBS가 들어 있는 튜브에 넣고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 냉장고에 보관하십시오. PBS가 들어 있는 페트리 접시에 눈을 옮기고 그림과 같이 각막과 홍채를 제거합니다.끝이 가는 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다. 그런 다음 두 개의 미세한 집게를 사용하여 신경 망막을 뒤쪽 부분에서 부드럽게 분리합니다. 후방 안구 컵에서 제거하기 위해 시신경 머리에서 신경 망막을 조심스럽게 자릅니다.아이컵을 5마이크로리터의 PBS가 들어 있는 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 후방 아이컵을 고정하려면 500마이크로리터의 메탄올을 조직에 넣고 75rpm의 셰이커에서 5분 동안 배양합니다. 메탄올 고정을 3회 반복하여 2시간 동안 최종 인큐베이션합니다.고정 후 PBS로 조직을 세 번 세척한 후 면역형광염색을 진행하고 공초점 현미경을 통해 시각화합니다. 4개월령 TMEM 135 TG 마우스는 연령 일치 야생형 마우스에 비해 시신경으로부터 600 및 900 마이크로미터 떨어진 곳에서 망막 색소 상피 또는 RPE 두께의 현저한 감소를 보였다. 미세혈관 형성, 거대 혈관 화 및 325 일 된 WT 및 TMEM 135 TG 마우스의 이동을 포함한 RPE 병리의 사건을 계산했습니다.RPE 미세 공포화의 평균 빈도는 TMEM 135 TG 마우스에 비해 야생형에서 더 낮았다. TMEM 135 TG 마우스에서 관찰된 평균값과 비교하여 야생형에서 RPE macrovacuolization 및 이동이 검출되지 않았습니다. 투과 전자 현미경 검사에서, 2 개월 된 망막에는 없었던 24 개월 된 망막에서 기저 층류 침전물이 관찰되었다.기저층 퇴적물 높이의 누적 빈도를 분석한 결과, 24개월 된 마우스에 비해 24개월 된 마우스의 선이 오른쪽으로 이동하는 것으로 나타났으며, 이는 24개월 된 마우스의 침전물 증가를 보여줍니다. 이 관찰은 24개월 된 망막의 더 큰 평균 높이에 의해 뒷받침되었습니다. 4개월령 TMEM 135 TG 마우스의 RPE는 이형성이었다.TMEM 135 TG 망막의 RPE는 연령 일치 야생형 망막보다 크고 밀도가 낮습니다. 또한, 대조군에 비해 TG 망막에서 더 많은 다핵 RPE 세포가 관찰되었습니다. 이 프로토콜에 따라 연구자들은 생쥐에서 분자 생물학 기술을 사용하여 특정 경로를 평가할 수 있으며, 이는 생쥐에서 이러한 RP 병리가 어떻게 발생하는지에 대한 우리의 이해에 기여할 수 있습니다.이 프로토콜은 마우스의 RP 표현형을 표준화하는 데 도움이 되며, 이는 마우스 연구 결과를 다른 AMD 모델로 변환하고 AMD 병태생물학에 대한 이해를 돕습니다.

a-protocol-to-evaluate-quantify-retinal-pigmented-epithelium

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

꼬리 정맥 주입에 의해 수행 인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술 (ICGA 나)는 마우스 맥락막 이상을 특성화하기 위해 고품질의 ICGA 시간 코스의 이미지를 제공합니다.

시간 코스 인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술로 연령 관련 황반 변성의 마우스 모델에서 맥락막 혈관의 이상을 검출

여기서, 우리는 2000년대 초에 Marmorstein, 복숭아 및 동료에 의해 처음 기술된 DC-ERGs로 알려져 있는 기술을 사용하여 마우스에서 망막 안료 상피(RPE)의 광유발 전기 반응을 기록하는 방법을 제시한다.

마우스 망막 안료 상피의 빛 방출 전기 응답 기록을 위한 직접 결합 된 전기 전체노그램 (DC-ERG)

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

우리는 인간의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE)를 효율적으로 분리하고 RPE의 조직 학적 및 형태 측정 분석을 위해 전체 RPE / 맥락막 플랫 마운트를 생성하는 방법을 설명합니다.

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

탠덤 접합 이벤트는 뉴클레오티드가 12개 미만으로 떨어져 있는 부위에서 발생합니다. 이러한 스플라이스 변형체의 비율을 정량화하는 것은 절대 정량적 PCR 접근법을 사용하여 가능합니다. 이 원고는 두 개의 스플라이싱 이벤트로 인해 Serine-701 포함/배제 및 α/β C-말단이 발생하는 STAT3 유전자의 스플라이스 변이체를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

배우세요 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 정량 평가하는 방법을 광학, 투과전자, 공초점 현미경을 활용하여. 이 프로토콜은 연령 관련 황반변성 연구에 필수적인 정량적 데이터를 제공합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

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